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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un sistema che utilizza tre metodi per valutare la sicurezza e l'efficacia della somministrazione di farmaci mirati placenta: in vivo imaging per monitorare l'accumulo delle nanoparticelle, ultrasuono ad alta frequenza per monitorare lo sviluppo placenta e fetale e HPLC per quantificare la consegna della droga al tessuto.

Abstract

Nessun trattamenti efficaci attualmente esistenti per le complicazioni di gravidanza placenta-collegata, e lo sviluppo di strategie per la somministrazione mirata di farmaci alla placenta, riducendo al minimo gli effetti collaterali materni e fetali rimane impegnativo. I vettori delle nanoparticelle mirate fornire nuove opportunità per trattare i disordini placentari. Recentemente abbiamo dimostrato che un peptide sintetico placentare Condroitin solfato A associazione (plCSA-BP) potrebbe essere usato per guidare le nanoparticelle per consegnare i farmaci alla placenta. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente un sistema per valutare l'efficienza di consegna della droga alla placenta di plCSA-BP che impiega tre metodi distinti utilizzati in combinazione: in vivo imaging, ultrasuono ad alta frequenza (HFUS) e ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC). Utilizzo in vivo imaging, plCSA-BP-guidata nanoparticelle sono state visualizzate in placente di animali vivi, mentre HFUS e HPLC ha dimostrato che nanoparticelle plCSA-BP-coniugato in modo efficiente e in particolare consegnato metotrexato alla placenta. Così, una combinazione di questi metodi può essere utilizzata come strumento efficace per la somministrazione mirata di farmaci alla placenta e lo sviluppo di nuove strategie di trattamento per diverse complicazioni di gravidanza.

Introduzione

Complicazioni di gravidanza placenta-mediata, tra cui pre-eclampsia, la perdita di gravidanza, distacco della placenta e piccola età gestazionale (SGA), sono comuni e portare a sostanziale morbilità materna e fetale e mortalità1,2, 3e molto pochi farmaci hanno dimostrato di essere efficace per il trattamento di gravidanza disturbi4,5. Lo sviluppo di strategie per la consegna di droga placenta-mirati più selettivi e più sicura durante la gravidanza rimane impegnativo nella terapia farmacologica moderna.

Negli ultimi anni, parecchi rapporti sono concentrati sulla somministrazione mirata di farmaci di uteroplacental tessuti di rivestimento di nanoparticelle con peptidi o anticorpi come strumenti di targeting per placenta. Questi includono un anticorpo di anti-fattore di crescita recettore (EGFR)6 , tumore-homing peptidi (CGKRK e iRGD)7, placenta-mirato peptidi8, peptidi di targeting per sistema vascolare placentare9 e gli anticorpi contro il L'ossitocina del ricevitore10.

Qui, dimostriamo che un peptide sintetico placentare Condroitin solfato A associazione (plCSA-BP) può essere utilizzato per la somministrazione mirata di nanoparticelle e loro carichi di droga di placenta11. Le nanoparticelle plCSA-BP-guidati sono complementari alla uteroplacental segnalati metodi di targeting, perché prendono di mira il trofoblasto placenta.

Come un metodo non invasivo, in vivo imaging è stato utilizzato per monitorare l'espressione genica placenta-specifica in topi12e verde di indocianina (ICG) è stato ampiamente utilizzato per tenere traccia di nanoparticelle utilizzando sistemi13, di formazione immagine di fluorescenza 14,15. Così, abbiamo iniettato per via endovenosa plCSA-BP-coniugato nanoparticelle caricate con ICG (plCSA-INPs) per visualizzare la distribuzione di plCSA-INP in topi incinta con un imager di fluorescenza. Abbiamo quindi iniettato per via endovenosa di methotrexate (MTX)-caricato plCSA-NPs in topi incinti. L'ultrasuono ad alta frequenza (HFUS), un altro non-invasiva, in tempo reale strumento16,di imaging17 è stato utilizzato per monitorare lo sviluppo fetale e placenta nei topi. Infine, abbiamo usato ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) per quantificare la distribuzione di MTX in placente e feti.

In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente il sistema di tre-metodo utilizzato per valutare l'efficienza di consegna della droga placenta-mirati da nanovettori plCSA-BP-guidata.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti del mouse seguito rigorosamente i protocolli (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Accademia cinese delle scienze.

1. sintesi di nanoparticelle mirate A lipido-polimero placentare Condroitin solfato

  1. Sintetizzare MTX - e ICG-caricati del lipido-polimero nanoparticelle (MNPs e INPs rispettivamente) e nanoparticelle plCSA-BP-coniugato (plCSA-MNPs e plCSA-INPs) come descritto dettaglio altrove18.

2. in vivo Imaging di fluorescenza

  1. Preparazione dei topi incinto
    1. Posizionare i topi femminili CD-1 (8-12 settimane) con un maschio fertile dello stesso ceppo in una gabbia (maschio: femmina = 1:2) nel pomeriggio e controllo vaginale spine la seguente mattina. Se un plug vaginale è osservato, definire il mouse come giorno embrionale 0.5 (0.5).
    2. Topi casa incinto da sola in una stanza senza agente patogeno animale con una h di luce/10 h 14 scuro ciclo e forniscono l'accesso gratuito per cibo e acqua fino e 14.5.
  2. Iniezione endovenosa di nanoparticelle
    1. Prima della procedura, è necessario sterilizzare le nanoparticelle mediante filtrazione attraverso un filtro di 0,22 μm siringa. Pesare il mouse incinto a E11.5 per determinare la quantità e il volume di iniezione delle nanoparticelle.
      Nota: Il volume di iniezione di nanoparticella dovrebbe essere meno dell'1% (peso/volume) del peso corporeo del mouse incinto. Ad esempio, il volume di iniezione di nanoparticella dovrebbe essere inferiore a 0,25 mL in un mouse di 25 g.
    2. Per dilatare la vena della coda, caldo la coda per 5-10 min con un rilievo di riscaldamento.
    3. Prima dell'iniezione, aspirare l'INPs o plCSA-INPs in una siringa da insulina 28 g.
    4. Trasferire il mouse incinto per un dispositivo che trattiene il mouse, consentendo un accesso alla vena della coda. Pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool. Quindi inserire la siringa nella vena caudale. Iniettare lentamente l'INPs o plCSA-INPs (equivalente ICG di 5mg/kg) con pressione uniforme sopra 5-10 s.
      Nota: Interrompere l'iniezione se un blister appare sulla coda perché questo risultato indica che l'ago non è nella vena. Siringhe non devono essere condivise tra topi per minimizzare la trasmissione di malattia e la contaminazione incrociata.
    5. Registrare il tempo di iniezione. Nel frattempo, applicare una leggera pressione al sito di iniezione fino a quando l'emorragia si ferma, che richiede normalmente 30-60 s.
  3. In vivo imaging
    1. 30 min dopo l'iniezione, i topolini incinto usando la fluorescenza in vivo imaging sistema di immagine.
    2. Anestetizzare i topi incinto con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min e isoflurano al 2-4% in un alloggiamento associato dell'unità anestesia e verificare l'anestesia completo di lento e respiro regolare. Quindi, spostarli nella camera di imaging. Posizionare i topi anestetizzati incinto nella camera di imaging, tenere gli animali in posizione supina.
    3. Posizionare un cono di naso sopra la bocca e il naso per consentire l'inalazione di isoflurane 1-2% con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min per mantenere l'anestesia.
    4. Selezionare parametri 2D-fluorescenza e fotografici all'immagine i segnali di fluorescenza di ICG. Impostare l'esposizione di auto e le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 710/820 nm.
    5. Al termine della procedura di imaging, spegnere l'afflusso di isoflurane per interrompere l'anestesia e attentamente tornare i topi incinto loro gabbie.
    6. 48 h dopo l'iniezione delle nanoparticelle, anestetizzare i topi incinto con isofluorano e quindi sacrificare la diga di dislocazione cervicale. Raccogliere i feti e placente utilizzando Graefe pinze, pinze di Graefe e forbici di dissezione.
    7. Posizionare le placente e feti nella camera di imaging e immagine utilizzando il metodo descritto al punto 2.3.4.

3. HFUS valutazione dello sviluppo embrionale

  1. Modelli animali
    1. Ottenere e preparare i topi incinto come descritto al punto 2.1.
    2. Utilizzare HFUS ai topi incinta immagine a E 6,5 (protocolli 3.2 e 3.3.3). In primo luogo, conferma gravidanza visualizzando embrioni il giorno E6.5 e quindi allocare in modo casuale i topi incinto in tre gruppi: il gruppo MNP, plCSA-MNP gruppo e gruppo di tampone fosfato salino (PBS).
    3. Iniettare PBS, MNPs o plCSA-MNPs (1 mg/kg equivalente di MTX) nelle vene dei topi incinta coda ogni giorno a partire da E6.5 come descritto al punto 2.2.
  2. Preparazione per l'imaging
    1. 24 h dopo l'iniezione di nanoparticelle, immagine i topi incinto utilizzando il HFUS sistema di imaging.
    2. Anestetizzare i topi incinto come descritto al punto 2.3.2. Attivare i controlli di temperatura integrato della piattaforma imaging e preriscaldare la piattaforma a 37-42 ° C. Fissare i topi incinto in posizione supina sulla piattaforma usando del nastro.
    3. Posto il cono di naso collegato all'unità di anestesia sopra il muso. Applicare isoflurano 2% con un tasso di flusso di ossigeno di 1,0 L/min per mantenere l'anestesia costante.
    4. Rimuovere chimicamente i capelli dall'addome usando una crema depilatoria. Spazzare via la crema residua accuratamente con una garza imbevuta di acqua e poi ricoprire l'addome con gel di accoppiamento acustico.
  3. Procedura di imaging
    1. Posizionare il trasduttore di 40 MHz nel braccio meccanico.
    2. Regolare la posizione del trasduttore per ottenere immagini longitudinale del feto e della placenta con la regione di interesse che si trova nella zona focale.
    3. Analisi e formazione immagine B-Mode
      Nota: Vedere film 1.
      1. Fare clic sul pulsante B-Mode e abbassare il trasduttore sopra l'addome, fino a quando il feto e la placenta entrare in vista. Premere Scansione/Freeze per avvio/arresto imaging, premere Cine memorizzare per memorizzare il ciclo di cinematografia e premere telaio memorizzare per memorizzare immagini telaio.
      2. Fare clic sul pulsante di misura per analizzare la lunghezza sac gestational (GS), lunghezza della groppa di corona fetale (CRL), diametro biparietale (BPD), circonferenza addominale (AC), diametro placenta (PD) e spessore placenta (PT).
    4. Analisi e PW-Doppler imaging
      Nota: Vedere film 1.
      1. Utilizzando la stessa proiezione di scansione, fare clic sul pulsante PW , posizionare la casella di volume di campionamento al centro dell'arteria ombelicale e premere Scan/Freeze per avviare la formazione immagine. Fare clic su Cine memorizzare per raccogliere immagini di arteria ombelicale.
      2. Fare clic sul pulsante di misura per calcolare la velocità di picco dell'arteria ombelicale (UA).
    5. Analisi e formazione immagine di Doppler modalità colore
      1. Utilizzando la stessa proiezione di scansione, fare clic sul pulsante colore e regolare la posizione del trasduttore per ottenere immagini del cuore fetale. Premere scansione/freeze per avviare imaging e Cine memorizzare per raccogliere immagini.
      2. Fare clic sul pulsante di misura per calcolare la frequenza cardiaca fetale (HR).

4. analisi HPLC

  1. Preparazione tessuto
    1. Iniettare i topi incinto con una singola dose di MNPs o plCSA-MNPs (equivalente MTX di 1 mg/kg) a fine gravidanza (ad es., e 14.5) come descritto al punto 3.1.3.
    2. Dopo 24 h, anestetizzare i topi tramite un'iniezione intraperitoneale di avertin alle 240 μg/peso (g). Non garantire nessuna risposta a un pizzico di piede per verificare che i topi sono completamente anestetizzati.
    3. Spruzzare la zona del torace con etanolo al 75%. Eseguire perfusione cardiaca (tagliare gli atri destro e irrorare attraverso il ventricolo sinistro) come precedentemente descritto in dettaglio19,20 con 50 mL di soluzione fisiologica 0,9% ghiacciata per 10 min rimuovere le nanoparticelle non associate.
    4. La diga di eutanasia. Eseguire un taglio cesareo per raccogliere i feti e placente usando il forcipe di Graefe, dissezione Forbici e pinze di Graefe e conservare i tessuti a-80 ° C prima dell'analisi.
    5. Preparare la soluzione di omogeneizzazione (10% acido perclorico) e tenere il ghiaccio. Raccogliere circa 200 mg di tessuto e aggiungere 500 μL di soluzione di omogeneizzazione per ogni campione. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore a tutta velocità per 30 s e ripetere questa procedura due volte.
    6. Centrifugare i campioni a 14.000 × g per 20 min a 4 ° C. Filtrare il surnatante (circa 300 μL) attraverso una siringa filtro 0,45 μm e trasferire il liquido risultante a un flacone HPLC. Inserire fiale del campione in un vassoio di autocampionatori per iniezione.
  2. Preparazione di standard di
    1. Preparare la seguente soluzione per la fase mobile: 40mm potassio fosfato bibasico (pH 4,5) e acetonitrile (88:12, v/v). Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa dimensione dei pori 0,45 μm e trasferire il liquido risultante in una bottiglia pulita del serbatoio HPLC.
      Nota: Regolare il pH con acido fosforico 0.1 M. Utilizzare la vibrazione ultrasonica per 15 min per degassare la fase mobile ogni volta prima di utilizzare.
    2. Pesare 10 mg di MTX in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di idrossido di sodio 1 M.
    3. Vortice ad alta velocità fino a quando il MTX si dissolve completamente.
      Nota: Questo è lo stock di primario e possa essere conservato a-20 ° C per diversi mesi.
    4. Per creare lo stock MTX secondario (500 μg/mL), diluire 50 μL dello stock primario a 950 μL della fase mobile.
      Nota: Conservare il ghiaccio fino all'utilizzo e preparati freschi ogni giorno. È importante utilizzare la fase mobile per l'elaborazione di norme per evitare picchi derivanti da miscelare dissimili soluzioni dopo l'iniezione del campione.
    5. Effettuare ulteriori diluizioni per creare gli standard (tabella 1). Conservare gli standard sul ghiaccio e preparare freschi ogni giorno. Eseguire le norme della serie con i campioni sperimentali.
NumeroConcentrazione finale (μg/mL)ΜL di standard, 500 μg/mLMobile phase(μL)
10,51999
212998
32.55995
41020980
52550950
650100900
7100200800

Tabella 1. Preparazione della curva standard per MTX. La concentrazione finale della soluzione standard di MTX è da 0,5 a 100 μg/mL.

  1. Strumentazione HPLC e parametri di funzionamento
    Nota: I campioni sono stati analizzati su un sistema HPLC dotato di pompa solvente, un rivelatore spettrofotometrico UV (313 nm) e una colonna C18 (250 × 4.6 mm, 5 μm granulometria).
    1. Accendere il degassificatore di HPLC per eliminare l'aria dal sistema. Attivare il flusso, equilibrare la colonna con la fase mobile per 30 min per ridurre il rumore della linea di base.
    2. Impostare la temperatura della colonna a 25 ° C, iniettare 20 volumi μL del campione ad una portata di 1 mL/min e scegliere il Metodo Run per avviare l'analisi.
    3. Quando le piste sono state completate, modificare manualmente la fase mobile acetonitrile di grado HPLC. Eseguire per circa 15 min proteggere il sistema.
      Nota: Per eseguire questo passaggio dopo il tempo di esercizio raccomandato potrebbe comportare danni alla colonna.
    4. Per l'analisi quantitativa, calcolare le aree sotto le cime MTX standard di interesse utilizzando il software di sistema HPLC.

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Risultati

In questo manoscritto, plCSA-BP-coniugato nanoparticelle caricato con MTX (plCSA-MNPs) o ICG (plCSA-INPs) sono state iniettate per via endovenosa in topi incinti. In vivo imaging ha rivelato segnali forti di ICG nella regione dell'utero 30 min dopo l'iniezione plCSA-INP. L'INPs sono stata localizzata principalmente nella regione di fegato e milza (Figura 1A). A 48 h dopo l'iniezione plCSA-INP, incinto topi sono stati sacrificati, rivelando ICG segnal...

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Discussione

In questo manoscritto, delineiamo un sistema di tre-metodo per determinare se le nanoparticelle plCSA-BP-guida sono uno strumento efficace per la consegna di farmaci alla placenta di targeting. L'uso di in vivo imaging per monitorare il segnale a infrarossi fluorescente ICG confermato la specificità di targeting placenta di plCSA-BP. Using HFUS e HPLC, abbiamo dimostrato che nanoparticelle plCSA-BP-coniugato possono fornire in modo efficiente MTX solo per il cellule della placenta, non per il feto.

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Divulgazioni

X.F. e B.Z. inventori su domanda di brevetto PCT/CN2017/108646 presentato da SIAT che riguarda un metodo di consegna di droga placenta-specifico e la sua applicazione. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione nazionale di scienze naturali (81771617) e la scienza naturale Fondazione della provincia di Guangdong (2016A030313178) assegnato a X.F.; una sovvenzione dalla Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512) assegnato a X.F; Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo sviluppo umano del National Institutes of Health, sotto Premio numero R01HD088549 (il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il funzionario viste del National Institutes of Health) di N.N.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
CD-1 miceBeijing Vital River201Female (8-12 week)
Insulin syringeBD328421for IV injection
Ethanol absoluteSinopharm Chemical10009218for nanoparticles synthesis
Soybean lecithinAvanti Polar Lipids441601for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125for nanoparticles synthesis
PLGASigma-Aldrich719897for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processorSonicsVCX130for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX)Sigma-AldrichV900324for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG)Sigma-Aldrich1340009for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS)HycloneSH30028.01
IVIS spectrum instrumentPerkin Elmerfor in vivo imaging
Ultrasound transmission gelGuanggongZC4252418for ultrasound imaging
IsofluraneLunan PharmaceuticalI0040for maintain the anesthesia
Depilatory creamNairTMG001for removing fur
40 MHz transducerVisualSonicsMS550Sfor ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging systemVisualSonicsVevo2100for ultrasound imaging
AvertinSigma-AldrichT48402for anesthesia
Syringe pumpMindraySK-500IIIforcardiac perfusion
0.9% saline solutionMeilunbioMA0083forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubesAXYGENMCT-150-C
-80 °C freezerThermo Fisher Scientific88600V
CentrigugeCenceH1650R
Perchloric acidSigma-Aldrich311421for precipitating protein
HomogenizerSCIENTZSCIENTZ-48for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm)MilliporeSLHV033RS01
Sodium hydroxideSinopharm Chemical10019763for solving MTX
HPLC vialsWaters670650620for HPLC
Potassium phosphate dibasicSinopharm Chemical20032117for HPLC
AcetonitrileJKchemical932537for HPLC
C18 columnWaters186003966for HPLC
HPLC systemShimadzufor HPLC

Riferimenti

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