Evaluación integral de la efectividad y seguridad de la entrega de drogas orientada a Placenta utilizando tres métodos complementarios

Resumen

Se describe un sistema que utiliza tres métodos para evaluar la seguridad y eficacia de la administración de fármacos dirigidos a placenta: en vivo la proyección de imagen para controlar la acumulación de nanopartículas, ultrasonido de alta frecuencia para supervisar el desarrollo placentario y fetal y HPLC para cuantificar la entrega de la droga al tejido.

Resumen

No hay tratamientos eficaces existen para complicaciones del embarazo asociada a placenta, y desarrollo de estrategias para la entrega específica de drogas a la placenta y reducir al mínimo efectos secundarios fetales y maternos sigue siendo desafiante. Portadores de nanopartículas dirigidas ofrecen nuevas oportunidades para tratar los trastornos placentarios. Recientemente hemos demostrado que un péptido sintético placentaria condroitín sulfato A enlace (plCSA-BP) podría utilizarse para guiar las nanopartículas para administrar medicamentos a la placenta. En este protocolo, describimos en detalle un sistema para evaluar la eficacia del fármaco a la placenta por plCSA-BP que emplea tres métodos separados en combinación: en vivo la proyección de imagen, ultrasonido de alta frecuencia (HFUS) y alto rendimiento cromatografía líquida (HPLC). En vivo imagen, guiada por la BP plCSA nanopartículas fueron visualizadas en las placentas de animales vivos, mientras que HFUS y HPLC demostraron que las nanopartículas conjugadas de BP plCSA eficientemente y específicamente entregan metotrexato a la placenta. Por lo tanto, una combinación de estos métodos puede utilizarse como una herramienta eficaz para la entrega específica de drogas a la placenta y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento para varias complicaciones del embarazo.

Introducción

Complicaciones del embarazo mediada por la placenta, incluyendo la preeclampsia, la pérdida del embarazo, desprendimiento prematuro de placenta y pequeño edad gestacional (SGA), son comunes y conducen a importante morbilidad fetal y materna y mortalidad^{1,2, 3}y muy pocos fármacos han demostrado para ser eficaces para tratar el embarazo trastornos de^4,5. El desarrollo de estrategias para la administración de fármacos dirigidos a placenta más selectivo y seguro durante el embarazo sigue siendo un desafío en la farmacoterapia moderna.

En los últimos años, varios informes se han centrado en la entrega dirigida de fármacos a los tejidos uteroplacentaria por capa nanopartículas con anticuerpos o péptidos como instrumentos dirigidos a placenta. Estos incluyen un anticuerpo de anti-factor de crecimiento receptor (EGFR)⁶ , tumor-homing péptidos (CGKRK y iRGD)⁷, péptidos dirigidos a placenta⁸, péptidos orientada en la vasculatura placentaria⁹ y anticuerpos contra el receptor de oxitocina¹⁰.

Aquí, demostramos que se puede utilizar un péptido sintético placentaria condroitín sulfato A enlace (plCSA-BP) para la entrega específica de nanopartículas y sus cargas de droga a la placenta¹¹. Las nanopartículas plCSA BP guiada son complementarias a la uteroplacentaria informó a métodos debido a el trofoblasto placentario de destino.

Como un método no invasivo, en vivo la proyección de imagen se ha utilizado para monitorizar la expresión génica específica de la placenta en ratones¹²y verde del indocyanine (ICG) ha sido ampliamente utilizado para seguimiento de nanopartículas usando la fluorescencia sistemas^{13, la proyección de imagen 14,15}. Así, nos inyecta por vía intravenosa plCSA BP conjugado nanopartículas cargadas con ICG (plCSA-INPs) para visualizar la distribución plCSA INP en ratones embarazadas con un reproductor de imágenes de fluorescencia. Entonces inyectamos intravenoso methotrexate (MTX)-carga plCSA NPs en ratones embarazadas. Ultrasonido de alta frecuencia (HFUS), otro no-invasiva, en tiempo real imaging herramienta^16,17 fue utilizada para supervisar el desarrollo fetal y placentario en los ratones. Por último, se utilizó cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para cuantificar la distribución de MTX en las placentas y fetos.

En este protocolo, describimos en detalle el sistema tres-método para evaluar la eficacia de la administración de fármacos dirigidos a placenta nanocarriers plCSA BP guiada.

Protocolo

Todos los experimentos de ratón siguen estrictamente los protocolos (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) aprobados por el cuidado Animal y uso Comité de Shenzhen institutos de tecnología avanzada, Academia China de Ciencias.

1. síntesis de nanopartículas de polímero lipídico dirigidos A condroitín sulfato placentario

1. Sintetizan nanopartículas de polímeros de lípidos cargados de MTX y ICG (MNPs y INPs respectivamente) y de nanopartículas conjugadas de BP plCSA (plCSA MNPs y INPs plCSA) como se describe en detallan en otra parte¹⁸.

2. in vivo de fluorescencia imágenes

1. Preparación de ratones embarazadas
   1. Lugar femenino ratones CD-1 (8-12 semanas) con un macho fértil de la misma cepa en una jaula (hombre: mujer = 1:2) por la tarde y check vaginal conecta la siguiente mañana. Si se observa un tapón vaginal, definir el ratón embrionario día 0.5 (E0.5).
   2. Embarazadas ratones de la casa solo en una habitación libre de patógeno animal con un oscuro 14 h luz/10 h ciclo y proporcionan libre acceso a alimentos y agua hasta E14.5.
2. Inyección intravenosa de nanopartículas
   1. Antes del procedimiento, esterilizar las nanopartículas por filtración a través de un filtro de jeringa de 0.22 μm. Pesar el ratón embarazado en E11.5 para determinar la cantidad y el volumen de la inyección de nanopartículas.
      Nota: El volumen de la inyección de nanopartículas debe ser menos del 1% (volumen/peso) del peso corporal del ratón embarazado. Por ejemplo, el volumen de la inyección de nanopartículas debe ser menos de 0.25 mL en un ratón de 25 g.
   2. Para dilatar la vena de la cola, caliente la cola por 5-10 min con una almohadilla térmica.
   3. Antes de la inyección, Aspire el INPs o plCSA INPs en una jeringa de insulina 28 g.
   4. Transferir el ratón embarazado a un dispositivo de sujeción que frena el ratón permitiendo el acceso a la vena de la cola. Limpiar la cola con un algodón embebido en alcohol. Luego inserte la jeringa en la vena de la cola. Inyectar lentamente el INPs o plCSA-INPs (5 mg/kg equivalente ICG) con incluso la presión sobre s 5-10.
      Nota: Dejar de inyectarse si aparece una ampolla en la cola porque este resultado indica que la aguja no está en la vena. Jeringas no deben ser compartidas entre ratones para minimizar la transmisión de la enfermedad y la contaminación cruzada.
   5. Registrar el tiempo de inyección. Mientras tanto, aplique presión suave en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detenga, que normalmente dura 30-60 s.
3. Proyección de imagen in vivo
   1. 30 min después de la inyección, los ratones embarazados usando la fluorescencia en vivo sistema de imagen de la imagen.
   2. Anestesiar los ratones embarazados con una tasa de flujo de oxígeno de 1.0 L/min y el isoflurane en 2-4% en una cámara de asociado de la unidad de anestesia y verificar el completa anestesia por lento y la respiración regular. A continuación, moverlos en la cámara de proyección de imagen. Coloque los ratones embarazados anestesiados en la cámara imágenes, mantener los animales en una posición supina.
   3. Coloque un cono de nariz sobre la boca y la nariz para permitir que la inhalación de isoflurano de 1-2% con una tasa de flujo de oxígeno de 1.0 L/min para mantener la anestesia.
   4. Seleccione parámetros 2D-fluorescencia y fotográficos a la imagen de las señales de fluorescencia de ICG. Establecer la exposición al auto y las longitudes de onda de excitación/emisión a 710/820 nm.
   5. Al final del procedimiento por imágenes, apague la afluencia de isoflurano para detener la anestesia y cuidadosamente regrese los ratones embarazados a sus jaulas.
   6. 48 h después de la inyección de nanopartículas, anestesiar los ratones embarazados con isofluorane y luego sacrificar la presa por dislocación cervical. Recoger los fetos y placentas con unas pinzas Graefe, Graefe tejido pinzas y tijeras de disección.
   7. Coloque las placentas y los fetos en la proyección de imagen de la cámara y la imagen usando el método descrito en el paso 2.3.4.

3. HFUS evaluación del desarrollo embrionario

1. Modelos animales
   1. Obtener y preparar los ratones embarazados como se describe en el paso 2.1.
   2. Utilice HFUS ratones embarazadas imagen en E 6.5 (protocolos de 3.2 y 3.3.3). En primer lugar, confirmar el embarazo visualizando embriones en día E6.5 y luego asignar aleatoriamente los ratones embarazados en tres grupos: el grupo MNP, grupo plCSA-MNP y grupo de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   3. Inyectar la PBS, MNPs y plCSA-MNPs (1 mg/kg equivalente de MTX) en las venas de la cola de los ratones embarazadas todos los días a partir de E6.5 como se describe en el paso 2.2.
2. Preparación para la proyección de imagen
   1. 24 h después de la inyección de nanopartículas, los ratones embarazados usando la HFUS sistema de imagen de la imagen.
   2. Anestesiar los ratones embarazados como se describe en el paso 2.3.2. Activar los controles de temperatura integrado de la plataforma de proyección de imagen y precaliente la plataforma 37-42 ° c. Asegure los ratones embarazados en posición supina en la plataforma con cinta.
   3. Lugar del cono de nariz conectada a la unidad de anestesia sobre el hocico. Aplicar el 2% isoflurano con una tasa de flujo de oxígeno de 1.0 L/min para mantener la anestesia constante.
   4. Eliminar químicamente el vello del abdomen con una crema depilatoria. Limpie la crema residual cuidadosamente con una gasa empapada en agua y luego cubrir el abdomen con gel de acoplamiento acústico.
3. Procedimiento de la proyección de imagen
   1. Coloque el transductor de 40 MHz en el brazo mecánico.
   2. Ajuste la posición del transductor para obtener imágenes longitudinales del feto y la placenta con la región de interés en la zona focal.
   3. Análisis y proyección de imagen de modo B
      Nota: Vea la película 1.
      1. Haga clic en el botón de Modo B y baje el transductor sobre el abdomen hasta que el feto y la placenta a la vista. Presione Scan y congelación para iniciar/detener la proyección de imagen, pulse Cine guardar para almacenar el lazo de la cinematografía y pulse almacenar marco para almacenar imágenes.
      2. Haga clic en el botón de medida para analizar la longitud del saco gestacional (SG), fetal longitud de grupa la corona (CRL), diámetro biparietal (DBP), circunferencia abdominal (CA), diámetro placentario (DP) y grosor placentario (PT).
   4. Análisis y proyección de imagen de Doppler PW
      Nota: Vea la película 1.
      1. Usando el mismo análisis de proyección, haga clic en el botón PW , coloque la caja de volumen de muestreo en el centro de la arteria umbilical y presione Scan y congelación para iniciar la proyección de imagen. Haga clic en almacenar el Cine para recoger imágenes de la arteria umbilical.
      2. Haga clic en el botón de medida para calcular la velocidad de pico de la arteria umbilical (UA).
   5. Análisis y proyección de imagen de modo Doppler color
      1. Usando el mismo análisis de proyección, haga clic en el botón de Color y ajustar la posición del transductor para obtener imágenes del corazón fetal. Presione Scan y congelación para iniciar la proyección de imagen y Cine tienda para recoger imágenes.
      2. Haga clic en el botón de medida para calcular la frecuencia cardíaca fetal (HR).

4. HPLC análisis

1. Preparación de tejido
   1. Los ratones embarazados se inyectan con una dosis única de MNPs o plCSA-MNPs (equivalente a MTX de 1 mg/kg) en último embarazo (e.g., E14.5) como se describe en el paso 3.1.3.
   2. Después de 24 h, anestesiar los ratones por una inyección intraperitoneal de avertin en 240 μg/peso (g). No Asegúrese de respuesta a una pizca de pie para comprobar que los ratones son completamente anestesiados.
   3. Rocíe el área del pecho con etanol al 75%. Realizar la perfusión cardiaca (cortar la aurícula derecha y perfusión a través del ventrículo izquierdo) como se ha descrito en detalle^19,20 con 50 mL de solución salina 0.9% helada durante 10 min eliminar las nanopartículas.
   4. Eutanasia a la presa. Realizar una cesárea para recoger los fetos y placentas con unas pinzas Graefe, tijeras de disección Graefe tejido pinzas y almacenar los tejidos a-80 ° C antes del análisis.
   5. Preparar la solución de homogeneización (ácido perclórico al 10%) y mantener en hielo. Recoger aproximadamente 200 mg de tejido y agregar 500 μL de solución de homogenización para cada muestra. Homogeneizar las muestras utilizando un homogeneizador a toda velocidad para 30 s y repetir este procedimiento dos veces.
   6. Centrifugar las muestras a 14.000 × g por 20 min a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante (aproximadamente 300 μL) a través de un filtro de jeringa 0.45 μm y transferir el líquido resultante en un frasco HPLC. Colocar frascos de la muestra en una bandeja de automuestreador para la inyección.
2. Preparación de las normas
   1. Preparar la siguiente solución para la fase móvil: 40 mM potasio Fosfato dibásico (pH 4.5) y acetonitrilo (88:12, v/v). Filtrar la solución a través de un filtro de la jeringuilla del tamaño del poro de 0.45 μm y transferir el líquido resultante en una botella limpia de embalse HPLC.
      Nota: Ajustar el pH con ácido fosfórico al de 0.1 M. Utiliza vibración ultrasónica durante 15 min a desgasificar la fase móvil cada vez antes de usar.
   2. Pesar 10 mg de MTX en un tubo de centrífuga de 1.5 mL. Añadir 1 mL de 1 M de hidróxido de sodio.
   3. Vórtice de alta velocidad hasta que el MTX se disuelva completamente.
      Nota: Esto es la acción principal y puede almacenarse a-20 ° C durante varios meses.
   4. Para crear la acción secundaria de MTX (500 μg/mL), diluir 50 μL del stock primario en 950 μL de fase móvil.
      Nota: Almacenar en hielo hasta su utilización y preparar todos los días. Es importante utilizar la fase móvil para la preparación de normas para evitar picos resultantes de mezclar diferentes soluciones después de la inyección de la muestra.
   5. Hacer más diluciones para crear las normas (tabla 1). Almacenar los estándares en el hielo y preparar todos los días. Ejecutar las normas en serie con las muestras experimentales.

Número	Final concentración (μg/mL)	ΜL de estándar, de 500 μg/mL	Phase(μL) móvil
1	0.5	1	999
2	1	2	998
3	2.5	5	995
4	10	20	980
5	25	50	950
6	50	100	900
7	100	200	800

Tabla 1. Preparación de la curva estándar para MTX. La concentración final de solución estándar de MTX es de 0.5-100 μg/mL.

3. Instrumentación HPLC y parámetros de operación
   Nota: Las muestras se analizaron en un sistema HPLC equipado con una bomba de disolvente, un detector espectrofotométrico UV (313 nm) y una columna de C18 (250 × 4.6 m m, tamaño de partícula de 5 μm).
   1. Encienda el desgaseador HPLC para eliminar el aire del sistema. Encender el flujo, equilibrando la columna con la fase móvil durante 30 minutos reducir el ruido de línea de base.
   2. Ajustar la temperatura de la columna a 25 ° C, inyectar volúmenes de muestra de 20 μL con un caudal de 1 mL/min y haga clic en el Método Run para iniciar el análisis.
   3. Una vez terminadas las carreras, manualmente cambie la fase móvil a acetonitrilo grado HPLC. Funcionar durante aproximadamente 15 minutos proteger el sistema.
      Nota: Realizar este paso después del tiempo en marcha recomendado podría resultar en daños a la columna.
   4. Para el análisis cuantitativo, calcular las áreas bajo los picos estándar de MTX de interés utilizando el software del sistema HPLC.

Resultados

En este manuscrito, conjugado de BP plCSA nanopartículas cargadas con MTX (plCSA-MNPs) o ICG (plCSA-INPs) fueron inyectadas por vía intravenosa en ratones embarazadas. En vivo la proyección de imagen reveló señales fuertes de ICG en la región del útero 30 min después de la inyección plCSA-INP. El INPs se localizaron principalmente en la región del hígado y del bazo (figura 1A). A las 48 h después de la inyección plCSA-INP, sacrificaron r...

Discusión

En este manuscrito, describiremos un sistema tres-método de determinación de nanopartículas guiadas por BP plCSA sean una herramienta eficaz para dirigir la entrega de medicamentos a la placenta. El uso de en vivo para monitorear la señal infrarroja de ICG fluorescente la proyección de imagen confirmaron la especificidad dirigida a placentario de plCSA verificada usando HFUS y HPLC, hemos demostrado que las nanopartículas conjugadas de BP plCSA pueden administrar MTX solamente a la células de la placenta,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD-1 mice	Beijing Vital River	201	Female (8-12 week)
Insulin syringe	BD	328421	for IV injection
Ethanol absolute	Sinopharm Chemical	10009218	for nanoparticles synthesis
Soybean lecithin	Avanti Polar Lipids	441601	for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOH	Avanti Polar Lipids	880125	for nanoparticles synthesis
PLGA	Sigma-Aldrich	719897	for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processor	Sonics	VCX130	for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX)	Sigma-Aldrich	V900324	for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG)	Sigma-Aldrich	1340009	for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS)	Hyclone	SH30028.01
IVIS spectrum instrument	Perkin Elmer		for in vivo imaging
Ultrasound transmission gel	Guanggong	ZC4252418	for ultrasound imaging
Isoflurane	Lunan Pharmaceutical	I0040	for maintain the anesthesia
Depilatory cream	Nair	TMG001	for removing fur
40 MHz transducer	VisualSonics	MS550S	for ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging system	VisualSonics	Vevo2100	for ultrasound imaging
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402	for anesthesia
Syringe pump	Mindray	SK-500III	forcardiac perfusion
0.9% saline solution	Meilunbio	MA0083	forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubes	AXYGEN	MCT-150-C
-80 °C freezer	Thermo Fisher Scientific	88600V
Centriguge	Cence	H1650R
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421	for precipitating protein
Homogenizer	SCIENTZ	SCIENTZ-48	for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm)	Millipore	SLHV033RS01
Sodium hydroxide	Sinopharm Chemical	10019763	for solving MTX
HPLC vials	Waters	670650620	for HPLC
Potassium phosphate dibasic	Sinopharm Chemical	20032117	for HPLC
Acetonitrile	JKchemical	932537	for HPLC
C18 column	Waters	186003966	for HPLC
HPLC system	Shimadzu		for HPLC