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摘要

我们描述一个系统, 利用三方法来评估胎盘靶向药物的安全性和有效性:在体内成像监测纳米微粒积累, 高频超声监测胎盘和胎儿发育, 并以 HPLC 量化药物对组织的传递。

摘要

目前尚无与胎盘相关的妊娠并发症的有效治疗方法, 并制定了靶向胎盘提供药物的战略, 同时尽量减少胎儿和产妇的副作用仍然具有挑战性。靶向纳米微粒载体为治疗胎盘疾病提供了新的机会。我们最近证明, 合成胎盘硫酸软骨素 a 结合肽 (plCSA BP) 可以用来指导纳米粒子向胎盘提供药物。在本议定书中, 我们详细描述了一个系统, 以评估药物交付胎盘由 plCSA BP, 采用三种不同的方法结合使用:在体内成像, 高频超声 (HFUS), 和高性能液相色谱法 (HPLC)。plCSA-bp 制导纳米粒子在活体动物胎盘中的应用, HFUS 和 HPLC 表明, plCSA-bp-共轭纳米粒子有效地将甲氨蝶呤送到胎盘。因此, 这些方法的组合可以作为一个有效的工具, 为靶向胎盘提供药物和制定新的治疗策略, 一些妊娠并发症。

引言

胎盘介导的妊娠并发症, 包括先兆子痫、妊娠丢失、胎盘早剥和小胎龄 (SGA), 是常见的, 导致大量的胎儿和产妇发病率和死亡率1,2, 3, 很少有药物被证明是有效的治疗妊娠疾病4,5。在怀孕期间, 制定更有选择性和更安全的胎盘靶向药物的策略在现代药物治疗中仍然具有挑战性。

近年来, 几份报告着重于以胎盘为靶的工具, 用多肽或抗体包衣纳米微粒, 将药物子宫胎盘组织定向交付。这些包括抗表皮生长因子受体 (EGFR)6抗体, 肿瘤自导肽 (CGKRK 和 iRGD)7, 胎盘靶向肽8, 胎盘血管靶向肽9和抗体对催产素受体10。

在这里, 我们证明, 合成胎盘硫酸软骨素 a 结合肽 (plCSA BP) 可用于靶向交付纳米微粒及其药物有效载荷的胎盘11。plCSA-BP 制导纳米粒子与报告的子宫胎盘靶向方法是互补的, 因为它们靶向胎盘滋养层。

作为一种非侵入性的方法,在体内成像已被用来监测12小鼠胎盘特异基因的表达, 吲哚菁绿 () 已被广泛应用于用荧光成像系统跟踪纳米粒子13, 14,15。因此, 我们静脉注射注射 plCSA-BP-共轭纳米粒子负载的 plCSA-修订为期三), 以可视化的 plCSA, 在怀孕小鼠与荧光成像仪的分布。然后, 我们静脉注射注射甲氨蝶呤 (MTX) 加载 plCSA 核动力源到怀孕的小鼠。高频超声 (HFUS), 另一种无创, 实时成像工具16,17被用来监测胎儿和胎盘发育的小鼠。最后, 我们用高效液相色谱 (HPLC) 定量分析了甲氨蝶呤在胎盘和胎儿中的分布情况。

在本议定书中, 我们详细描述了用 plCSA-BP 引导 nanocarriers 评估胎盘靶向药物传递效率的三方法系统。

研究方案

所有鼠标实验严格遵循的协议 (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) 批准的动物护理和使用委员会的深圳先进技术研究院, 中国科学院。

1. 胎盘硫酸软骨素 A 靶向脂质高分子纳米粒的合成

  1. 将甲氨喋呤-和微球负载的脂质高分子纳米粒子 (MNPs 和修订为期三) 和 plCSA-BP-共轭纳米粒子 (plCSA MNPs 和 plCSA 修订为期三) 进行了详细的描述, 其他18。

2.体内荧光成像

  1. 孕鼠的制备
    1. 将雌性 CD-1 小鼠 (8-12 周) 与一笼中同一株 (男: female=1:2) 的肥沃雄性保持在下午, 并检查第二天早晨的阴道插头。如果观察到阴道插头, 将鼠标定义为胚胎日 0.5 (E0.5)。
    2. 在没有病原体的动物室里单独饲养怀孕的老鼠, 14 小时 light/10 h 黑暗循环, 并提供免费的食物和水, 直到 E14.5。
  2. 静脉注射纳米微粒
    1. 在手术前, 通过0.22 微米的注射器过滤器对纳米微粒进行消毒。在 E11.5 中对怀孕的老鼠进行称量, 以确定纳米微粒注射液的数量和体积。
      注: 纳米颗粒注射液体积应小于 1% (体积/重量) 的怀孕小鼠的体重。例如, 在25克的老鼠中, 纳米粒子的注入量应该小于0.25 毫升。
    2. 为了扩大尾部静脉, 用加热垫将尾部预热5-10 分钟。
    3. 注射前, 将修订为期三或 plCSA 修订为期三吸入28克胰岛素注射器。
    4. 将怀孕的老鼠转移到抑制老鼠的手持装置上, 同时允许进入尾部静脉。用酒精拭子清洁尾部。然后将注射器插入尾部静脉。慢慢地注射修订为期三或 plCSA-修订为期三 (5 毫克/千克当量), 甚至压力超过5-10 秒。
      注: 如果尾部出现水泡, 则停止注射, 因为此结果表明针头不在静脉内。小鼠不应共享注射器, 以减少疾病传播和交叉污染。
    5. 记录注射时间。同时, 对注射部位施加温和压力, 直至出血停止, 通常需要30-60 秒。
  3. 体内成像
    1. 注射后30分钟, 用体内荧光成像系统对怀孕小鼠进行图像成像。
    2. 麻醉妊娠小鼠, 其氧流速为1.0 升/分和异氟醚, 2-4% 在麻醉单位的相关室, 并通过缓慢和定期呼吸验证完全麻醉。然后, 将它们移动到成像室。将麻醉的怀孕小鼠放入成像室, 使动物处于仰卧位。
    3. 将鼻锥放在嘴和鼻子上, 允许吸入1-2% 异氟醚, 氧气流速为1.0 升/分钟, 以维持麻醉。
    4. 选择2维荧光和照相参数来图像的干扰荧光信号。设置曝光到自动和激发/发射波长到710/820 毫微米。
    5. 在成像过程结束时, 关闭异氟醚的流入以停止麻醉, 并小心地将怀孕的老鼠送回笼子里。
    6. 48 h 纳米微粒注射后, 麻醉与 isofluorane 的怀孕小鼠, 然后通过颈椎脱位牺牲大坝。使用 Graefe 钳、Graefe 组织钳和解剖剪刀收集胎儿和胎盘。
    7. 将胎盘和胎儿放入成像室, 并使用步骤2.3.4 中描述的方法进行图像处理。

3. HFUS 对胚胎发育的评价

  1. 动物模型
    1. 如步骤2.1 所述, 获得并准备怀孕小鼠。
    2. 使用 HFUS 在 E 6.5 (3.2 和 3.3.3) 对怀孕小鼠进行图像处理。首先, 通过在日 E6.5 上可视化胚胎来确认怀孕, 然后将怀孕的小鼠随机分配到三组: 自然人流动组、plCSA-自然人流动组和磷酸盐缓冲盐 (PBS) 组。
    3. 将 PBS、MNPs 或 plCSA-MNPs (1 毫克/千克甲氨蝶呤当量) 注射到怀孕小鼠的尾脉中, 每隔一天从 E6.5 开始, 如步骤2.2 所述。
  2. 成像准备
    1. 24小时注射纳米微粒后, 用 HFUS 成像系统对怀孕小鼠进行图像处理。
    2. 麻醉在步骤2.3.2 中描述的怀孕小鼠。打开成像平台的集成温度控制, 将平台预热至摄氏37-42 摄氏度。用胶带将怀孕小鼠放在平台的仰卧位。
    3. 将鼻锥与麻醉装置连接在鼻子上。应用2% 异氟醚, 氧气流量为1.0 升/分, 以保持稳定的麻醉。
    4. 用脱毛膏从腹部化学去除毛发。用浸泡过的纱布彻底擦拭残留奶油, 然后用声学耦合凝胶将腹部涂上。
  3. 成像过程
    1. 将 40 MHz 传感器放在机械臂中。
    2. 调整换能器位置, 获取胎儿和胎盘的纵向图像, 该区域位于焦点区域。
    3. B 型成像与分析
      注: 见电影 1。
      1. 单击B 模式按钮, 并降低在腹部的传感器, 直到胎儿和胎盘进入视野。按下扫描/冻结以启动/停止成像, 按电影商店存储电影循环, 并按帧存储存储帧图像。
      2. 单击 "测量" 按钮以分析妊娠囊长度 (GS)、胎冠尾部长度 (CRL)、双顶直径 (BPD)、腹围 (AC)、胎盘直径 (PD) 和胎盘厚度 (PT)。
    4. 多普勒成像与分析
      注: 见电影 1。
      1. 使用相同的扫描投影, 单击 "密码" 按钮, 将取样音量框放置在脐动脉的中心, 然后按扫描/冻结以启动成像。点击电影商店收集脐动脉图像。
      2. 单击 "测量" 按钮计算脐动脉峰值速度 (UA)。
    5. 彩色多普勒模式成像与分析
      1. 使用相同的扫描投影, 单击颜色按钮并调整换能器位置以获得胎儿心脏的图像。按扫描/冻结启动图像和电影商店收集图像。
      2. 单击 "测量" 按钮计算胎儿心率 (HR)。

4. HPLC 分析

  1. 组织准备
    1. 在妊娠晚期 (e.、E14.5) 中, 按步骤3.1.3 中所述, 向怀孕小鼠注射一剂 MNPs 或 plCSA-MNPs (1 毫克/千克甲氨蝶呤当量)。
    2. 24小时后, 麻醉腹腔注射 avertin 240 微克/体重 (g)。确保没有对脚捏的反应, 以验证小鼠是完全麻醉。
    3. 用75% 乙醇喷洒胸部区域。进行心脏灌注 (切开右心房和灌注通过左心室), 如前所述详细19,20与50毫升冰冷0.9% 生理盐水10分钟, 以消除未绑定纳米粒子。
    4. 弄死水坝。执行剖宫产, 收集胎儿和胎盘使用 Graefe 钳, 解剖剪刀, Graefe 组织钳, 并存储在-80 °c 的组织在分析之前。
    5. 准备均匀溶液 (10% 高氯酸), 并保持冰。收集大约200毫克的组织, 并添加 500 ul 均匀化溶液的每个样品。融汇的样品使用一个均质机全速三十年代, 并重复此过程两次。
    6. 离心样品在1.4万×g 20 分钟在4°c。通过0.45 微米的注射器过滤器过滤上清 (约 300 ul), 并将产生的液体转移到 HPLC 瓶中。将样品瓶放入 autosampler 托盘中注射。
  2. 标准的编制
    1. 为移动阶段准备以下解决方案:40 毫米磷酸钾二元 (pH 4.5) 和乙腈 (88:12, v/v)。过滤解决方案通过0.45 微米孔径注射器过滤器, 并将产生的液体转移到一个干净的 HPLC 储集瓶。
      注: 用0.1 米磷酸调节 pH 值。使用超声波振动15分钟, 以德加的移动相在每次使用之前。
    2. 将10毫克的甲氨喋呤重分为1.5 毫升离心管。加入1毫升1米氢氧化钠。
    3. 高速涡流, 直到甲氨蝶呤完全溶解。
      注: 这是主要库存, 可以储存在-20 °c 几个月。
    4. 要创建二甲喋呤的股票 (500 微克/毫升), 稀释 50 ul 的主要库存在 950 ul 的移动阶段。
      注: 储存在冰上, 直到使用, 并准备新鲜的每日。重要的是使用移动阶段来制定标准, 以避免在注射样品后混合不同溶液产生的峰值。
    5. 进一步稀释制定标准 (表 1)。把标准储存在冰上, 每天准备新鲜的。用实验样品在系列中运行标准。
数量最终浓度 (微克/毫升)500微克/毫升标准, ul移动阶段 (ul)
10。51999
212998
32。55995
41020980
52550950
650100900
7100200800

表1。制备甲氨蝶呤标准曲线.甲氨蝶呤标准溶液的最终浓度为 0.5-100 微克/毫升。

  1. 高效液相色谱仪操作参数
    注: 用溶剂泵、紫外分光光度计 (313 nm) 和 C18 柱 (250×4.6 毫米、5微米粒径) 的 HPLC 系统对样品进行了分析。
    1. 打开高效液相色谱 degasser, 从系统中去除空气。打开该流, 用移动相平衡该列以减少基线噪音30分钟。
    2. 将该列的温度设置为25摄氏度, 以1毫升/分钟的流速注入 20 ul 样品卷, 然后单击Run 方法开始分析。
    3. 当运行完成后, 手动将移动相转换为 HPLC 级乙腈。运行约15分钟以保护系统。
      注意: 如果在建议的运行时间之后不执行此步骤, 可能会导致列损坏。
    4. 为了定量分析, 使用 HPLC 系统软件计算出标准的氨蝶呤峰值的区域。

结果

在这篇手稿中, plCSA-BP-共轭纳米粒子负载甲氨蝶呤 (plCSA MNPs) 或一组 (plCSA 修订为期三) 被静脉注射到怀孕小鼠。体外成像显示, 在 plCSA 注射30分钟后, 子宫区域内有较强的干扰信号。修订为期三主要定位于肝脾区 (图 1A)。在 plCSA 注射后48小时, 怀孕小鼠被牺牲, 只在胎盘中暴露了干扰信号, 而胎儿没有信号可检测 (图 1B)。

...

讨论

在这篇手稿中, 我们概述了一个三方法系统, 以确定是否 plCSA-BP 制导纳米粒子是一个有效的工具, 以提供药物到胎盘。利用活体成像技术监测红外荧光干扰信号, 证实了 plCSA 的胎盘靶向特异性. 采用 HFUS 和 HPLC 法, 证明了 plCSA-bp 共轭纳米粒子能有效地将氨蝶呤输送到胎盘细胞, 而不是胎儿。

在活体荧光成像实验中, 孕鼠的妊娠年龄是重要的。胎盘在 E9.5

披露声明

范和 B.Z. 是 SIAT 提出的专利申请 PCT/CN2017/108646 的发明者, 涵盖了胎盘特异的药物传递方法及其应用。所有其他作者声明他们没有竞争的兴趣。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金 (81771617) 和广东省自然科学基金 (2016A030313178) 授予范的赠款的支持;深圳市基础研究基金 (JCYJ20170413165233512) 授予 x F 的补助金;和尤尼斯肯尼迪美国国立卫生研究院儿童健康 & 人类发展研究所授予编号 R01HD088549 (内容完全由作者负责, 不一定代表官方国家卫生研究院) 对 N.N. 的看法

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
CD-1 miceBeijing Vital River201Female (8-12 week)
Insulin syringeBD328421for IV injection
Ethanol absoluteSinopharm Chemical10009218for nanoparticles synthesis
Soybean lecithinAvanti Polar Lipids441601for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125for nanoparticles synthesis
PLGASigma-Aldrich719897for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processorSonicsVCX130for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX)Sigma-AldrichV900324for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG)Sigma-Aldrich1340009for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS)HycloneSH30028.01
IVIS spectrum instrumentPerkin Elmerfor in vivo imaging
Ultrasound transmission gelGuanggongZC4252418for ultrasound imaging
IsofluraneLunan PharmaceuticalI0040for maintain the anesthesia
Depilatory creamNairTMG001for removing fur
40 MHz transducerVisualSonicsMS550Sfor ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging systemVisualSonicsVevo2100for ultrasound imaging
AvertinSigma-AldrichT48402for anesthesia
Syringe pumpMindraySK-500IIIforcardiac perfusion
0.9% saline solutionMeilunbioMA0083forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubesAXYGENMCT-150-C
-80 °C freezerThermo Fisher Scientific88600V
CentrigugeCenceH1650R
Perchloric acidSigma-Aldrich311421for precipitating protein
HomogenizerSCIENTZSCIENTZ-48for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm)MilliporeSLHV033RS01
Sodium hydroxideSinopharm Chemical10019763for solving MTX
HPLC vialsWaters670650620for HPLC
Potassium phosphate dibasicSinopharm Chemical20032117for HPLC
AcetonitrileJKchemical932537for HPLC
C18 columnWaters186003966for HPLC
HPLC systemShimadzufor HPLC

参考文献

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