تقييم شامل لفعالية وسلامة إيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة باستخدام ثلاثة أساليب تكميلية

Summary

ونحن تصف نظام الذي يستخدم ثلاثة أساليب لتقييم سلامة وفعالية لإيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة: في فيفو التصوير لرصد تراكم نانوحبيبات، والموجات فوق الصوتية عالية التردد لرصد التنمية المشيمة والجنين ، و [هبلك] التحديد الكمي لإيصال الأدوية إلى أنسجة.

Abstract

لا توجد علاجات فعالة موجودة حاليا لمضاعفات الحمل المرتبطة بالمشيمة، ووضع استراتيجيات لإيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة مع التقليل من الآثار الجانبية على الجنين والأم لا تزال صعبة. الناقلين نانوحبيبات هادفة توفر فرصاً جديدة لعلاج أمراض المشيمة. نحن أظهرت مؤخرا أن ببتيد اصطناعية كبريتات شوندروتن المشيمة بربط (بلكسا-BP) يمكن أن تستخدم لتوجيه جسيمات نانوية لتسليم المخدرات إلى المشيمة. في هذا البروتوكول، نحن تصف بالتفصيل نظام لتقييم كفاءة إيصال المخدرات إلى المشيمة بلكسا-بي بي أن توظف ثلاثة طرق منفصلة المستخدمة في تركيبة: في فيفو التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية التردد (هفوس) وعالية الأداء كروماتوغرافيا سائلة ([هبلك]). استخدام في فيفو جسيمات نانوية التصوير، بلكسا-بي بي-تسترشد كانت تصور في مشيمة الحيوانات الحية، بينما هفوس و [هبلك] أظهرت أن جسيمات نانوية بلكسا-بي بي-مترافق كفاءة وعلى وجه التحديد تسليم الميثوتريكسات للمشيمة. وهكذا، يمكن استخدام مزيج من هذه الأساليب كأداة فعالة لإيصال المخدرات إلى المشيمة المستهدفة وتطوير استراتيجيات جديدة للعلاج لعدة مضاعفات الحمل.

Introduction

مضاعفات الحمل بوساطة المشيمة، بما في ذلك مقدمات الارتعاج وفقدان الحمل، أبروبتيون المشيمية والعمر الحملي الصغيرة (SGA)، مشتركة وأن يؤدي إلى اعتلال الأمهات والأجنة كبيرة ووفيات^{1،2، 3}، وعدد قليل جداً من المخدرات قد ثبت أن تكون فعالة لعلاج الحمل واضطرابات^4،5. وضع استراتيجيات لإيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة أكثر انتقائية وأكثر أمنا خلال الحمل لا تزال صعبة في العلاج بالعقاقير الحديثة.

في السنوات الأخيرة، ركزت عدة تقارير مستهدفة إيصال المخدرات إلى الأنسجة أوتيروبلاسينتال بجسيمات نانوية طلاء مع الببتيدات أو الأجسام المضادة كأدوات المستهدفة للمشيمة. تشمل هذه جسم⁶ (EGFR) مستقبلات عامل نمو البشرة-مكافحة وورم-صاروخ موجه الببتيدات (كجكرك وإيرجد)⁷، الببتيدات المستهدفة للمشيمة⁸، الببتيدات المستهدفة المفرج المشيمية⁹ وأجسام مضادة ضد مستقبلات الاوكسيتوسين¹⁰.

هنا، علينا أن نظهر أن ببتيد اصطناعية كبريتات شوندروتن المشيمة بربط (بلكسا-BP) يمكن أن تستخدم لإيصال جسيمات نانوية وحمولاتها المخدرات الموجهة إلى المشيمة¹¹. Nanoparticles بلكسا-بي بي-تسترشد مكملة أوتيروبلاسينتال عن استهداف أساليب نظراً لأنها تستهدف تروفوبلست المشيمة.

كطريقة غير الغازية، وقد استخدمت في فيفو تصوير لرصد الجينات الخاصة بالمشيمة في الفئران¹²، وإيندوسيانيني الأخضر (ICG) قد استخدمت على نطاق واسع لتعقب جسيمات نانوية استخدام fluorescence التصوير^{، نظم13 ،}من ¹⁴¹⁵. وهكذا، نحن حقن الوريد جسيمات نانوية بلكسا-بي بي-مترافق محملة ICG (بلكسا-INPs) لتصور توزيع بلكسا-البرنامج النووي العراقي في الفئران الحوامل مع تصوير الأسفار. ثم أننا حقن الوريد الميثوتريكسات (MTX)-تحميل بلكسا-مصادر القدرة النووية في الفئران الحوامل. الموجات فوق الصوتية عالية التردد (هفوس)، آخر غير الغازية، في الوقت الحقيقي التصوير^،أداة¹⁶¹⁷ تم استخدامه لرصد وضع الجنين والمشيمة في الفئران. وأخيراً، كنا كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) لقياس توزيع MTX في المشيمة والأجنة.

ونحن في هذا البروتوكول، تصف بالتفصيل النظام ثلاثة-الأسلوب الذي يستخدمه نانوكاريرس بلكسا-بي بي-تسترشد لتقييم كفاءة إيصال المخدرات تستهدف المشيمة.

Protocol

جميع التجارب التي الماوس تتبع بدقة بروتوكولات (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) وافقت عليها بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة من شنتشن معاهد للتكنولوجيا المتقدمة، الأكاديمية الصينية للعلوم.

1-خلاصة المشيمة كبريتات شوندروتن بوليمر الدهون المستهدفة بجسيمات نانوية

1. توليف تحميل MTX و ICG جسيمات نانوية دهن البوليمر (منبس و INPs على التوالي) وجسيمات نانوية بلكسا-بي بي-مترافق (بلكسا-منبس وبلكسا INPs) كما هو موضح في التفصيل في أماكن أخرى¹⁸.

2. في فيفو Fluorescence التصوير

1. إعداد الفئران الحوامل
   1. وضع مؤتمر نزع السلاح-1 الإناث الفئران (8-12 أسبوعا) مع خصوبة الذكور من نفس السلالة في قفص واحد (الذكور: الإناث = 1:2) في بعد ظهر اليوم والاختيار المهبل المقابس التالية صباح اليوم. إذا كان من الملاحظ سداده مهبلية، تعريف الماوس كيوم الجنينية 0.5 (E0.5).
   2. دورة البيت الفئران الحوامل وحدها في غرفة خالية من مسببات الأمراض حيوانية مع ح ضوء/10 ح 14 مظلمة وتوفير حرية الوصول إلى الغذاء والماء حتى E14.5.
2. حقن الوريد لجسيمات نانوية
   1. قبل الإجراء، تعقيم جسيمات نانوية عن طريق الترشيح من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر. وزن الماوس الحامل في E11.5 لتحديد كمية وحجم الحقن نانوحبيبات.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم الحقن نانوحبيبات أقل من 1% (الحجم والوزن) من وزن الجسم للماوس الحوامل. على سبيل المثال، يجب أن يكون حجم الحقن نانوحبيبات أقل من 0.25 مل في ماوس 25 جرام.
   2. لتمدد الوريد الذيل، الحارة الذيل لمدة 5-10 دقيقة مع وسادة تدفئة.
   3. قبل الحقن، نضح INPs أو INPs بلكسا في محقن الأنسولين ز 28.
   4. نقل الماوس الحوامل إلى جهاز القابضة التي يقيد الماوس مع السماح بالوصول إلى هذا السياق الذيل. تنظيف الذيل مع مسحه الكحول. قم بإدراج حقنه في الوريد الذيل. حقن INPs أو بلكسا-INPs (ما يعادل ICG 5 مغ/كغ) ببطء مع الضغط حتى على مدى 5-10 ق.
      ملاحظة: إيقاف الحقن إذا نفطة يظهر في الذيل لأن هذه النتيجة تشير إلى أن الإبرة ليست في هذا السياق. ينبغي عدم تقاسم المحاقن بين الفئران للحد من انتقال الأمراض والتلوث عبر.
   5. سجل الوقت الحقن. ومن ناحية أخرى، تطبيق ضغط لطيف على موقع الحقن حتى يتوقف النزف، التي عادة ما تستغرق 30-60 ثانية.
3. التصوير في فيفو
   1. صورة و 30 دقيقة بعد الحقن، الفئران الحوامل في فيفو fluorescence نظام التصوير باستخدام.
   2. تخدير الفئران الحوامل مع معدل تدفق الأوكسجين 1.0 لتر في الدقيقة وإيسوفلوراني في 2-4% في دائرة المرتبطة بها لوحدة التخدير والتحقق من التخدير الكامل ببطء وانتظام التنفس. ثم نقلها إلى غرفة التصوير. ضع الفئران الحوامل أنيسثيتيزيد إلى غرفة التصوير، حفظ الحيوانات في موقف ضعيف.
   3. وضع مخروط الآنف أكثر من الفم والأنف للسماح باستنشاق إيسوفلوراني 1-2 في المائة مع معدل تدفق الأوكسجين 1.0 لتر في الدقيقة للمحافظة على التخدير.
   4. حدد المعلمات 2D-الأسفار والتصوير الفوتوغرافي للصور إشارات fluorescence ICG. ضبط التعرض السيارات وموجات الإثارة/الانبعاثات إلى 710/820 نيوتن متر.
   5. في نهاية عملية التصوير، إيقاف تدفق isoflurane لوقف التخدير، والعودة بعناية الفئران الحوامل إلى اقفاصها.
   6. 48 ساعة بعد الحقن نانوحبيبات، تخدير الفئران الحوامل مع إيسوفلوراني ومن ثم التضحية السد بخلع عنق الرحم. جمع الأجنة والمشيمة استخدام الملقط جرايفى، جرايفى ملقط الأنسجة، وتشريح المقص.
   7. وضع المشيمة والأجنة في غرفة التصوير، والصورة باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 2.3.4.

3. هفوس التقييم من التنمية الجنينية

1. نماذج حيوانية
   1. الحصول على وإعداد الفئران الحوامل كما هو موضح في الخطوة 2، 1.
   2. استخدام هفوس للفئران الحوامل الصورة في ه 6.5 (البروتوكولات 3.2 و 3.3.3). أولاً، تأكيد الحمل بتصور أجنة في اليوم E6.5 ومن ثم تخصيص الفئران الحوامل عشوائياً إلى ثلاث مجموعات: مجموعة حركة الأشخاص الطبيعيين، مجموعة بلكسا-حركة الأشخاص الطبيعيين، ومجموعة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
   3. حقن برنامج تلفزيوني، منبس أو بلكسا-منبس (1 مغ/كغ، أي ما يعادل MTX) في عروق ذيل الفئران الحوامل يوميا ابتداء من الساعة E6.5 كما هو موضح في الخطوة 2، 2.
2. التحضير للتصوير
   1. 24 ساعة بعد حقن جسيمات نانوية، صورة الفئران الحوامل استخدام هفوس نظام التصوير.
   2. تخدير الفئران الحوامل كما هو موضح في الخطوة 2.3.2. بدوره على عناصر تحكم درجة الحرارة المتكاملة من منصة التصوير وتسخَّن المنهاج إلى 37-42 درجة مئوية. تأمين الفئران الحوامل في موقف ضعيف على منصة استخدام الشريط.
   3. مكان مخروط الآنف متصل إلى وحدة التخدير عبر الآنف. تطبيق isoflurane 2% مع معدل تدفق الأوكسجين 1.0 لتر في الدقيقة للمحافظة على التخدير المطرد.
   4. إزالة الشعر كيميائيا من البطن باستخدام كريم مزيل الشعر. تمحو القشدة المتبقية جيدا بشاش غارقة في المياه، ومن ثم معطف البطن مع اقتران جل الصوتية.
3. التصوير الداخلي
   1. ضع محول 40 ميغاهرتز في الذراع الميكانيكية.
   2. ضبط موضع محول طاقة للحصول على صور طولية للجنين والمشيمة مع منطقة الفائدة الواقعة في المنطقة المركزية.
   3. ب-وضع التصوير والتحليل
      ملاحظة: مشاهدة فيلم 1.
      1. انقر فوق الزر ب-الوضع وأقل محول على بطنه حتى تأتي بالجنين والمشيمة في طريقة العرض. اضغط على الزر مسح/تجميد لبدء/إيقاف التصوير، اضغط على تخزين سينمائية لتخزين حلقة سينمائية، واضغط على تخزين الإطار لتخزين الصور الإطار.
      2. انقر فوق زر الإجراء لتحليل طول الكيس الحملي (ع) وطول الردف التاج الجنين (CRL)، بيباريتال القطر (برميل يوميا)، ومحيط البطن (AC)، قطرها المشيمية (PD) وسمك المشيمة (PT).
   4. تصوير دوبلر الأسبق والتحليل
      ملاحظة: مشاهدة فيلم 1.
      1. استخدام نفس المسح الضوئي الإسقاط وانقر فوق الزر الأسبق ، ضع مربع حجم العينات في وسط الشريان السري واضغط مسح/تجميد الشروع في تصوير. انقر فوق تخزين سينمائية لجمع الصور الشريان السري.
      2. انقر فوق الزر مقياس لحساب السرعة القصوى الشريان السري (UA).
   5. تصوير دوبلر وضع الألوان وتحليل
      1. استخدام نفس المسح الضوئي الإسقاط، انقر فوق الزر لون وضبط موضع محول طاقة الحصول على صور لقلب الجنين. اضغط على مسح/تجميد للشروع في تصوير و سينما تخزين لجمع الصور.
      2. انقر فوق الزر مقياس لحساب معدل قلب الجنين (الموارد البشرية).

4. تحليل [هبلك]

1. إعداد الأنسجة
   1. حقن الفئران الحوامل بجرعة واحدة من منبس أو بلكسا-منبس (ما يعادل MTX 1 مغ/كغ) في أواخر فترة الحمل (مثلاً., E14.5) كما هو موضح في الخطوة 3.1.3.
   2. بعد 24 ساعة، تخدير الفئران بحقن داخل أفيرتين في 240 ميكروغرام/الوزن (ز). ضمان أي رد على قرصه سيرا على أقدام للتحقق من أن يتم تخديره الفئران تماما.
   3. رش منطقة الصدر مع الإيثانول 75%. أداء القلب نضح (قطع الاذينين الأيمن ونتخلل عن طريق البطين الأيسر) كما تم وصفه سابقا بالتفصيل^19،20 مع 50 مل من المثلج ملحي 0.9% لمدة 10 دقيقة لإزالة جسيمات نانوية غير منضم.
   4. Euthanize السد. القيام العملية قيصرية جمع الأجنة والمشيمة استخدام الملقط جرايفى، تشريح مقص وملقط الأنسجة جرايفى، وتخزين الأنسجة في-80 درجة مئوية قبل التحليل.
   5. إعداد الحل التجانس (حمض بيرتشلوريك 10%)، والحفاظ على الجليد. تجمع حوالي 200 ملغ أنسجة، وإضافة 500 ميكروليتر من تجانس الحل لكل عينة. مجانسة العينات باستخدام الخالطون بأقصى سرعة 30 ثانية، وتكرار هذا الإجراء مرتين.
   6. الطرد المركزي في عينات ز × 14,000 لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تصفية المادة طافية (حوالي 300 ميكروليتر) من خلال مرشح حقنه 0.45 ميكرومتر، ونقل السائل الناتج قنينة [هبلك]. ضع قارورة العينة إلى علبة أوتوسامبلير للحقن.
2. إعداد معايير
   1. إعداد الحل التالي لمرحلة الجوال: 40 مم بوتاسيوم فوسفات مائي (pH 4.5) والاسيتو الانيتريل (88:12، v/v). تصفية الحل من خلال مرشح حقنه حجم مسام 0.45 ميكرومتر ونقل السائل الناتج باستخدام زجاجة خزان [هبلك] نظيفة.
      ملاحظة: تعديل درجة الحموضة بحامض الفوسفوريك 0.1 متر. استخدام الاهتزاز بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة ديغا المرحلة المتنقلة في كل مرة سابقة لاستخدام.
   2. تزن 10 مغ MTX في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل. أضف 1 مل هيدروكسيد الصوديوم 1 متر.
   3. الدوامة بسرعة عالية حتى يذوب MTX تماما.
      ملاحظة: هذا هو الرصيد الابتدائي ويمكن تخزينها في-20 درجة مئوية لعدة أشهر.
   4. لإنشاء مخزون MTX الثانوي (500 ميكروغرام/مل)، يؤدي إلى تمييع 50 ميكروليتر من الرصيد الأساسي في ميكروليتر 950 المرحلة المتنقلة.
      ملاحظة: تخزين على الجليد حتى الاستخدام، وإعداد يومية جديدة. من المهم استخدام المرحلة متنقلة لإعداد معايير لتجنب قمم الناتجة عن خلط حلول متباينة بعد الحقن بعينه.
   5. بذل مزيد من تخفيف لإنشاء المعايير (الجدول 1). تخزين المعايير على الجليد وإعداد يومية جديدة. تشغيل المعايير في سلسلة مع العينات التجريبية.

عدد	التركيز النهائي (ميكروغرام/مل)	500 ميكروغرام/مل ميكروليتر القياسية،	Phase(μL) الجوال
1	0.5	1	999
2	1	2	998
3	2.5	5	995
4	10	20	980
5	25	50	950
6	50	100	900
7	100	200	800

الجدول 1. إعداد من المنحنى المعياري ل MTX. تركيز MTX القياسية الحل النهائي من 0.5-100 ميكروغرام/مل.

3. الأجهزة [هبلك] و معلمات العملية
   ملاحظة: تم تحليل العينات على نظام [هبلك] مزودة بمضخة المذيبات، جهاز كشف سبيكتروفوتوميتريك الأشعة فوق البنفسجية (313 نانومتر)، وعمود C18 (250 × 4-6 مم، وحجم الجسيمات ميكرومترات 5).
   1. قم بتشغيل ديجاسير [هبلك] لإزالة الهواء من النظام. قم بتشغيل التدفق، اكويليبراتينج العمود مع المرحلة المتنقلة لمدة 30 دقيقة للحد من الضوضاء خط الأساس.
   2. تعيين درجة حرارة العمود إلى 25 درجة مئوية وضخ 20 ميكروليتر عينة من وحدات التخزين بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة، وانقر فوق الأسلوب Run لبدء التحليل.
   3. عند إتمام يمتد، يدوياً تغيير المرحلة المتنقلة إلى الاسيتو الانيتريل [هبلك]-الصف. تشغيل لمدة 15 دقيقة تقريبا لحماية النظام.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي عدم القيام بهذه الخطوة بعد وقت التشغيل الموصى بها في الضرر للعمود.
   4. للتحليل الكمي، وحساب المناطق الواقعة تحت قمم MTX القياسية من اهتمام باستخدام برنامج النظام [هبلك].

النتائج

في هذه المخطوطة، كانت جسيمات نانوية بلكسا-بي بي-مترافق مع MTX (بلكسا-منبس) أو ICG (بلكسا-INPs) تحميل حقن الوريد في الفئران الحوامل. وكشفت في فيفو تصوير إشارات ICG قوي في منطقة الرحم و 30 دقيقة بعد حقن بلكسا-البرنامج النووي العراقي. كانت المترجمة INPs أساسا إلى منطقة الكبد والطحا?...

Discussion

في هذه المخطوطة، فإننا مخطط نظام الثلاث-طريقة لتحديد ما إذا كانت جسيمات نانوية بلكسا-بي بي-تسترشد أداة فعالة لاستهداف إيصال المخدرات إلى المشيمة. تأكد استخدام في فيفو التصوير لرصد الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت ICG إشارة خصوصية استخدام بلكسا-هناك استهداف المشيمية هفوس و [هبلك]، أثبتنا أ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD-1 mice	Beijing Vital River	201	Female (8-12 week)
Insulin syringe	BD	328421	for IV injection
Ethanol absolute	Sinopharm Chemical	10009218	for nanoparticles synthesis
Soybean lecithin	Avanti Polar Lipids	441601	for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOH	Avanti Polar Lipids	880125	for nanoparticles synthesis
PLGA	Sigma-Aldrich	719897	for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processor	Sonics	VCX130	for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX)	Sigma-Aldrich	V900324	for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG)	Sigma-Aldrich	1340009	for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS)	Hyclone	SH30028.01
IVIS spectrum instrument	Perkin Elmer		for in vivo imaging
Ultrasound transmission gel	Guanggong	ZC4252418	for ultrasound imaging
Isoflurane	Lunan Pharmaceutical	I0040	for maintain the anesthesia
Depilatory cream	Nair	TMG001	for removing fur
40 MHz transducer	VisualSonics	MS550S	for ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging system	VisualSonics	Vevo2100	for ultrasound imaging
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402	for anesthesia
Syringe pump	Mindray	SK-500III	forcardiac perfusion
0.9% saline solution	Meilunbio	MA0083	forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubes	AXYGEN	MCT-150-C
-80 °C freezer	Thermo Fisher Scientific	88600V
Centriguge	Cence	H1650R
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421	for precipitating protein
Homogenizer	SCIENTZ	SCIENTZ-48	for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm)	Millipore	SLHV033RS01
Sodium hydroxide	Sinopharm Chemical	10019763	for solving MTX
HPLC vials	Waters	670650620	for HPLC
Potassium phosphate dibasic	Sinopharm Chemical	20032117	for HPLC
Acetonitrile	JKchemical	932537	for HPLC
C18 column	Waters	186003966	for HPLC
HPLC system	Shimadzu		for HPLC