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Resumo

Descrevemos um sistema que utiliza três métodos para avaliar a segurança e a eficácia da entrega da droga placenta-alvo: no vivo de imagem para monitorar o acúmulo de nanopartículas, ultra-som de alta frequência para monitorar o desenvolvimento placentário e fetal e HPLC para quantificar a entrega da droga ao tecido.

Resumo

Não há tratamentos eficazes existem, atualmente, por complicações de gravidez associada a placenta, e desenvolver estratégias para a entrega de alvo de drogas para a placenta, minimizando efeitos colaterais fetais e maternos continua a ser um desafio. Transportadoras de nanopartículas alvo proporcionam novas oportunidades para tratar anormalidades da placenta. Recentemente demonstramos que um peptídeo sintético placentária sulfato de condroitina A ligação (plCSA-BP) poderia ser usado para guiar as nanopartículas para entregar drogas para a placenta. Neste protocolo, descrevemos detalhadamente um sistema para avaliar a eficiência da entrega da droga para a placenta pela plCSA-BP que emprega três métodos distintos, usados em combinação: na vivo de imagem, ultra-som de alta frequência (HFUS) e alto desempenho cromatografia líquida (HPLC). Usando na vivo da imagem latente, plCSA BP-guiada por nanopartículas foram visualizadas nas placentas de animais vivos, enquanto HFUS e HPLC demonstraram que nanopartículas plCSA-BP-conjugados com eficiência e especificamente entregues metotrexato da placenta. Assim, uma combinação desses métodos pode ser usada como uma ferramenta eficaz para a entrega de alvo de drogas para a placenta e desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para várias complicações na gravidez.

Introdução

Complicações da gravidez placenta-mediada, incluindo pré-eclâmpsia, perda de gravidez, descolamento prematuro da placenta e pequena idade gestacional (SGA), são comuns e levam a substancial morbidade fetal e materna e mortalidade1,2, 3e muito poucas drogas têm provado ser eficaz para tratar a gravidez distúrbios4,5. O desenvolvimento de estratégias para a entrega da droga placenta-alvo mais seletivo e segura durante a gravidez permanece desafiador em terapia com drogas modernas.

Nos últimos anos, vários relatos têm focado a alvo entrega de drogas aos tecidos uteroplacentária por nanopartículas de revestimento com peptídeos ou anticorpos como ferramentas de placenta-alvo. Estes incluem um anticorpo de6 do fator de crescimento epidérmico anti receptor (EGFR), tumor-homing peptídeos (CGKRK e iRGD)7, peptídeos de placenta-alvo8, peptídeos placentários vasculatura-alvo9 e anticorpos contra a receptor de ocitocina10.

Aqui, demonstramos que um peptídeo sintético placentária sulfato de condroitina A ligação (plCSA-BP) pode ser usado para a entrega de alvo de nanopartículas e suas cargas de drogas para a placenta11. As nanopartículas plCSA-BP-guiadas são complementares a uteroplacentária relatada visando métodos porque alvo o trofoblasto da placenta.

Como um método não-invasivo, na vivo a imagem tem sido usada para monitorar a expressão gênica de placenta específicas em ratos12e indocianina verde (ICG) tem sido amplamente utilizada para rastrear nanopartículas usando fluorescência de imagem sistemas13, 14,15. Assim, por via intravenosa injetamos nanopartículas plCSA-BP-conjugados, carregadas com o ICG (plCSA-INPs) para visualizar a distribuição de plCSA-INP em ratos grávidas com um gerador de imagens de fluorescência. Nós, em seguida, por via intravenosa injetado metotrexato (MTX)-carregado plCSA-NPs em ratos grávidos. Ultra-som de alta frequência (HFUS), outro não-invasiva, em tempo real de imagens ferramenta16,17 foi usado para monitorar o desenvolvimento fetal e placentário nos ratos. Finalmente, usamos a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para quantificar a distribuição de MTX na placenta e fetos.

Neste protocolo, descrevemos em detalhe o sistema de três-método usado para avaliar a eficiência da entrega da droga placenta-alvo por nanocarriers plCSA-BP-guiada.

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Protocolo

Todos os experimentos de rato rigorosamente os protocolos (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232), aprovados pelo cuidado Animal e uso Comissão de Shenzhen institutos de tecnologia avançada, da Academia Chinesa de Ciências.

1. síntese de nanopartículas de lipídios-polímero direcionados A placentária sulfato de condroitina

  1. Sintetizar a nanopartículas de lipídios-polímero MTX e ICG-carregado (MNPs e INPs respectivamente) e plCSA-BP-conjugados de nanopartículas (plCSA-MNPs e plCSA-INPs) conforme descrito em detalham em outro lugar18.

2. in vivo da fluorescência Imaging

  1. Preparação de ratos grávidas
    1. Coloque a fêmeas ratos CD-1 (8-12 semanas) com um macho fértil da mesma estirpe em uma gaiola (masculino: feminino = 1:2) na tarde e verifique o vaginal conecta o seguinte manhã. Se for observado um plug vaginal, defina o mouse como embrionário dia 0,5 (E0.5).
    2. Ciclo de ratos grávidas casa sozinhos em um quarto livre de patógeno animal com luz/10 h 14 h escuro e fornecem o acesso livre à comida e água até E14.5.
  2. Injeção intravenosa de nanopartículas
    1. Antes do procedimento, esterilize as nanopartículas por filtração através de um filtro de seringa 0,22 μm. Pese o mouse grávido no E11.5 para determinar a quantidade e volume de injeção de nanopartículas.
      Nota: O volume de injeção de nanopartículas deve ser inferior a 1% (volume/peso) do peso do corpo do mouse grávido. Por exemplo, o volume de injeção de nanopartículas deve ser menos de 0,25 mL em um rato de 25 g.
    2. Para dilatar a veia da cauda, aquecer a cauda por 5-10 min com uma almofada de aquecimento.
    3. Antes da injeção, Aspire o INPs ou plCSA-INPs em uma seringa de insulina de 28 g.
    4. Transferi o mouse grávido para um dispositivo de exploração que restringe o mouse ao permitir o acesso para a veia da cauda. Limpe o rabo com um algodão embebido em álcool. Em seguida, insira a seringa na veia da cauda. Lentamente injete o INPs ou plCSA-INPs (equivalente a 5 mg/kg ICG) com pressão durante 5 a 10 s.
      Nota: Pare de injetar se uma bolha aparece na cauda, porque este resultado indica que a agulha não está na veia. As seringas não devem ser compartilhadas entre ratos para minimizar a transmissão da doença e a contaminação cruzada.
    5. Registrar o tempo de injeção. Enquanto isso, exerça uma ligeira pressão para o local da injeção até o sangramento parar, que normalmente demora 30-60 s.
  3. Imagem latente na vivo
    1. 30 min após a injeção, os ratos grávidas usando a fluorescência na vivo , sistema de imagem da imagem.
    2. Anestesiar os ratos grávidas com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min e isoflurano em 2-4% em uma câmara de associado da unidade de anestesia e verificar completa anestesia pelo lento e respiração regular. Em seguida, movê-los para a câmara de imagem. Coloque os ratos anestesiados grávidos dentro da câmara de imagem, mantendo os animais em posição supina.
    3. Coloque um cone de nariz sobre a boca e o nariz para permitir que a inalação de 1-2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min para manter a anestesia.
    4. Selecione parâmetros 2D-fluorescência e fotográficos para os sinais de fluorescência ICG da imagem. Definir a exposição a auto e os comprimentos de onda de excitação/emissão de 710/820 nm.
    5. No final do processo de imagem, desligue o influxo de isoflurano para parar a anestesia e voltar os ratos grávidas cuidadosamente suas gaiolas.
    6. 48 h após a injeção de nanopartículas, anestesiar os ratos grávidos com isofluorano e então sacrificar a represa por deslocamento cervical. Recolha os fetos e placentas usando pinça Graefe, Graefe fórceps do tecido e tesouras de dissecação.
    7. Coloque as placentas e fetos na câmara de imagem e imagem usando o método descrito na etapa 2.3.4.

3. HFUS avaliação do desenvolvimento embrionário

  1. Modelos animais
    1. Obter e preparar os ratos grávidas, conforme descrito no passo 2.1.
    2. Use HFUS para ratos grávidas imagem no E 6.5 (protocolos 3.2 e 3.3.3). Primeiro, confirmar a gravidez através da visualização de embriões no dia E6.5 e em seguida, alocar aleatoriamente os ratos grávidas em três grupos: o grupo MNP, grupo plCSA-MNP e grupo fosfato-salino (PBS).
    3. Injete PBS, MNPs ou plCSA-MNPs (1 mg/kg MTX equivalente) as veias de cauda dos ratos grávidas todos os dias, começando em E6.5, conforme descrito no passo 2.2.
  2. Preparação para a imagem latente
    1. 24 h após a injeção de nanopartículas, os ratos grávidas usando o HFUS sistema de imagem da imagem.
    2. Anestesia os ratos grávidas conforme descrito na etapa 2.3.2. Ativar os controles de temperatura integrado da plataforma de geração de imagens e pré-aqueça a plataforma-37-42 ° C. Fixe os ratos grávidas em posição supina na plataforma utilizando a fita.
    3. Lugar do cone de nariz ligado à unidade de anestesia sobre o focinho. Aplica 2% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1,0 L/min para manter constante anestesia.
    4. Quimicamente, remova pelos do abdômen usando um creme depilatório. Acabar com o creme residual cuidadosamente com gaze embebida em água e depois revestir o abdômen com acústico acoplamento gel.
  3. Procedimento de imagem
    1. Coloque o transdutor de 40 MHz no braço mecânico.
    2. Ajuste a posição do transdutor para obter imagens longitudinais do feto e placenta com a região de interesse localizado na zona focal.
    3. Análise e imagem modo-B
      Nota: Ver filme 1.
      1. Clique no botão Modo-B e abaixe o transdutor sobre o abdômen até o feto e a placenta entram em vista. Pressione Scan/Freeze para iniciar/parar de imagem, pressione Cine armazenar para armazenar o laço da cinematografia e pressione Frame armazenar para armazenar imagens do quadro.
      2. Clique no botão de medida para analisar o comprimento do saco gestacional (GS), comprimento de garupa fetal coroa (CRL), diâmetro biparietal (DBP), circunferência abdominal (AC), diâmetro da placenta (PD) e espessura placentária (PT).
    4. Análise e imagens Doppler PW
      Nota: Ver filme 1.
      1. Usando o mesmo digitalizar projeção, clique no botão PW , coloque a caixa de volume de amostragem no centro da artéria umbilical e pressione Scan/Freeze para iniciar a geração de imagens. Clique em armazenar Cine para coletar imagens de artéria umbilical.
      2. Clique no botão de medida para calcular a velocidade de pico de artéria umbilical (UA).
    5. Análise e imagem latente de modo Doppler cor
      1. Usando a mesma projeção de digitalizar, clique no botão cor e ajustar a posição do transdutor para obter imagens do coração fetal. Pressione Scan/congelamento para iniciar a imagem latente e Cine armazenar para coletar imagens.
      2. Clique no botão de medida para calcular a frequência cardíaca fetal (HR).

4. HPLC análise

  1. Preparação do tecido
    1. Injetar os ratos grávidas com uma única dose de MNPs ou plCSA-MNPs (equivalente MTX de 1 mg/kg) no final da gravidez (ex., E14.5) conforme descrito na etapa 3.1.3.
    2. Após 24h, anestesia os ratos por uma injeção intraperitoneal de avertin em 240 μg/peso (g). Não certifique-se de nenhuma resposta para uma pitada de pé para verificar que os ratos são totalmente anestesiados.
    3. Pulverize a área do peito com 75% de etanol. Executar a perfusão cardíaca (cortar os átrios direito e perfundir através do ventrículo esquerdo) conforme descrito em detalhe19,20 com 50 mL de soro fisiológico 0,9% gelada por 10 min remover nanopartículas desacopladas.
    4. Eutanásia em barragem. Realizar uma cesariana para recolher os fetos e placentas usando pinça Graefe, dissecando a tesoura e pinça de tecido Graefe e armazenar os tecidos a-80 ° C, antes da análise.
    5. Preparar a solução de homogeneização (ácido perclórico a 10%) e manter-se no gelo. Coletar aproximadamente 200 mg de tecido e adicionar 500 μL de solução de homogeneização para cada amostra. Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador a toda a velocidade para 30 s e repita este procedimento duas vezes.
    6. Centrifugar as amostras a 14.000 × g por 20 min a 4 ° C. Filtrar o sobrenadante (aproximadamente 300 μL) através de um filtro de seringa 0,45 μm e transferir o líquido resultante para um frasco HPLC. Coloque os frascos de amostra em uma bandeja de mostruário para injeção.
  2. Elaboração de normas
    1. Prepare a seguinte solução para a fase móvel: 40mm potássio Fosfato dibásico (pH 4.5) e acetonitrila (88:12, v/v). Filtrar a solução através de um filtro de seringa de tamanho de poros de 0,45 μm e transferir o líquido resultante para uma garrafa de reservatório limpa HPLC.
      Nota: Ajuste o pH com ácido fosfórico a 0,1 M. Use vibração ultra-sônica por 15 min para desgaseificar a fase móvel cada vez antes de usar.
    2. Pese 10 mg de MTX em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 1 mL de hidróxido de sódio 1 M.
    3. Vórtice em alta velocidade até o MTX se dissolva completamente.
      Nota: Este é o estoque principal e pode ser armazenado a-20 º C durante vários meses.
    4. Para criar o estoque MTX secundário (500 μg/mL), dilua 50 μL do regulador primário em 950 μL da fase móvel.
      Nota: Guarde no gelo até o uso e preparar fresca diariamente. É importante usar a fase móvel para a elaboração de normas para evitar picos resultantes da mistura de diferentes soluções após a injeção da amostra.
    5. Fazer mais diluições para criar as normas (tabela 1). Armazenar as normas no gelo e preparar fresca diariamente. Execute as normas em série com as amostras experimentais.
NúmeroConcentração final (μg/mL)Padrão, μL 500 μg/mLPhase(μL) móvel
10,51999
212998
32.55995
41020980
52550950
650100900
7100200800

Tabela 1. Preparação da curva de calibração para MTX. A concentração final da solução padrão de MTX é de 0,5-100 μg/mL.

  1. Instrumentação de HPLC e parâmetros de operação
    Nota: As amostras foram analisadas em um sistema HPLC equipado com uma bomba de solvente, um detector espectrofotométrico UV (313 nm) e uma coluna C18 (250 × 4. 6mm, tamanho de partícula 5 μm).
    1. Ligue o desgaseificador HPLC para retirar o ar do sistema. Ative o fluxo, desenroscada a coluna com a fase móvel por 30 min reduzir o ruído da linha de base.
    2. Regule a temperatura da coluna, a 25 ° C, injetar 20 volumes de amostra μL em uma taxa de fluxo de 1 mL/min e clique no Método execute para iniciar a análise.
    3. Quando as pistas estiverem completas, altere manualmente a fase móvel para acetonitrila grau HPLC. Executado por aproximadamente 15 min proteger o sistema.
      Nota: Execute esta etapa após o tempo de execução recomendado pode resultar em danos à coluna.
    4. Para análise quantitativa, calcule as áreas sob os picos MTX padrão de interesse usando o software de sistema HPLC.

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Resultados

Neste manuscrito, carregado com MTX (plCSA-MNPs) ou ICG (plCSA-INPs) plCSA-BP-conjugados de nanopartículas foram injetadas por via intravenosa ratos grávidas. Imagem latente na vivo revelou sinais ICG fortes na região do útero 30 min após a injeção de plCSA-INP. O INPs foram localizado principalmente na região do fígado e baço (figura 1A). A 48 h após a injeção de plCSA-INP, ratos grávidas foram sacrificados, revelando sinais ICG soment...

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Discussão

Neste manuscrito, descrevem um sistema de três-método para determinar se plCSA BP-guiada por nanopartículas são uma ferramenta eficiente para o direcionamento a entrega de drogas para a placenta. O uso do na vivo de imagem para monitorar o sinal infravermelho de ICG fluorescente confirmou a especificidade de direcionamento da placenta de plCSA-BP usando HFUS e HPLC, demonstrámos que nanopartículas plCSA-BP-conjugados com eficiência podem entregar MTX apenas para o células da placenta, não para o feto.

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Divulgações

X.F. e B.Z. são inventores no pedido de patente PCT/CN2017/108646 enviado por SIAT que abrange um método de entrega de drogas específicas de placenta e sua aplicação. Todos os outros autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais (81771617) e a ciência Natural Fundação da província de Guangdong (2016A030313178) concedido a X.F.; uma concessão da Shenzhen básica fundo de investigação (JCYJ20170413165233512) atribuído a X.F; e a Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil & desenvolvimento humano do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R01HD088549 (o conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, o funcionário vista para o National Institutes of Health) de N.N.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
CD-1 miceBeijing Vital River201Female (8-12 week)
Insulin syringeBD328421for IV injection
Ethanol absoluteSinopharm Chemical10009218for nanoparticles synthesis
Soybean lecithinAvanti Polar Lipids441601for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125for nanoparticles synthesis
PLGASigma-Aldrich719897for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processorSonicsVCX130for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX)Sigma-AldrichV900324for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG)Sigma-Aldrich1340009for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS)HycloneSH30028.01
IVIS spectrum instrumentPerkin Elmerfor in vivo imaging
Ultrasound transmission gelGuanggongZC4252418for ultrasound imaging
IsofluraneLunan PharmaceuticalI0040for maintain the anesthesia
Depilatory creamNairTMG001for removing fur
40 MHz transducerVisualSonicsMS550Sfor ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging systemVisualSonicsVevo2100for ultrasound imaging
AvertinSigma-AldrichT48402for anesthesia
Syringe pumpMindraySK-500IIIforcardiac perfusion
0.9% saline solutionMeilunbioMA0083forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubesAXYGENMCT-150-C
-80 °C freezerThermo Fisher Scientific88600V
CentrigugeCenceH1650R
Perchloric acidSigma-Aldrich311421for precipitating protein
HomogenizerSCIENTZSCIENTZ-48for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm)MilliporeSLHV033RS01
Sodium hydroxideSinopharm Chemical10019763for solving MTX
HPLC vialsWaters670650620for HPLC
Potassium phosphate dibasicSinopharm Chemical20032117for HPLC
AcetonitrileJKchemical932537for HPLC
C18 columnWaters186003966for HPLC
HPLC systemShimadzufor HPLC

Referências

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