Évaluation globale de l’efficacité et l’innocuité de la délivrance de médicaments ciblés Placenta en utilisant trois méthodes complémentaires

Résumé

Les auteurs décrivent un système qui utilise trois méthodes pour évaluer l’innocuité et l’efficacité de l’administration de médicaments ciblés placenta : in vivo de l’imagerie pour surveiller l’accumulation de nanoparticules, échographie de haute fréquence pour surveiller le développement placentaire et foetal et de la CLHP pour quantifier les medicaments au tissu.

Résumé

Aucun des traitements efficaces n’existent actuellement pour les complications associées à placenta pendant la grossesse, et élaborer des stratégies visant l’administration ciblée des médicaments pour le placenta tout en minimisant les effets secondaires foetus et maternels reste difficile. NANOPARTICULES ciblées transporteurs offrent de nouvelles possibilités pour traiter les troubles placentaires. Nous avons récemment démontré qu’un peptide synthétique placentaire chondroïtine sulfate A liaison (plCSA-BP) pourrait servir à orienter les nanoparticules pour libérer des médicaments le placenta. Dans ce protocole, nous décrivons en détail un système pour évaluer l’efficacité de la délivrance de médicaments pour le placenta par plCSA-BP qui emploie trois méthodes distinctes utilisées en combinaison : in vivo de l’imagerie, échographie de haute fréquence (HFUS) et haute performance chromatographie en phase liquide (HPLC). L’utilisation in vivo nanoparticules d’imagerie, plCSA-BP-guidé ont été visualisées dans les placentas d’animaux vivants, tandis que HFUS et HPLC ont démontré que le plCSA-BP-conjugué nanoparticules efficacement et précisément livré méthotrexate pour le placenta. Ainsi, une combinaison de ces méthodes peut servir comme un outil efficace pour l’administration ciblée des médicaments pour le placenta et le développement de nouvelles stratégies de traitement pour plusieurs complications de la grossesse.

Introduction

Complications de la grossesse induite par le placenta, y compris la prééclampsie, perte fœtale, placentaire et petit âge gestationnel (SGA), sont communs et conduisent à l’importante morbidité maternelle et foetale et mortalité^{1,2, 3}et très peu de médicaments ont fait leurs preuves pour être efficace pour traiter la grossesse troubles^4,5. L’élaboration de stratégies pour la livraison de médicaments ciblés placenta plus sélectif et plus sécuritaire pendant la grossesse reste difficile en pharmacothérapie modernes.

Ces dernières années, plusieurs rapports ont mis l’accent sur l’administration ciblée des médicaments aux tissus utéro de nanoparticules de revêtement avec des peptides ou des anticorps comme outils axés sur le placenta. Ceux-ci incluent un facteur de croissance épidermique anti receptor (EGFR)⁶ anticorps, tumeur-homing peptides (CGKRK et iRGD)⁷, axés sur le placenta peptides⁸, peptides d’axés sur la vascularisation placentaire⁹ et anticorps contre le récepteurs de l’ocytocine¹⁰.

Ici, nous démontrons qu’un peptide synthétique placentaire chondroïtine sulfate A liaison (plCSA-BP) peut être utilisé pour l’administration ciblée de nanoparticules et leurs charges utiles de drogue avec le placenta¹¹. Les nanoparticules plCSA-BP-guidées complètent l’utéro déclarée méthodes de ciblage parce qu’ils ciblent les trophoblastes placentaires.

Comme une méthode non invasive, l’imagerie in vivo a été utilisé pour contrôler l’expression des gènes spécifiques placenta en souris¹²et vert d’indocyanine (ICG) a été largement utilisé pour suivre les nanoparticules à l’aide de systèmes^{13, l’imagerie de fluorescence 14,15}. Ainsi, nous avons injecté par voie intraveineuse des nanoparticules plCSA-BP-conjugué chargés avec ICG (plCSA-INPs) pour visualiser la distribution de plCSA-INP chez les souris enceintes avec un imageur de fluorescence. Nous avons ensuite injectée par voie intraveineuse méthotrexate (MTX)-chargé de plCSA-NPs dans souris gravides. Échographie de haute fréquence (HFUS), non invasive, l’autre en temps réel d’imagerie outil^16,17 a été utilisé pour surveiller le développement foetal et placentaire chez les souris. Enfin, nous avons utilisé chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) pour quantifier la distribution MTX dans le placenta et le fœtus.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail le système de trois-méthode utilisé pour évaluer l’efficacité de la délivrance des médicaments ciblés placenta par nanocarriers plCSA-BP-guidé.

Protocole

Toutes les expériences de souris scrupuleusement les protocoles (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) approuvés par la protection des animaux et utilisation Comité de Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Académie chinoise des Sciences.

1. synthèse de nanoparticules de polymère lipidique A ciblé placentaire Sulfate de chondroïtine

1. Synthétiser des nanoparticules de lipide-polymère MTX - et ICG-chargés (MNPs et INPs respectivement) et plCSA-BP-conjugué des nanoparticules (plCSA-MNPs et plCSA-INPs) comme décrit en détaillent ailleurs¹⁸.

2. in vivo d’imagerie par Fluorescence

1. Préparation des souris enceintes
   1. Placer les femelles souris CD-1 (8-12 semaines) avec un mâle fertile de la même souche dans une cage (mâle : femelle = 1:2) dans l’après-midi et la vérification vaginale branche suit matin. Si on observe un plug vaginal, qualifier la souris embryonnaire jour 0.5 (E0.5).
   2. Souris enceintes maison seuls dans une chambre exempts de micro-organismes pathogènes animale avec un h de lumière/10 14 h obscurité cycle et donnent librement accès à la nourriture et l’eau jusqu'à E14.5.
2. Injection intraveineuse de nanoparticules
   1. Avant l’intervention, stériliser les nanoparticules par filtration à travers un filtre de seringue 0,22 μm. Peser la souris enceinte à E11.5 pour déterminer la quantité et le volume d’injection de nanoparticules.
      Remarque : Le volume d’injection de nanoparticules doit être inférieure à 1 % (poids/volume) du poids du corps de la souris enceinte. Par exemple, le volume d’injection de nanoparticules doit être inférieur à 0,25 mL chez une souris de 25 g.
   2. Pour dilater la veine caudale, chauffer la queue pendant 5-10 min avec un coussin chauffant.
   3. Avant l’injection, aspirer l’INPs ou plCSA-INPs dans une seringue à insuline 28 g.
   4. Transférer la souris enceinte à un dispositif de maintien qui retient la souris tout en permettant l’accès à la veine caudale. Nettoyer la queue avec un tampon imbibé d’alcool. Puis insérer la seringue dans la veine caudale. Injecter lentement l’INPs ou plCSA-INPs (équivalent ICG 5 mg/kg) avec une pression uniforme sur 5-10 s.
      Remarque : S’arrêter si une cloque apparaît sur la queue, car ce résultat indique que l’aiguille n’est pas dans la veine de l’injection. Seringues ne doivent pas être partagées entre les souris pour réduire au minimum la transmission de la maladie et la contamination croisée.
   5. Enregistrer le temps d’injection. Pendant ce temps, appliquez une légère pression sur le site d’injection jusqu'à l’arrêt du saignement, qui prend normalement de 30 à 60 s.
3. Imagerie in vivo
   1. 30 min après l’injection, les souris enceintes utilisant la fluorescence in vivo , système d’imagerie d’image.
   2. Anesthésier les souris enceintes avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min et isoflurane à 2-4 % dans une enceinte associée de l’unité d’anesthésie et vérifier l’anesthésie complète de lents et une respiration régulière. Puis, les déplacer dans la chambre d’imagerie. Placez les souris enceintes anesthésiés dans la chambre d’imagerie, de garder les animaux en position couchée.
   3. Placez un cône de nez sur la bouche et le nez pour permettre à l’inhalation de 1 à 2 % isoflurane avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min pour maintenir l’anesthésie.
   4. Sélectionnez Paramètres 2D-fluorescence et photographiques afin d’imager les signaux de fluorescence ICG. Régler l’exposition auto et les longueurs d’onde d’excitation/émission de 710/820 nm.
   5. À la fin de la procédure d’imagerie, éteignez l’afflux d’isoflurane pour arrêter l’anesthésie et les souris enceintes soigneusement regagner leur cage.
   6. 48 h après l’injection de nanoparticules, anesthésier les souris enceintes avec isofluorane et puis sacrifier le barrage par dislocation cervicale. Ramassez les foetus et les placentas avec une pincette de Graefe, Graefe forceps de tissue et ciseaux de dissection.
   7. Placer le placenta et le fœtus dans la chambre d’imagerie et l’image à l’aide de la méthode décrite à l’étape 2.3.4.

3. HFUS évaluation du développement embryonnaire

1. Modèles animaux
   1. Obtenir et préparer les souris enceintes comme indiqué au point 2.1.
   2. Utilisez HFUS à des souris enceintes image à 6,5 E (protocoles 3.2 et 3.3.3). Tout d’abord, confirmer la grossesse en visualisant les embryons jour E6.5 et puis au hasard d’allouer les souris enceintes en trois groupes : le groupe MNP, MNP-plCSA groupe et groupe de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   3. Injecter le PBS, MNPs ou plCSA-MNPs (1 mg/kg équivalent MTX) dans les veines de la queue des souris enceintes tous les deux jours à partir de E6.5 comme indiqué au point 2.2.
2. Préparation pour l’imagerie
   1. 24 h après l’injection de nanoparticules, image les souris enceintes à l’aide de la HFUS système d’imagerie.
   2. Anesthésier les souris enceintes comme indiqué au point 2.3.2. Activer les contrôles de température intégré de la plate-forme d’imagerie et de préchauffer la plate-forme à 37 et 42 ° C. Fixez les souris enceintes dans une position en décubitus dorsal sur la plate-forme à l’aide de ruban adhésif.
   3. Place du cône de nez connecté à l’appareil d’anesthésie sur le museau. Appliquer 2 % isoflurane avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min à maintenir stable anesthésie.
   4. Enlever les poils de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire chimiquement. Effacer la crème résiduelle soigneusement avec de la gaze imbibée d’eau et ensuite enduire acoustique gel de couplage de l’abdomen.
3. Procédure d’imagerie
   1. Placer le transducteur de 40 MHz dans le bras mécanique.
   2. Ajustez la position du transducteur pour obtenir des images longitudinales du fœtus et du placenta avec la région d’intérêt situé dans la zone focale.
   3. Analyse et imagerie en Mode B
      Remarque : Voir film 1.
      1. Cliquez sur le bouton Mode B et baisser le transducteur sur l’abdomen jusqu'à ce que le fœtus et le placenta entreront en vue. Appuyez sur Scan/gel pour lancer/arrêter d’imagerie, appuyez sur Cine stocker pour stocker la boucle ciné et appuyez sur trame de stocker pour stocker des images de trame.
      2. Cliquez sur le bouton de mesure pour analyser la longueur sac gestationnel (GS), longueur de croupe Couronne foetale (CRL), diamètre biparietal (BPD), circonférence abdominale (AC), diamètre placentaire (DP) et l’épaisseur placentaire (PT).
   4. Analyse et imagerie Doppler-PW
      Remarque : Voir film 1.
      1. En utilisant le même scan projection, cliquez sur le bouton PW , placez la zone de volume d’échantillonnage dans le centre de l’artère ombilicale et appuyez sur Scan/gel pour initier l’imagerie. Cliquez sur Cine stocker afin de recueillir des images de l’artère ombilicale.
      2. Cliquez sur le bouton de mesure pour calculer la vitesse de pointe de l’artère ombilicale (UA).
   5. Analyse et imagerie en mode Doppler couleur
      1. En utilisant le même scan projection, cliquez sur le bouton de couleur et ajuster la position du transducteur pour obtenir des images du coeur foetal. Appuyez sur Scan/gel pour initier l’imagerie et Cine stocker pour recueillir des images.
      2. Cliquez sur le bouton de mesure pour calculer le rythme cardiaque fœtal (HR).

4. analyse par CLHP

1. Préparation du tissu
   1. Injecter les souris enceintes avec une dose unique de MNPs ou plCSA-MNPs (équivalent MTX 1 mg/kg) à la fin de grossesse (par exemple., E14.5) comme indiqué au point 3.1.3.
   2. Après 24h, anesthésier les souris par une injection intrapéritonéale d’avertin à 240 μg/poids (g). S’assurer que pas de réponse à une pincée de pied pour vérifier que les souris sont complètement anesthésiés.
   3. Vaporiser la région de la poitrine avec 75 % d’éthanol. Effectuer la perfusion cardiaque (couper les oreillettes droites et perfuse par le ventricule gauche) comme décrit dans le détail^19,20 avec 50 mL de sérum physiologique 0,9 % glacée pendant 10 min enlever des nanoparticules non liés.
   4. Euthanasier le barrage. Faire une césarienne pour collecter le foetus et le placenta avec une pincette de Graefe, disséquant les ciseaux et pinces à tissus Graefe et stocker les tissus à-80 ° C avant l’analyse.
   5. Préparer la solution d’homogénéisation (10 % d’acide perchlorique) et continuer sur la glace. Recueillir environ 200 mg de tissu et ajouter 500 μl de solution d’homogénéisation à chaque échantillon. Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur à pleine vitesse pour 30 s et répéter cette procédure deux fois.
   6. Centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Filtrer le surnageant (environ 300 μL) à travers un filtre de 0,45 μm de seringue et transférer le liquide obtenu dans un flacon HPLC. Placer les flacons d’échantillon dans un bac d’échantillonneur automatique pour injection.
2. Élaboration de normes
   1. Préparer la solution suivante pour la phase mobile : acétonitrile (88:12, v/v) et 40 mM potassium phosphate dibasique (pH 4,5). Filtrer la solution à travers un filtre de seringue de taille de pore 0,45 μm et transférer le liquide obtenu dans une bouteille propre de réservoir HPLC.
      Remarque : Ajuster le pH à 0,1 M d’acide phosphorique. Utiliser la vibration ultrasonique pendant 15 min pour dégazer la phase mobile chaque fois avant d’utiliser.
   2. Peser 10 mg du MTX dans un tube à centrifuger 1,5 mL. Ajouter 1 mL d’hydroxyde de sodium 1 M.
   3. Vortex à grande vitesse jusqu'à ce que le MTX se dissout complètement.
      Note : Ceci est l’étalon primaire et peut être conservé à-20 ° C pendant plusieurs mois.
   4. Pour créer l’étalon secondaire de MTX (500 μg/mL), diluer 50 μL de l’étalon primaire de 950 μL de la phase mobile.
      Remarque : Conserver sur la glace jusqu'à l’utilisation et de préparer les frais du jour. Il est important d’utiliser la phase mobile pour l’élaboration de normes afin d’éviter les pics résultant du mélange des solutions dissemblables après injection de l’échantillon.
   5. Apporter de nouvelles dilutions pour créer les normes (tableau 1). Stocker les normes sur la glace et préparer les frais du jour. Exécuter les normes en série avec les échantillons expérimentaux.

Nombre	Concentration finale (μg/mL)	500 μg/mL norme μL	Phase(μL) mobile
1	0,5	1	999
2	1	2	998
3	2.5	5	995
4	10	20	980
5	25	50	950
6	50	100	900
7	100	200	800

Tableau 1. Préparation de la courbe d’étalonnage pour MTX. La concentration finale de solution étalon de MTX est de 0,5 à 100 μg/mL.

3. Instrumentation HPLC et paramètres d’opération
   Remarque : Les échantillons ont été analysés sur un système HPLC équipé d’une pompe solvant, un détecteur par spectrophotométrie UV (313 nm) et une colonne C18 (250 × 4.6 mm, taille des particules 5 μm).
   1. Allumez le dégazeur HPLC pour chasser l’air du système. Tournez le flux, l’équilibration de la colonne avec la phase mobile pendant 30 min réduire le bruit de la ligne de base.
   2. Régler la température de la colonne à 25 ° C, injecter 20 volumes d’échantillon μL à un débit de 1 mL/min, puis cliquez sur la Méthode Run pour démarrer l’analyse.
   3. Lorsque les essais sont terminés, modifier manuellement la phase mobile d’acétonitrile qualité HPLC. Fonctionner pendant environ 15 min protéger le système.
      Remarque : Pour effectuer cette étape suivant la durée recommandée peut entraîner des dommages à la colonne.
   4. Pour une analyse quantitative, calculer les aires sous les pics MTX standards d’intérêt en utilisant le logiciel de système de CLHP.

Résultats

Dans ce manuscrit, les nanoparticules plCSA-BP-conjugué chargés de MTX (plCSA-MNPs) ou GIC (plCSA-INPs) ont été par voie intraveineuse injectées à des souris enceintes. In vivo de l’imagerie a révélé des signaux forts de ICG dans la région de l’utérus 30 min après l’injection de plCSA-INP. L’INPs ont été essentiellement localisés dans la région du foie et la rate (Figure 1 a). 48 h après l’injection de plCSA-INP, souris gra...

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivent un système de trois-méthode pour déterminer si les nanoparticules plCSA-BP-guidées sont un outil efficace pour cibler l’administration de médicaments pour le placenta. L’utilisationdes in vivo de l’imagerie pour surveiller le signal infrarouge de ICG fluorescent a confirmé la spécificité ciblage placentaire de plCSA-BP. Using HFUS et HPLC, nous avons démontré que plCSA-BP-conjugué des nanoparticules peuvent délivrer efficacement MTX uniquement à la cellules d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD-1 mice	Beijing Vital River	201	Female (8-12 week)
Insulin syringe	BD	328421	for IV injection
Ethanol absolute	Sinopharm Chemical	10009218	for nanoparticles synthesis
Soybean lecithin	Avanti Polar Lipids	441601	for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOH	Avanti Polar Lipids	880125	for nanoparticles synthesis
PLGA	Sigma-Aldrich	719897	for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processor	Sonics	VCX130	for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX)	Sigma-Aldrich	V900324	for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG)	Sigma-Aldrich	1340009	for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS)	Hyclone	SH30028.01
IVIS spectrum instrument	Perkin Elmer		for in vivo imaging
Ultrasound transmission gel	Guanggong	ZC4252418	for ultrasound imaging
Isoflurane	Lunan Pharmaceutical	I0040	for maintain the anesthesia
Depilatory cream	Nair	TMG001	for removing fur
40 MHz transducer	VisualSonics	MS550S	for ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging system	VisualSonics	Vevo2100	for ultrasound imaging
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402	for anesthesia
Syringe pump	Mindray	SK-500III	forcardiac perfusion
0.9% saline solution	Meilunbio	MA0083	forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubes	AXYGEN	MCT-150-C
-80 °C freezer	Thermo Fisher Scientific	88600V
Centriguge	Cence	H1650R
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421	for precipitating protein
Homogenizer	SCIENTZ	SCIENTZ-48	for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm)	Millipore	SLHV033RS01
Sodium hydroxide	Sinopharm Chemical	10019763	for solving MTX
HPLC vials	Waters	670650620	for HPLC
Potassium phosphate dibasic	Sinopharm Chemical	20032117	for HPLC
Acetonitrile	JKchemical	932537	for HPLC
C18 column	Waters	186003966	for HPLC
HPLC system	Shimadzu		for HPLC