A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

요약

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Β-아 밀 로이드 (Aβ)은 자체 집계로 조립 하는 본질적인 추세를 가진 소수 성 펩 티 드 이다. 다양 한 집계 중 Aβ 올리고 머 최고의 neurotoxin Alzheimer의 질병 (광고)의 진행으로 널리 인정 하 고 광고의 병 인에 중요 한 이벤트로 간주 됩니다. 따라서, Aβ 올리고 머 저 해제 수 neurodegeneration을 방지 하 고 수정 하는 질병으로 발전 될 가능성이 광고의 치료. 그러나, 다른 대형 프로토콜 Aβ 올리고 머의 다른 특성을 가진 올리고 발생할 수 있습니다. 또한, 효과적으로 화면 Aβ_1-42 올리고 머 억제제를 많은 방법이 되지 있다. A11 항 체는 항 병렬 β 장 구조와 독성 Aβ_1-42 올리고 머의 하위 집합으로 반응 수 있습니다. 이 프로토콜에는 합성 Aβ_1-42 펩 티 드에서 에 체 외에서 A11-긍정적인 Aβ_1-42 올리고 머-풍부한 예제를 준비 하 고 도트 blotting에 의해 상대적 양의 샘플에서 A11-긍정적인 Aβ_1-42 올리고 머를 평가 하는 방법 설명 A11 Aβ_1-42를 사용 하 여 분석-특정 6E10 항 체. 이 프로토콜을 사용 하 여, 억제제 A11-긍정적인 Aβ_1-42 올리고 머의 수 또한 상영 반 정량적 실험 결과에서.

서문

Alzheimer의 질병 (광고) 노인 전세계¹에 영향을 미치는 가장 중요 한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 그것은 널리 β 아 밀 로이드 (Aβ)의 비정상적인 집계 광고의 주요 병 적인 요인이 될 수 있습니다 허용 됩니다. Aβ 집계 광고 환자의 두뇌에서 생물 학적 마커 중 치 패의 주요 구성 요소는. 또한, Aβ 집계, 특히 올리고 포함 하 여 광고 진행으로 신경 죽음의 원인이 될 수 있습니다 강력한 neurotoxicity 생산. 따라서, Aβ 올리고 머 형성의 저해 되지 않도록 neurodegeneration, 그리고 Aβ 올리고 머 저 해제 수정 하는 질병으로 발전 될 수 있는 광고의 치료. 많은 연구 올리고 시험관을 형성, 형태학 및 인공 Aβ 올리고의 구조를 탐구 하 고 생체 외에서 모델^2,3 를 사용 하 여 Aβ 올리고 머의 억제제를 조사 하는 합성 Aβ 펩 티 드를 사용 ^{, 그러나 4}., Aβ 올리고 머의 형성 프로토콜 다른 시험관에 다른 연구 그룹 사이에서 비교할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다 다른 형태학 상 특성을 가진 올리고 머를 발생할 수 있습니다. 따라서, Aβ 올리고 머에 대 한 표준 형성 프로토콜 절실히 필요 합니다.

지금까지 많은 방법은 직접 검색 Aβ 올리고 보고 되었습니다. 전송 전자 현미경 (TEM), 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 및 점 분석 blotting 사용할 수 있습니다 금액 또는 Aβ 올리고 머 생체 외에서^5, 의 형태를 검사 하 ⁶. 예를 들어 Aβ 올리고 머의 구조와 형태 TEM에서 관찰 될 수 있다. Aβ 집계의 분자 크기 및 상대 금액 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법에 의해 측정 될 수 있는. ELISA 혈 청, 플라스마, 및 뇌 조직에서 추출 물에서 Aβ 올리고 머를 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로, 분석, 검색, 사용 되는 기술 blotting 점 분석 및 단백질, 식별 사용할 수 올리고 머 및 Aβ 관련 항 체의 도움으로 다른 샘플 올리고 머 Aβ의 상대 농도 평가 하. 또한, 분석 결과 더 럽 히는 점이 젤 전기 이동 법 및 젤에 대 한 더 럽 히 절차 필요 하지 않습니다 상당한 시간 절약을 제공 합니다. 따라서,이 분석 결과 화면 잠재적인 Aβ 올리고 머 억제제를 일반적으로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표 분석, blotting 점으로 화면 Aβ 올리고 머를 Aβ_1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 Aβ_1-42 올리고 머 풍부한 샘플 준비 하 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현성 메서드를 설명 하는 억제제 반 정량적 실험 결과 사용 하 여입니다.

프로토콜

1. 솔루션 준비

주: 시 소스에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오.

1. 이중 증 류 물 100 mL에 BSA의 5 g을 추가 하 여 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
2. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
3. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
4. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티 원 올리고 머 항 체 OC 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
5. 이중 증 류 물 1000 mL에 트리 스 베이스의와 NaCl의 88 g 24 g을 추가 하 여 Tris 버퍼 염 분 (TBS) 재고 솔루션을 준비 합니다. PH 7.4에 조정 합니다. 최대 3 개월까지 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
6. 준비는 Tris 버퍼 식 염 수와 트윈-20 (TBST) 솔루션 TBS의 100 mL에 트윈-20의 1 mL을 추가 하 여 재고 솔루션 및 900 mL 이중 증 류 물.
7. 과산화 효소 (HRP) 염소-토끼 IgG (H + L) TBST 용액 10 ml와 사비의 추가 10 µ L에 의해 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
8. 3.68 g 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 10 mM curcumin 재고 솔루션의 1 mL에 curcumin의 분해.
9. 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-프로 판 올 (HFIP) 2.5 mg/mL Aβ 모노 머 솔루션의 2 mL에 합성 Aβ_1-42 의 5 mg을 디졸브. 그것은 실내 온도 (25 ° C)에서 20 분 하 게 100 µ L aliquots에 대 한 놓고-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장 합니다.
   참고:이 절차를 가능한 한 빨리 실행 되어야 합니다. 피 펫 팁 정확한 pipetting 되도록 차단 한다.
10. 1: 1의 볼륨 비율 ECL 액체 A와 B를 혼합 하 여 electrochemiluminescence (ECL) 액체를 준비 합니다. 이 솔루션은 그냥 사용 하기 전에 준비 되어야 한다.

2. 샘플 준비

참고: 분석 blotting 점 전에 2 일 샘플 준비를 수행 합니다.

1. Aβ_1-42 단위체 솔루션;의 튜브에 이중 증 류 물 900 µ L를 추가 Aβ_1-42 의 농도 0.25 mg/mL를 될 것입니다. 20 분 동안 실내 온도에 있는 혼합물을 놓습니다.
2. 볼륨은 약 850 µ L까지 고 순도 질소 가스와 함께 솔루션을 증발. Aβ_1-42 솔루션의 농도 0.29 mg/mL에 대 한 것입니다.
   참고: 솔루션 HFIP는 완전히 증발 되도록 때때로 동요 되어야 한다. 일반적으로, 증발의 30 분 후 잔여 솔루션의 볼륨은 약 850 µ L.
3. Curcumin 재고 솔루션 curcumin 작업 솔루션 (0.2와 2 µ M)을 두 번 증 류 물으로 희석. 믹스 Aβ_1-42솔루션, curcumin 볼륨 비율 1: 1의 솔루션을 작동. Curcumin의 최종 농도 0.1 1 µ M를 될 것입니다.
   참고: 잠재적인 올리고 머 저 해제는 Aβ_1-42 솔루션 필요한 경우 어떤 비율에서 섞일 수 있다.
4. 마그네틱 교 반기에 솔루션을 지속적으로 흔들어 ( 재료의 표참조).
   1. 자석 교 반기에 플라스틱 분배기 상자를 수정 합니다. 장소 2 자석 막대 상자 2 코너에서 저 어 고 상자 중심에서 샘플 튜브를 배치.
   2. 48 h에 대 한 실 온 (25 ° C)에서 상자를 흔들어.
      참고: 자석 교 반기 속도 약 60 rpm.
5. 4 ° C에서 15 분 동안 튜브 원심 및 18000 x g.는 상쾌한을 수집 합니다.

3. 점 Blotting 분석

참고: 모든 외피 수평 통에서 수행 됩니다.

1. 니트로 막 1 cm 넓은 스트립으로 잘라.
   참고: 니트로 막의 폭 실험 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
2. 2 지구 (지구 1와 2) 0.5 cm에서 각 포인트 간격에 균등 하 게 2 µ L 샘플을 놓습니다.
3. 밴드에 물방울이 건조 될 때까지 5 분 동안 실내 온도에 스트립을 놓습니다.
4. 실 온에서 30 분 동안 5 %BSA 솔루션 스트립을 품 어.
5. 실 온에서 5 분 동안 TBST 솔루션 스트립을 씻어.
6. TBST 솔루션 발음 실 온에서 1 h, 스트립 1 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션을 품 어 및 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 2 스트립.
7. 씻어 TBST 솔루션 스트립 3 시간, 실 온에서 5 분 동안 각 시간.
8. TBST 솔루션 발음 실 온에서 40 분 이차 항 체 솔루션 스트립을 품 어.
9. 씻어 TBST 솔루션 스트립 3 시간, 실 온에서 5 분 동안 각 시간.
10. 스트립의 표면에 혼합된 ECL 액체를 균등 하 게 적용 됩니다. 이미징 시스템 자동 화학에 스트립 노출 ( 재료의 표참조).
    참고: 일반적으로, ECL 액체의 300 µ L 충분 한 막 이다. 막 노출 동안 축축한 유지 되어야 한다. 노출 시간 이미징 시스템에 의해 자동으로 계산 됩니다.
11. 반 정량적 결과 얻기 위해 ImageJ (국립 보건원) 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 회색 음영 분석을 할.

결과

Aβ_1-42 단위체 준비 후 Aβ_1-42 올리고 머를 형성할 수 있습니다 여부를 조사 하기 가장 분석 사용 되었다. 아니 볼 수 집계는 HFIP 해산 Aβ_1-42 단위체 샘플 (그림 1A)에서 관찰 되었다. 또한, 주위의 직경을 가진 주로 구형 집계 10-80 nm에서에서 관찰 되었다 Aβ_1-42 샘플 떨고, 48 h 후 Aβ_1-42 준비 (

토론

이 프로토콜에서 우리 Aβ_1-42 올리고 머를 포함 하는 샘플을 준비 하 고 분석 blotting 점이 A11-긍정적인 Aβ_1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 방법을 보고 있다. Aβ_1-42 올리고 머 풍부한 샘플의 준비에 대 한 우리의 방법을 아주 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현할 수 있지만, 지금도 발견 될 몇 가지 포인트. 첫째, HFIP는 합성 Aβ_1-42 펩 티 드를 분해 하는 데 사용 됩니다. 집...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi