A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

Özet

Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.

Özet

Β-amiloid (Aβ) kendi kendine toplamları birleştirmek için içsel bir eğilim ile hidrofobik bir peptit var. Çeşitli toplamları arasında Aβ oligomer yaygın olarak Alzheimer hastalığı (Ah) devam eden önde gelen nörotoksin olarak kabul edilir ve reklam patogenezinde önemli olay olarak kabul edilir. Bu nedenle, Aβ oligomer inhibitörleri ateş önlemek ve hastalık değiştirme olarak geliştirilecek potansiyeline sahip reklam tedaviler. Ancak, farklı oluşumu protokollerin Aβ oligomer reaksiyonlar farklı özelliklere sahip yol açabilir. Ayrıca, etkili bir şekilde ekran Aβ_1-42 oligomer inhibitörleri için pek çok yöntem değildir. A11 almışlarsa bir alt kümesiyle toksik Aβ_1-42 oligomer Anti-paralel β-sayfa yapıları ile tepki verebilir. Bu protokol için biz nasıl bir sentetik Aβ_1-42 peptid vitro bir A11-pozitif Aβ_1-42 oligomer zengini örnekten hazırlamak için ve dot blot tarafından göreli A11-pozitif Aβ_1-42 oligomer örneklerinde miktarda değerlendirmek için tarif analiz A11 ve Aβ_1-42-belirli 6E10 antikorlar. Bu iletişim kuralını kullanan, A11-pozitif Aβ_1-42 oligomer inhibitörleri de yarı kantitatif deneysel sonuçlar ekranlı.

Giriş

Alzheimer hastalığı (Ah) yaşlı insanlar dünya çapında¹etkileyen en önemli nörodejeneratif hastalıklardan birisidir. β-amiloid (Aβ) anormal toplama reklam önde gelen patolojik etken olabilir yaygın olarak kabul edilir. Aβ toplamları Senil plakalar, bir reklam hastaların beyinlerinin biyolojik işaretleri ana bileşenleri vardır. Ayrıca, Aβ toplamları reaksiyonlar özellikle de dahil olmak üzere, reklam ilerledikçe nöronal ölüm sebebi olabilir güçlü nörotoksisite üretmek. Bu nedenle, Aβ oligomer oluşumu inhibisyonu ateş engelleyebilir ve Aβ oligomer inhibitörleri-var geliştirilen hastalığı olarak değiştirme AD tedaviler. Birçok çalışma sentetik Aβ peptid reaksiyonlar içinde vitroformu, türleri Morfoloji ve yapay Aβ reaksiyonlar yapıları keşfetmek ve vitro modelleri^2,3 kullanarak Aβ oligomer inhibitörleri araştırmak için kullanılan ^{, 4}. ancak, farklı vitro oluşumu protokolleri Aβ oligomer oligomer farklı araştırma grupları arasında eşsiz sonuçlar neden olabilir farklı morfolojik özelliklere sahip yol açabilir. Bu nedenle, bir standart oluşumu protokol Aβ oligomer için acilen ihtiyacı vardı.

Şimdiye kadar çoğu yöntemleri doğrudan Aβ reaksiyonlar algılamak için rapor edilmiştir. İletim elektronik mikroskobu (TEM), Sigara denaturing Jel Elektroforez, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ve dot blot Analizi miktar ve/veya morfolojisi Aβ oligomer vitro^5, incelemek için kullanılabilir ⁶. Örneğin, Morfoloji ve Aβ oligomer yapısını TEM içinde görülebilir. Göreli tutarları ve moleküler boyutu Aβ toplamalardan sigara denaturing jel elektroforez tarafından ölçülen. ELISA Aβ oligomer serum, plazma ve beyin dokusu özler belirlemek için kullanılabilir. Son olarak, dot blot analizi, algılamak için kullanılan bir teknik analiz ve proteinler, tanımlama Aβ oligomer farklı örneklerinde göreli yoğunlaşmasını oligomer ve Aβ özgü antikorlar yardımıyla değerlendirmek için kullanılabilir. Jel Elektroforez ve blotting yordamları jeller için gerekli değildir Ayrıca, tahlil kurutma bir nokta önemli zaman tasarrufu sunuyor. Bu nedenle, bu tahlil normalde ekran potansiyel Aβ oligomer inhibitörleri kullanılır. Bu iletişim kuralı genel amacı dot blot Analizi ve ekran Aβ oligomer Aβ_1-42 oligomer miktarda çözümlenecek bir Aβ_1-42 oligomer zengini örnek, hazırlamak için nispeten basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif etmektir Yarı kantitatif deneysel sonuçlar kullanarak inhibitörleri.

Protokol

1. çözüm hazırlık

Not: Tablo malzemeleri reaktif kaynakları için bakın.

1. %5 Sığır serum albumin (BSA) çözüm BSA 5 g çift distile su 100 mL için eklemek suretiyle hazırlamak. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
2. Bir anti-oligomer antikor A11 çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
3. Bir anti-Aβ antikor 6E10 çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
4. Bir anti-fibriler oligomer antikor OC çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
5. Bir Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) hisse senedi çözüm 24 g Tris tabanının ve 88 gr NaCl 1000 mL için çift distile su ekleyerek hazırlayın. PH 7.4 için ayarlayın. Çözüm 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.
6. Tris arabelleğe alınmış serum ve ara-20 (TBST) çözüm ara-20 1 mL 100 mL TBS ekleyerek hisse senedi çözüm ve 900 mL çift distile su hazırlamak.
7. Bir ikincil antikor çözüm horseradish ekleyerek 10 µL tarafından peroksidaz (HRP) keçi Anti-tavşan IgG (H + L) 10 mL TBST çözeltisi için hazır olun. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
8. Curcumin dimetil sülfoksit (10 mM curcumin hisse senedi çözüm oluşturmak için DMSO) 1 ml 3.68 g geçiyoruz.
9. Sentetik Aβ_1-42 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (2.5-mg/mL Aβ monomer çözüm oluşturmak için HFIP) 2 ml 5 mg geçiyoruz. 20 dk. yapmak 100 µL aliquots için oda sıcaklığında (25 ° C) yerleştirin ve 6 aya kadar-20 ° C'de depolayın.
   Not: Bu yordam kısa sürede çalıştırılması gerekir. Pipet ipuçları doğru pipetting emin olmak için kesilmiş.
10. Electrochemiluminescence (ECL) sıvı hacim oranı 1:1 ECL sıvı A ve B karıştırarak hazırlayın. Bu çözüm sadece kullanmadan önce hazırlanmalıdır.

2. numune hazırlama

Not: 2 gün önce analiz kurutma nokta numune hazırlama gerçekleştirin.

1. Çift distile su 900 µL Aβ_1-42 monomer çözüm bir tüp için ekleyin; Aβ_1-42 konsantrasyonu 0.25 mg/mL olacaktır. 20 dakika oda sıcaklığında karışımı yerleştirin.
2. Hacmi yaklaşık 850 µL olana yüksek saflıkta azot gazı ile çözüm buharlaşır. Aβ_1-42 çözüm konsantrasyonu 0.29 mg/mL hakkında olacak.
   Not: Çözüm zaman zaman HFIP tamamen buharlaşıp emin olmak için sarsılmış. Normalde, buharlaşma, 30 dk sonra kalan çözüm yaklaşık 850 µL birimdir.
3. Curcumin hisse senedi çözüm curcumin çalışan bir çözüm (0.2 ve 2 µM) çift distile suyla seyreltik. Aβ_1-42çözüm ve çözüm 1:1 bir hacim oranı ile çalışma curcumin karıştırın. Curcumin son konsantrasyonları 0,1 ve 1 µM.
   Not: Potansiyel oligomer inhibitörleri Aβ_1-42 çözüm gerekirse herhangi bir oranda ile karışabilir.
4. Çözüm, sürekli olarak bir manyetik karıştırıcı sallamak ( Tablo malzemelerigörmek).
   1. Manyetik karıştırıcı bir plastik ayırıcı kutusuna düzeltmek. Place 2 manyetik barlar kutusunun 2 köşesine heyecan ve örnek tüpler kutusunun ortasına yerleştirin.
   2. Kutusu, oda sıcaklığında (25 ° C) 48 h için salla.
      Not: Manyetik karıştırıcı hızını yaklaşık 60 rpm olduğunu.
5. 4 ° C'de 15 dakika tüpler santrifüj kapasitesi ve 18.000 x g. süpernatant toplamak.

3. dot blot Analizi

Not: Tüm incubations üzerinde yatay bir shaker gerçekleştirilir.

1. Nitroselüloz membran 1 cm genişliğinde şeritler halinde kesin.
   Not: Nitroselüloz membran genişliğini deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.
2. 2-µL örnekleri eşit 2 şeritler (şerit 1 ve 2) 0.5 cm her noktası Aralık ile yerleştirin.
3. Damlacık grup üzerinde kuru olana, oda sıcaklığında 5 min için şeritler yerleştirin.
4. Şeritler, oda sıcaklığında 30 dk için %5 BSA çözüm ile kuluçkaya.
5. Şeritler ile bir TBST çözüm 5 min için oda sıcaklığında durulayın.
6. TBST çözüm Aspire edin. 1 h, oda sıcaklığında için şerit bir anti-oligomer antikor A11 çözüm 1 kuluçkaya ve 2 anti-Aβ antikor 6E10 çözümünü ile şerit.
7. Şeritler bir TBST çözüm ile üç kez, her zaman oda sıcaklığında 5 min için durulayın.
8. TBST çözüm Aspire edin. Şeritler, oda sıcaklığında 40 min için bir ikincil antikor çözüm ile kuluçkaya.
9. Şeritler bir TBST çözüm ile üç kez, her zaman oda sıcaklığında 5 min için durulayın.
10. Eşit karma ECL sıvı şeritler yüzey için geçerlidir. Şeritler görüntüleme sistemi bir otomatik Kemiluminesan maruz ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: Normalde, ECL sıvı 300 µL bir membran yeter. Membran pozlama sırasında nemli tutulmalıdır. Pozlama süresi görüntüleme sistem tarafından otomatik olarak hesaplanır.
11. Yarı kantitatif sonuçları elde etmek için ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri) veya başka bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bir gri tonlamalı analizi yapmak.

Sonuçlar

Aβ_1-42 monomer hazırlık sonra bir Aβ_1-42 oligomer oluşturmak olup olmadığını araştırmak için TEM analizi kullanıldı. Hiçbir görünür toplamları HFIP çözünmüş Aβ_1-42 monomer örnek (Şekil 1A) tespit edildi. Ayrıca, esas olarak küresel toplamları çapında 10-80 nm gözlendi Aβ_1-42 örnekte sallayarak, 48 saat sonra Aβ_1-42 reaksiyonlar hazırlık (

Tartışmalar

Bu protokol için bir yöntem Aβ_1-42 oligomer içeren numune hazırlama ve analiz kurutma bir nokta tarafından A11-pozitif Aβ_1-42 oligomer miktarda çözümlemek için bildirdin. Bizim yöntemleri Aβ_1-42 oligomer zengini örnekleri hazırlanması için oldukça basit, güvenilir ve tekrarlanabilir olmakla birlikte, hala fark gereken bazı noktalar vardır. İlk olarak, HFIP sentetik Aβ_1-42 peptid dağıtmak için kullanılır. Bir araya getirilmiş Aβ_1-42 pepti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi