3 보완 방법을 사용 하 여 태 반 대상 약물 전달의 안전과 효율성의 종합 평가

요약

우리는 안전 및 태 반 대상 약물 전달의 효과 평가 하기 위해 세 가지 방법을 사용 하는 시스템을 설명: vivo에서 이미징 나노 축적, 태 반 및 태아 개발을 모니터링 하 고 주파수 초음파를 모니터링 하 그리고 조직에 약물 전달 척도를 HPLC.

초록

더 효과적인 치료 태 반 관련 임신 합병증에 대 한 현재 존재 하 고 도전 남아 태아와 모성의 부작용을 최소화 하면서 태 반에 약물의 타겟된 배달에 대 한 전략을 개발. 타겟된 나노 캐리어 placental 질환을 치료 하는 새로운 기회를 제공 합니다. 우리는 최근에 합성 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP) 태 반에 약물을 전달 하기 위해 나노 가이드 사용 될 수 보여 주었다. 이 프로토콜에서 설명 자세히 plCSA-혈압 사용 세 별도 메서드를 사용 하 여 태 반에 약물 전달의 효율성을 평가 하기 위한 시스템: vivo에서 이미징, 높은-주파수 초음파 (HFUS), 및 높은 성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC)입니다. Vivo에서 를 사용 하 여 이미징, plCSA BP-기반 나노 했다 시각에 살아있는 동물의 반응과 HFUS 및 HPLC는 plCSA BP 활용 된 나노 효율적이 고 구체적으로 전달 토트 태 반에 시연 하는 동안. 따라서, 이러한 방법의 조합은 태 반에 약물의 타겟된 배달 및 여러 가지 임신 합병증에 대 한 새로운 치료 전략의 개발을 위한 효과적인 도구로 사용할 수 있습니다.

서문

사전 eclampsia, 임신 손실, placental 속보 및 작은 임신 연령 (SGA)를 포함 하 여 중재 하는 태 반 임신 합병증은 일반적이 고 실질적인 태아와 산 모 병 적 상태와 사망률^1,2,^{에 3}, 그리고 거의 약^4,5장애 임신 치료에 효과적인 것으로 입증 되었습니다. 임신 중 더 선택적이 고 안전한 태 반 대상 약물 전달에 대 한 전략의 개발 현대 약물 치료에 도전 남아 있습니다.

최근 몇 년 동안, 여러 보고서 태 타겟팅 도구로 펩 티 드 또는 항 체 나노 입자 코팅에 의해 uteroplacental 조직에 약물의 타겟된 배달에 집중 했다. 이러한 안티 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)⁶ 항 체, 등 종양 유도 펩 티 드 (CGKRK 및 iRGD)⁷, 태 반 대상 펩 티 드⁸, placental 맥 관 구조 대상 펩 티 드⁹ 에 대 한 항 체는 옥 시 토 신 수용 체¹⁰.

여기, 합성 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP) 태¹¹나노 입자와 그들의 마약 페이로드의 대상된 배달에 사용할 수 있습니다 설명 합니다. PlCSA BP-기반 나노 입자는 placental trophoblast 대상 때문에 메서드를 대상으로 보고 uteroplacental를 보완.

비-침략 적 방법으로 이미징 vivo에서 쥐¹², 태 반 관련 유전자 발현을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다 그리고 indocyanine 그린 (ICG) 나노 입자 형광 이미징 시스템^{13를 사용 하 여 추적을 널리 이용 되는 , 1415}. 따라서, 우리는 plCSA BP 활용 된 나노 로드 ICG (plCSA-INPs) 형광 이미징 임신 쥐에 plCSA INP 분포를 시각화 하 정 맥 주입. 우리는 다음 정 맥 methotrexate (MTX) 주사-임신 쥐에 plCSA-NPs를 로드. 높은 주파수 초음파 (HFUS), 다른 비-침략 적, 실시간 이미징 도구^16,17 쥐에 태아 및 태 반 개발을 모니터링 하는 데 사용 되었다. 마지막으로, 우리 반응과 태아에 MTX 분포를 정량화 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 사용.

이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 plCSA 혈압 유도 nanocarriers 태 대상 약물 전달의 효율성을 평가 하는 데 사용 하는 3 방법 시스템.

프로토콜

모든 마우스 실험 동물 관리 및 사용 위원회의 심천 연구소의 첨단 기술, 과학의 중국 아카데미에 의해 승인 되는 프로토콜 (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232)에 엄격 하 게 따 랐 다.

1. 태 반 Chondroitin 황산 염 A 대상 지질 고분자 나노 입자의 합성

1. MTX 및 ICG 로드 지질 고분자 나노 입자를 합성 (MNPs와 INPs 각각) plCSA BP 활용 된 나노 입자 (plCSA-MNPs와 plCSA INPs)에 설명 된 대로 자세하게 다른¹⁸.

2. vivo 형광 이미징

1. 임신 쥐의 준비
   1. 한 장에 동일한 긴장의 비옥한 남성 여성 CD-1 마우스 (8-12 주) 장소 (남성: 여성 = 1:2) 확인 하 고 오후에는 질 플러그 다음 아침. 질 플러그 관찰 되는 경우 배아 하루 0.5 (E0.5)으로 마우스를 정의 합니다.
   2. 집 임신 마우스 혼자 어두운 14 h 빛/10 h 동물 병원 체 없는 방에 주기을 E14.5까지 음식과 물에 대 한 무료 액세스를 제공 합니다.
2. 나노 입자의 정 맥 주입
   1. 절차, 전에 0.22 μ m 주사기 필터를 통해은 나노 여과 의해 소독. 수량 및 나노 사출의 볼륨을 결정 하기 위해 E11.5에서 임신 마우스 무게.
      참고: 나노 사출 볼륨 1% 미만 (볼륨/중량) 임신 마우스의 몸 무게의 이어야 한다. 예를 들어 나노 사출 볼륨 25 g 마우스에 0.25 mL 미만 이어야 한다.
   2. 꼬리 정 맥 팽창가 열 패드와 함께 5-10 분에 대 한 꼬리를 따뜻한.
   3. 28 g 인슐린 주사기에 주입 하기 전에 INPs 또는 plCSA INPs 발음.
   4. 임신 마우스를 꼬리 정 맥에 대 한 액세스를 허용 하는 동안 마우스를 멈출 지주 장치 전송. 꼬리는 알코올 면봉으로 청소 합니다. 다음 꼬리 정 맥에 주사기를 삽입 합니다. 천천히 주입 INPs 또는 plCSA-INPs (5 mg/kg ICG 해당)도 압력에 5-10 s.
      참고: 물집에 나타나면 꼬리 때문에이 결과 바늘 임을 나타냅니다 하지 정 맥 주입을 중지 합니다. 주사기는 질병 전송 최소화 하기 위해 마우스 및 교차 오염을 사이 공유 되지 않을.
   5. 사출 시간을 기록 합니다. 한편,는 일반적으로 30-60 s 출혈 정지까지 사출 사이트에 부드러운 압력을 적용 됩니다.
3. Vivo에서 화상 진 찰
   1. 주입 후 30 분 임신 쥐에서 vivo 형광 이미징 시스템을 사용 하 여 이미지.
   2. Anesthetize 1.0 L/min와 isoflurane 마 취 단위의 관련된 상공에 2-4%의 산소 흐름 속도와 임신 쥐 고 느린에 의해 전체 마 취와 일반 호흡을 확인 합니다. 그런 다음 이미징 챔버로 이동 합니다. 부정사 위치에 동물 유지 이미징 실로 마 취 임신 마우스를 놓습니다.
   3. 입과 마 취를 유지 하기 위해 1.0 L/min의 산소 흐름 속도 1-2 %isoflurane 흡입 수 있도록 코 코 콘 장소.
   4. ICG 형광 신호를 이미지를 2D 형광 및 사진 매개 변수를 선택 합니다. 설정 자동 으로 노출과에 여기/방출 파장 710/820 nm.
   5. 이미징 절차의 끝에, 마 취, 막으려고 isoflurane 유입 해제 하 고 신중 하 게 그들의 감 금 소를 임신 쥐를 반환.
   6. 나노 사출 후 48 h anesthetize isofluorane와 임신 쥐 그리고 자 궁 탈 댐 희생. 태아와 반응과 Graefe 집게, Graefe 조직 집게를 사용 하 고 해 부가 위를 수집 합니다.
   7. 반응과 태아 이미징 실과 단계 2.3.4에서에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 이미지에 놓습니다.

3. HFUS 배아 발달의 평가

1. 동물 모델
   1. 얻기 및 단계 2.1에에서 설명 된 대로 임신 쥐를 준비.
   2. HFUS를 사용 하 여 E 6.5 (3.2 및 3.3.3 프로토콜)에서 이미지 임신 쥐. 첫째, 하루 E6.5에 배아를 시각화 하 여 임신을 확인 하 고 다음 세 그룹으로 임신 쥐를 무작위로 할당: MNP 그룹, plCSA MNP 그룹 및 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 그룹.
   3. 주사 PBS, MNPs 또는 plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX 상응) 임신 쥐의 꼬리 정 맥으로 매일 2.2 단계에서 설명한 대로 E6.5에서 시작.
2. 이미징에 대 한 준비
   1. 나노 입자, 주사 후 24 h 이미지 이미징 시스템 HFUS를 사용 하 여 임신 쥐.
   2. 2.3.2 단계에서 설명한 대로 임신 쥐를 anesthetize. 이미징 플랫폼의 통합된 온도 제어를 켜고, 37-42 ° c 플랫폼을 예 열 테이프를 사용 하 여 플랫폼에 부정사 위치에 임신 쥐를 보호 합니다.
   3. 장소 코 콘 주 둥이 통해 마 취 단위에 연결. 1.0 L/min 꾸준한 마 취를 유지 하는 산소 유량과 2 %isoflurane 적용 됩니다.
   4. 화학적 depilatory 크림을 사용 하 여 복 부에서 머리를 제거 합니다. 물에 젖은 거 즈로 깨끗이 잔여 크림을 닦 고 젤 커플링 음향 복 코트.
3. 영상 절차
   1. 기계 팔에서 40 MHz 변환기를 놓습니다.
   2. 초점 영역에서 관심 영역으로 태아와 태 반에의 경도 이미지를 변환기 위치를 조정 합니다.
   3. B 모드 영상과 분석
      참고: 영화 1
      1. B 모드 버튼을 클릭 하 고 태아와 태 반 보기에 올 때까지 복 부에 변환기를 낮은. 시작/정지 영상, 씨 네 저장 을 누릅니다을 씨 네 루프 저장 프레임 저장 프레임 이미지를 저장 하 게 스캔/동결 을 누릅니다.
      2. 임신 성 골목 길이 (GS), 태아 크라운 둔 부 길이 (CRL), biparietal 직경 (BPD), 복 부 둘레 (AC), placental 직경 (PD)와 태 반 두께 (PT) 분석 측정 버튼을 클릭 합니다.
   4. PW 도플러 영상 및 분석
      참고: 영화 1
      1. 동일을 사용 하 여 프로젝션 스캔, 비밀 번호 버튼을 클릭, 샘플링 볼륨 상자 탯 줄 동맥의 중심에 놓고 스캔/동결 이미징 시작을 누릅니다. 탯 줄 동맥 이미지 수집 하 씨 네 저장 을 클릭 합니다.
      2. 탯 줄 동맥 피크 속도 (UA)를 계산 하기 위해 측정 버튼을 클릭 합니다.
   5. 색 도플러 모드 영상 및 분석
      1. 동일을 사용 하 여 프로젝션 스캔 컬러 버튼을 클릭을 태아 심장의 이미지를 변환기 위치를 조정. 스캔/동결 이미징 및 씨 네 이미지 수집 저장 시작을 누릅니다.
      2. 태아의 심장 박동 (인사)을 계산 하려면 측정값 단추를 클릭 합니다.

4. HPLC 분석

1. 조직 준비
   1. 늦은 임신에서 MNPs 또는 plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX 동등 물)의 단 하나의 복용량을 임신 쥐를 주입 (예., E14.5) 단계 3.1.3에서에서 설명한 대로.
   2. 24 시간 후 240 μ g/몸 무게 (g)에서 avertin의 복 주사 하 여 쥐를 anesthetize. 생쥐는 완전히 마 취 확인 하 발 핀치에 응답을 확인 합니다.
   3. 스프레이 75% 에탄올과 가슴 지역입니다. 심장 관류 (잘라 오른쪽 심 방 및 좌 심 실을 통해 perfuse) 수행 세부^19,20 언바운드 나노 입자를 제거 하는 10 분 동안 차가운 0.9% 염 분의 50 mL에에서 앞에서 설명한.
   4. 댐 안락사 태아와 반응과 Graefe 집게가 위, 그리고 Graefe 조직 겸 자, 해 부를 사용 하 여 수집 하 제왕 섹션을 수행 하 고 조직 분석 전에-80 ° C에서 저장 합니다.
   5. 균질 솔루션 (10%과 염소 산)을 준비 하 고 얼음에 계속. 조직의 약 200 mg을 수집 하 고 각 샘플을 균질 솔루션의 500 μ를 추가. 균질 샘플 30 s, 그리고 반복에 대 한 최고 속도 균질 화기를 사용 하 여이 절차를 두 번.
   6. 4 ° c.에 20 분 14000 × g에서 샘플을 원심 HPLC 유리병에 결과 액체를 전송 및 필터 주사기 0.45 μ m 통해 상쾌한 (약 300 μ)을 필터링 합니다. 샘플 튜브를 주입 autosampler 트레이 넣으십시오.
2. 표준의 준비
   1. 다음 솔루션 모바일 단계에 대 한 준비: 40 mM 칼륨 인산 염기 (pH 4.5)와 이기 (88:12, v/v). 0.45 μ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 하 고 깨끗 한 HPLC 저수지 병 결과 액체를 전송.
      참고: 0.1 M 인산으로 pH를 조정 합니다. 15 분에 대 한 초음파 진동을 사용 하 여 사용 하는 모바일 단계 때마다 이전 드.
   2. 1.5 mL 원심 분리기 관으로 MTX의 10 밀리 그램 무게. 1 M 수산화 나트륨의 1 mL를 추가 합니다.
   3. 소용돌이 MTX까지 고속에서 완전히 녹 인 다.
      참고:이 기본 주식 이며 몇 달 동안-20 ° C에 저장 될 수 있습니다.
   4. 보조 MTX 주식 (500 μ g/mL)를 만들려면 50 μ 모바일 단계의 950 μ에 기본 주식의 희석.
      참고: 사용까지 얼음에 저장 하 고 매일 신선한 준비. 사용 하 여 모바일 단계 표준의 준비에 대 한 샘플 주입 후 서로 다른 솔루션을 혼합의 결과로 봉우리를 피하기 위해 중요 하다.
   5. (표 1) 표준을 만들고 희석 추가 확인 합니다. 얼음에 기준을 저장 하 고 매일 신선한 준비. 표준 직렬 실험 샘플으로 실행 합니다.

번호	최종 농도 (μ g/mL)	500 μ g/mL, μ	모바일 phase(μL)
1	0.5	1	999
2	1	2	998
3	2.5	5	995
4	10	20	980
5	25	50	950
6	50	100	900
7	100	200	800

표 1입니다. 표준 곡선의 MTX에 대 한 준비. MTX 표준 솔루션의 최종 농도 0.5-100에서 μ g/mL.

3. HPLC 계측 및 작업 매개 변수
   참고: 샘플 용 펌프, UV spectrophotometric 검출기를 장착 하는 HPLC 시스템에 분석 되었다 (313 nm), 및 C18 열 (250 × 4.6 m m, 5 μ m 입자 크기).
   1. 시스템에서 공기를 제거 하는 HPLC degasser를 켭니다. 초기 소음을 줄이기 위해 30 분 모바일 단계와 열 평형 흐름을 켭니다.
   2. 열의 온도 25 ° C를 설정 하 고 1 mL/min의 유량에 20 μ 샘플 볼륨을 주입 실행 방법 분석 시작을 클릭 합니다.
   3. 실행 완료 되 면 수동으로 HPLC 급 이기에 모바일 단계를 변경 합니다. 시스템을 보호 하기 위해 약 15 분 동안 실행 합니다.
      참고: 권장된 실행 시간을 다음이 단계를 수행 하려면 실패 손상에서 열 될 수 있습니다.
   4. 정량 분석을 위한 HPLC 시스템 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 표준 MTX 봉우리 아래 영역을 계산 합니다.

결과

이 원고, plCSA BP 활용 된 나노 로드 MTX (plCSA-MNPs) 또는 ICG (plCSA-INPs) 했다 임신 쥐에 정 맥 주입 됩니다. Vivo에서 영상 plCSA INP 주입 후 자 궁 30 분의 지역에서 강한 ICG 신호를 밝혔다. INPs 했다 주로 간, 비장 지역 (그림 1A) 지역화 됩니다. PlCSA-INP 주사 후 48 h, 임신 쥐 ICG 신호 없는 신호와 태 반에만 태아 (그림 1B)에 감지 했다 ?...

토론

이 원고에서 우리 plCSA BP-기반 나노 입자 약물의 태 반 배달 대상에 대 한 효율적인 도구 인지 결정 하기 위한 3-방법 시스템 개요. Vivo에서 이미징 적외선 형광 ICG 신호를 모니터링 하는 데 사용 plCSA BP. 사용의 placental 대상 특이성을 확인 HFUS 및 HPLC, 우리 plCSA BP 활용 된 나노 입자 수에 MTX 제공 효율적으로 시연 합니다 태 반 세포, 태아에 게 하지입니다.

Vivo에서 형...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD-1 mice	Beijing Vital River	201	Female (8-12 week)
Insulin syringe	BD	328421	for IV injection
Ethanol absolute	Sinopharm Chemical	10009218	for nanoparticles synthesis
Soybean lecithin	Avanti Polar Lipids	441601	for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOH	Avanti Polar Lipids	880125	for nanoparticles synthesis
PLGA	Sigma-Aldrich	719897	for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processor	Sonics	VCX130	for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX)	Sigma-Aldrich	V900324	for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG)	Sigma-Aldrich	1340009	for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS)	Hyclone	SH30028.01
IVIS spectrum instrument	Perkin Elmer		for in vivo imaging
Ultrasound transmission gel	Guanggong	ZC4252418	for ultrasound imaging
Isoflurane	Lunan Pharmaceutical	I0040	for maintain the anesthesia
Depilatory cream	Nair	TMG001	for removing fur
40 MHz transducer	VisualSonics	MS550S	for ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging system	VisualSonics	Vevo2100	for ultrasound imaging
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402	for anesthesia
Syringe pump	Mindray	SK-500III	forcardiac perfusion
0.9% saline solution	Meilunbio	MA0083	forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubes	AXYGEN	MCT-150-C
-80 °C freezer	Thermo Fisher Scientific	88600V
Centriguge	Cence	H1650R
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421	for precipitating protein
Homogenizer	SCIENTZ	SCIENTZ-48	for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm)	Millipore	SLHV033RS01
Sodium hydroxide	Sinopharm Chemical	10019763	for solving MTX
HPLC vials	Waters	670650620	for HPLC
Potassium phosphate dibasic	Sinopharm Chemical	20032117	for HPLC
Acetonitrile	JKchemical	932537	for HPLC
C18 column	Waters	186003966	for HPLC
HPLC system	Shimadzu		for HPLC