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要約

安全性と胎盤をターゲットとした薬剤投与の有効性を評価する 3 つの方法を利用するシステムについて述べる:生体内のイメージ投射ナノ粒子蓄積、胎盤と胎児の開発を監視する高周波超音波を監視するには、および高速液体クロマトグラフィー組織への薬物送達を定量化します。

要約

現在は、胎盤の妊娠合併症は、効果的な治療法が存在しないと胎児と母体の副作用を最小限に抑えながら胎盤を薬のターゲットを絞った配信のための戦略を開発、やりがいのままです。対象となるナノ粒子のキャリアは、胎盤疾患を治療するために新しい機会を提供します。我々 は最近、合成胎盤コンドロイチン硫酸 A 結合ペプチド (plCSA BP) を使用して、胎盤に薬を提供するナノ粒子をガイドできる示した。このプロトコルで述べる plCSA BP の組み合わせで使用される 3 つの別々 のメソッドを採用するによって胎盤への薬物送達の効率を評価するためのシステム:生体内イメージング、高周波超音波 (HFUS)、および高パフォーマンス液体クロマトグラフィー (HPLC)。生体内でを使用してイメージング、plCSA BP 導かれるナノ粒子, 可視化された、生きている動物の胎盤で HFUS と HPLC 実証 plCSA BP 共役ナノ粒子効率的かつ具体的に配信されるメトトレキサート胎盤。したがって、これらのメソッドの組み合わせは、胎盤を薬のターゲットを絞った配信といくつかの妊娠合併症の新たな治療戦略の開発のための効果的なツールとして使用できます。

概要

胎盤を介する妊娠合併症、子癇前症、妊娠の損失、胎盤早期剥離、小さな胎 (SGA) などが一般的なへと導く実質的な胎児と母体の罹患率と死亡率1,2、4、5の障害妊娠の治療の効果があると証明された3、および非常に少数の薬。妊娠中より選択と安全の胎盤をターゲットとした薬物送達のための戦略の開発、現代の薬物療法でやりがいのままです。

近年、いくつかのレポートが焦点子宮組織への薬のターゲットを絞った配信ペプチドや抗体でコーティング ナノ胎盤向けツールとして。抗上皮成長因子受容体 (EGFR)6抗体、ペプチド腫瘍ホーミング (CGKRK および iRGD)7、胎盤標的ペプチド8、胎盤血管標的ペプチド9および抗体が含まれます、オキシトシン受容体10。

ここでは、胎盤の11へのナノ粒子およびそれらの薬物のペイロードのターゲット配信用合成胎盤コンドロイチン硫酸 A 結合ペプチド (plCSA BP) することができますを示します。PlCSA BP 導かれるナノ粒子は、報告された子宮胎盤絨毛を対象にできるので、ターゲット設定方法に補完されます。

非侵襲的な方法として生体内イメージングは、マウス12、胎盤特異的遺伝子の発現を監視する使用されています、インドシアニン グリーン (ICG) 蛍光イメージング システム13を用いたナノ粒子の追跡に用いられています。 14,15。したがって、我々 は静脈内妊娠マウスにおける蛍光イメージャ plCSA INP の分布を可視化する (plCSA-INPs) ICG 搭載 plCSA BP 共役系ナノ粒子を注入しました。我々 は、静脈内メトトレキサート (MTX) を注入-妊娠マウスに plCSA NPs を読み込まれます。別の非侵襲的高周波超音波 (HFUS)、リアルタイム イメージング ツール16,17は、マウス胎子及び胎盤の開発を監視するために使用されました。最後に、胎盤と胎児の MTX 分布を定量化するのに高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用します。

このプロトコルでは 3 方式 plCSA BP 誘導ナノキャリアによる胎盤標的薬配信の効率を評価するために使用詳細に述べる.

プロトコル

すべてのマウス実験徹底プロトコル (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) 動物のケアおよび使用委員会の深セン機関の高度な技術、中国科学院によって承認しました。

1. 胎盤コンドロイチン硫酸 A をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子の合成

  1. MTX と ICG ロード脂質高分子ナノ粒子を合成 (MNPs と INPs それぞれ) と plCSA BP 共役ナノ粒子 (plCSA MNPs と plCSA INPs) の説明に従って詳細他18。

2生体内蛍光イメージング。

  1. 妊娠マウスの作製
    1. 1 つのケージで同じ系統の肥沃な男性と女性の CD 1 マウス (8-12 週) を配置 (男性: 女性 = 1:2) 午後とチェック、膣のプラグ次の朝。膣にプラグを観察すると、胚日 0.5 (E0.5) としてマウスを定義します。
    2. 家妊娠マウスだけで 14 h の光/10 h 暗い動物病原体フリー部屋でサイクルし、E14.5 まで食料や水への無料アクセスを提供します。
  2. ナノ粒子の静脈注射
    1. 施術前に 0.22 μ m シリンジ フィルターを通して濾過によりナノ粒子を滅菌します。数量とナノ粒子の噴射量を決定する E11.5 で妊娠マウスの重量を量る。
      注: ナノ粒子注入量は、妊娠マウスの体重の 1% (容積/重量) 未満をする必要があります。たとえば、ナノ粒子注入量は 25 g マウス未満 0.25 mL をする必要があります。
    2. 尾静脈を拡張するには、加熱パッドで 5-10 分のための尾を温めます。
    3. 注入前に 28 g インスリン注射器に INPs または plCSA INPs を吸引します。
    4. 妊娠中のマウスを尾静脈へのアクセスを可能にしながらマウスを抑制する固定装置に転送します。アルコール綿で尻尾をきれいに。その後、尾静脈に注射器を挿入します。上も圧力と INPs または plCSA INPs (5 mg/kg ICG 相当) のゆっくり挿入 5-10 s。
      注: この結果は針が静脈にないことを示しますので、尾に水疱が表示される場合の注入を停止します。注射器は、病気の感染を最小限にするためにマウスと交差汚染と共有してはなりません。
    5. 射出時間を記録します。一方、通常 30-60 秒をかかりますが、出血が止まるまで、注射部位に穏やかな圧力を適用します。
  3. In vivoイメージング
    1. 注入後 30 分は、妊娠マウス生体内蛍光イメージング システムを使用して画像します。
    2. 1.0 L/min とイソフルラン麻酔ユニットの関連付けられている商工会議所の 2-4% の酸素流量で妊娠マウスの麻酔による低速における麻酔と規則正しい呼吸を確認してください。その後、部屋に移動します。仰臥位で、動物を飼う、イメージング商工会議所に麻酔下の妊娠マウスを配置します。
    3. 口と 1-2% イソフルレンの吸入麻酔を維持するために 1.0 L/分の酸素流量でできるように鼻の上、鼻の円錐形を配置します。
    4. ICG 蛍光信号を画像 2次元蛍光および写真のパラメーターを選択します。自動露出と励起/蛍光波長を設定710/820 nm。
    5. イメージの作成手順の最後に、麻酔科を停止するイソフルレン流入を切り、慎重に妊娠マウスをケージに戻ります。
    6. ナノ粒子注入後 48 時間は、isofluorane、妊娠マウスの麻酔し、頚部転位によってダムを犠牲します。胎児および胎盤グレーフェ組織ピンセット グレーフェ ピンセットを使用して、解剖はさみを収集します。
    7. 胎盤と胎児をイメージング室および手順 2.3.4 で説明したメソッドを使用してイメージに配置します。

3. HFUS 胚の評価

  1. 動物モデル
    1. 取得し、ステップ 2.1 に従って妊娠マウスを準備します。
    2. E 6.5 (プロトコル 3.2 および 3.3.3) で画像妊娠マウスに HFUS を使用します。まず、日 E6.5、胚を可視化して妊娠を確認し、ランダムに 3 つのグループに妊娠マウスを割り当てる: MNP グループ、plCSA MNP グループ、およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) グループ。
    3. PBS、MNPs または plCSA MNPs (1 mg/kg MTX と同等) に注入妊娠マウスの尾静脈 E6.5 2.2 の手順で説明されているように開始、その他の毎日。
  2. イメージングのための準備
    1. ナノ粒子、注射後 24 h 画像 HFUS イメージング システムを用いた妊娠マウスです。
    2. 2.3.2 の手順で説明するように、妊娠マウスを麻酔します。イメージング プラットフォームの統合された温度コントロールをオンにし、予熱 37-42 ° c プラットフォームテープを使用してプラットフォームに仰臥位で妊娠マウスを保護します。
    3. 鼻の円錐形の場所は、鼻を麻酔ユニットに接続されました。安定した麻酔を維持するために 1.0 L/分の酸素流量で 2% イソフルランを適用します。
    4. 化学的に脱毛クリームを使用して腹部から髪を削除します。水に浸したガーゼで十分に残留のクリームを一掃し、音響結合ゲルと腹部をコートします。
  3. 撮影手順
    1. 機械の腕に 40 MHz の探触子を配置します。
    2. 焦点のゾーンにある関心領域で胎児と胎盤の縦画像を取得する探触子の位置を調整します。
    3. B モード画像と解析
      注: は、映画 1を参照してください。
      1. B モードボタンをクリックし、胎児と胎盤が見えてくるまで、腹部の上に探触子を下げます。スキャン/凍結を押して開始/停止イメージング、シネを保存を押してシネ ループを保存し画像にフレームを格納するフレームを格納をキーを押します。
      2. 長さ胎嚢 (GS)、胎児クラウン尻長 (CRL)、大横径 (BPD)、腹囲 (AC)、胎盤直径 (PD) および胎盤厚さ (PT) を分析するには、メジャーをクリックします。
    4. PW ドプラ法と分析
      注: は、映画 1を参照してください。
      1. 同じを使用して投影をスキャン、 PWボタンをクリックして、臍動脈の中心にサンプリング ボリューム ボックスを置き、イメージングを開始するスキャン/凍結を押します。臍動脈画像を収集するためにシネを保存をクリックします。
      2. 臍動脈ピーク速度 (UA) を計算するメジャーをクリックします。
    5. 色ドップラー モード画像処理と解析
      1. 同じを使用して投影をスキャン、カラーボタンをクリックして、胎児の心臓の画像を取得する探触子の位置を調整します。イメージングとシネ画像を収集するために保存を開始するスキャン/凍結を押します。
      2. 胎児心拍数 (HR) を計算するには、メジャーをクリックします。

4. HPLC 分析

  1. ティッシュの準備
    1. 妊娠後期で MNPs または plCSA MNPs (1 mg/kg MTX と同等) の単回投与で妊娠マウスに注入 (e.g。、E14.5) 手順 3.1.3 で説明しました。
    2. 24 h 後 240 μ g/体重 (g) でタヴェルタン腹腔内投与によるマウスを麻酔します。マウスは完全に麻酔したことを確認する足のピンチに応答しないようにするため。
    3. 75% エタノールと胸の部分をスプレーします。心筋灌流 (カット右心房と左心室を灌流) を実行バインドされていないナノ粒子を削除する 10 分間氷冷 0.9% 生理食塩水 50 ml 詳細19,20で前述のよう。
    4. ダムを安楽死させます。胎児および胎盤グレーフェ鉗子、はさみ、グレーフェ組織鉗子を解剖を使用して収集する帝王を実行し、-80 ° c 分析の前に組織を格納します。
    5. 均質化ソリューション (10% 過塩素酸) を準備し、氷の上を維持します。組織の約 200 mg を収集し、各サンプルを 500 μ L の均質化ソリューションを追加します。30 s と繰り返しの全速力で圧力式ホモジナイザーを用いた試料をホモジナイズしてくださいこの手順を 2 回。
    6. 遠心分離機の 4 ° C で 20 分 14,000 × g でサンプル0.45 μ m シリンジ フィルターを通して清 (約 300 μ L) をフィルター処理し、得られた液体を高速液体クロマトグラフィー バイアルに転送します。注射用オートサンプラー トレイにサンプル瓶を配置します。
  2. 基準の作成
    1. 次のソリューションの移動相を準備: 40 mM カリウム リン酸二塩基性 (pH 4.5)、アセトニ トリル (88:12, v/v)。0.45 μ m 孔サイズのシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルター処理し、得られた液体をきれいな HPLC 貯水瓶に転送します。
      注: は、0.1 M リン酸の pH を調整します。ドガの使用する移動相各時間を事前に 15 分間超音波振動を使用します。
    2. 1.5 mL 遠心チューブに MTX の 10 mg の重量を量る。1 M 水酸化ナトリウムを 1 mL を追加します。
    3. 渦、MTX が完全に溶解するまで高速で。
      注: これはプライマリの株式であり、数カ月の-20 ° C で保存することができます。
    4. セカンダリ MTX 株式 (500 μ g/mL) を作成、プライマリ移動相の 950 μ L 入荷の 50 μ L を希釈します。
      注: は使用まで氷の上保存し、新鮮な毎日を準備します。サンプル注入後異なるソリューションを混合に起因ピークを避けるために標準の準備のため移動相を使用することが重要です。
    5. 希釈基準 (表 1) を作成することです。氷の上基準を保存し、新鮮な毎日を準備します。実験サンプルのシリーズの基準を実行します。
番号最終濃度 (μ g/mL)500 μ g/mL 標準、μ L携帯電話 phase(μL)
10.51999
212998
32.55995
41020980
52550950
650100900
7100200800

テーブル 1。MTX の標準曲線の準備します。MTX 標準溶液の最終濃度が 0.5 から 100 μ g/mL。

  1. 高速液体クロマトグラフィー計測と操作パラメーター
    注: サンプル溶剤用ポンプ、紫外線吸光光度検出器を搭載した高速液体クロマトグラフィー システムを分析した (313 nm)、および C18 カラム (250 × 4。 6 mm、5 μ m 粒子径)。
    1. システムから空気を除去する高速液体クロマトグラフィー脱を入れます。ベースライン ノイズを低減する 30 分間、移動相を持つ列を平衡させる流れを入れます。
    2. 列の温度を 25 ° C に設定、1 mL/分の流量で 20 μ L のサンプル ボリュームを挿入して分析を開始するメソッドの実行] をクリックします。
    3. 実行が完了したら、手動で移動相を高速液体クロマトグラフィー用アセトニ トリルに変更します。システムを保護するために約 15 分間を実行します。
      注: 推奨される実行時間を次のこの手順の実行に失敗可能性があります損傷の列に。
    4. 定量分析、高速液体クロマトグラフィー システム ソフトウェアを使用して興味の標準 MTX のピークの下の領域を計算します。

結果

本稿では、MTX (plCSA MNPs) または ICG (plCSA INPs) 搭載の plCSA BP 共役ナノ粒子静脈内妊娠マウスに注入しました。In vivoイメージング plCSA INP 注入後 30 分子宮の強い ICG 信号を明らかにしました。INPs は主に肝臓と脾臓領域 (図 1 a) にローカライズされました。PlCSA INP 注射後 48 時間の妊娠マウスが犠牲になった、ICG 信号しかない信号との間の胎盤...

ディスカッション

本稿では、3 法システム plCSA BP 導かれるナノ粒子が胎盤への薬の配達の対象化の効率的なツールであるかどうかを決定するための概要を説明します。生体内でイメージ投射赤外線蛍光 ICG 信号をモニターできるの使用確認 plCSA 跪く使用の胎盤のターゲット特異性 plCSA BP 共役ナノ粒子が MTX をだけに実現効率的にできることを示した我々 HFUS と高速液体クロマトグラフィー、胎児が胎盤?...

開示事項

X. f. B.Z. は、カバーする胎盤特異薬物送達方法 SIAT で特許出願 PCT/CN2017/108646 と応用発明家。他のすべての著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

謝辞

この作品は、国立自然科学財団 (81771617) と自然科学財団の広東省 (2016A030313178); x. f. に与えられるからの補助金によって支えられました。深セン基礎研究基金 (JCYJ20170413165233512) 場合であって; に与えられるからの助成金ユーニス · ケネディ · シュライバー国立衛生研究所の子と受賞番号 R01HD088549 の下で健康の国民の協会の人間の開発 (内容は著者の責任と、必ずしも公式健康の国民の協会の意見) に N.N.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CD-1 miceBeijing Vital River201Female (8-12 week)
Insulin syringeBD328421for IV injection
Ethanol absoluteSinopharm Chemical10009218for nanoparticles synthesis
Soybean lecithinAvanti Polar Lipids441601for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125for nanoparticles synthesis
PLGASigma-Aldrich719897for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processorSonicsVCX130for nanoparticles synthesis
Methotrexate (MTX)Sigma-AldrichV900324for nanoparticles synthesis
Indocyanine green (ICG)Sigma-Aldrich1340009for in vivo imaging
phosphate-buffered saline (PBS)HycloneSH30028.01
IVIS spectrum instrumentPerkin Elmerfor in vivo imaging
Ultrasound transmission gelGuanggongZC4252418for ultrasound imaging
IsofluraneLunan PharmaceuticalI0040for maintain the anesthesia
Depilatory creamNairTMG001for removing fur
40 MHz transducerVisualSonicsMS550Sfor ultrasound imaging
High-frequency ultrasound imaging systemVisualSonicsVevo2100for ultrasound imaging
AvertinSigma-AldrichT48402for anesthesia
Syringe pumpMindraySK-500IIIforcardiac perfusion
0.9% saline solutionMeilunbioMA0083forcardiac perfusion
1.5 mL Polypropylene tubesAXYGENMCT-150-C
-80 °C freezerThermo Fisher Scientific88600V
CentrigugeCenceH1650R
Perchloric acidSigma-Aldrich311421for precipitating protein
HomogenizerSCIENTZSCIENTZ-48for homogenizing tissue
Syringe filter (0.45 μm)MilliporeSLHV033RS01
Sodium hydroxideSinopharm Chemical10019763for solving MTX
HPLC vialsWaters670650620for HPLC
Potassium phosphate dibasicSinopharm Chemical20032117for HPLC
AcetonitrileJKchemical932537for HPLC
C18 columnWaters186003966for HPLC
HPLC systemShimadzufor HPLC

参考文献

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