إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

Summary

نقدم هنا دليلاً عمليا لبناء نظام متكامل الفحص المجهري، والذي يدمج التقليدية برنامج التحصين الموسع-فلوري التصوير، وتصوير فائقة جزيء واحد القرار القائم على الكشف، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار جزيء واحد التصوير، إلى إنشاء واحدة بطريقة فعالة من حيث تكلفة.

Abstract

مجهر الأسفار أداة قوية للكشف عن الجزيئات البيولوجية في الموقع ورصد ديناميات والتفاعل في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى الفحص المجهري التقليدي برنامج التحصين الموسع-الأسفار، تطورت تقنيات التصوير المختلفة لتحقيق أهداف تجريبية محددة. بعض التقنيات المستخدمة على نطاق واسع وتشمل الأسفار جزيء واحد الرنين نقل الطاقة (سمفريت)، التي يمكن أن تبلغ conformational التغييرات والتفاعلات الجزيئية مع القرار انغستروم، والقائم على الكشف عن جزيء واحد فائقة القرار (SR) التصوير، والذي يمكن أن يعزز هذا القرار المكانية حوالي عشرة إلى توينتيفولد مقارنة بالفحص المجهري حيود محدودة. وهنا يقدم نظام متكامل تصميم العميل الذي يقوم بدمج عدة أساليب التصوير في المجهر واحد، بما في ذلك تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية، تصوير ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك التصوير سمفريت. ويمكن تحقيق أساليب التصوير المختلفة بسهولة وتكاثر بتبديل العناصر البصرية. هذا التشكيل من السهل أن تعتمد أي مختبر البحوث في العلوم البيولوجية مع حاجة إلى روتين وتجارب التصوير المتنوعة في خفض التكلفة والمساحة بالنسبة إلى بناء المجاهر منفصلة لأغراض فردية.

Introduction

مجاهر الأسفار أدوات هامة لبحوث العلوم البيولوجية الحديثة والتصوير الفلورسنت تتم بشكل روتيني في الكثير من مختبرات البيولوجيا. بوضع علامات الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام مع فلوروفوريس، ونحن مباشرة تصور لهم تحت المجهر وتسجيل التغييرات التي تعتمد على الوقت في الترجمة، والمطابقة، والتفاعل، والجمعية الدولة فيفو في أو في المختبر. مجاهر الفلورية التقليدية لدينا قرار حيود محدودة المكاني، الذي هو ~ 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي، وشمال البحر الأبيض المتوسط ~ 500-700 في الاتجاه المحوري^1،2، وهي، لذلك، تقتصر على التصوير في 100s من مقياس نانومتر إلى ميكرون. وقد وضعت بغية الكشف عن التفاصيل الدقيقة في الجمعية الجزيئية أو المنظمة، ميكروسكوبيس ريال المختلفة التي يمكن كسر الحد حيود. وتشمل الاستراتيجيات المستخدمة لتحقيق ريال التأثيرات البصرية غير الخطية، مثل الانبعاثات حفز استنفاد (STED) الفحص المجهري^3،4 والمنظم الإضاءة مجهرية (SIM)^{5،6، 7}، كشف العشوائية لجزيئات مفردة، مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)⁸ وفوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل)⁹، ومزيج من الاثنين، مثل مينفلوكس¹⁰. بين هذه ميكروسكوبيس ريال، يمكن تعديل مجاهر ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد بسهولة نسبيا من هيكل مجهر جزيء واحد. مع التنشيط المتكررة وتصوير فوتواكتيفاتابل البروتينات الفلورية (FPs) أو صور التحويل الأصباغ معلم على الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام، القرار المكانية يمكن أن تصل إلى 10-20 نانومتر¹¹. للحصول على معلومات بشأن التفاعلات الجزيئية و conformational مطلوب الديناميات في القرار في الوقت الحقيقي، انغستروم إلى نانومتر. سمفريت^،من¹²¹³ نهج واحد لتحقيق هذا القرار. عموما، واعتماداً على الأسئلة البيولوجية للفائدة، يلزم أساليب التصوير مع القرارات المكانية المختلفة.

عادة، لكل نوع من التصوير، يلزم تكوين محدد الإثارة و/أو الانبعاثات الضوئية. على سبيل المثال، أحد أساليب الإضاءة الأكثر استخداماً للكشف عن جزيء واحد من خلال الانعكاس الداخلية مجموع (النقل البري)، التي تحتاج إلى تحقيقه من خلال موشور أو من خلال عدسة الهدف بزاوية معينة من إثارة. للكشف عن سمفريت، الانبعاثات من الأصباغ كل من المانحين ويقبلون بحاجة إلى فصل مكانياً والموجهة إلى أجزاء مختلفة من الإلكترون ضرب، جهاز (امككد)، الذي يمكن أن يتحقق مع مجموعة من المرايا وشق شعاع مزدوج اللون وضعت في طريق الانبعاث. ثلاثي الأبعاد (3-D) ريال التصوير، عنصرا بصرية، مثل عدسة أسطوانية¹⁴، تحتاج ليسبب تأثير الاستجماتيزم في مسار الانبعاثات. ولذلك، [هومبويلت] أو مجاهر المتكاملة المتاحة تجارياً، عادة، وظيفيا المتخصصة لكل نوع من التصوير أسلوب وليست مرنة للتبديل بين مختلف أساليب التصوير في إنشاء نفس. نقدم هنا هو نظام هجين فعالة من حيث التكلفة، يوفر قابل للتعديل واستنساخه للتبديل بين ثلاث طرق مختلفة التصوير: تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية مع القرار حيود محدودة، ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد التصوير، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك سمفريت التصوير (الشكل 1A). على وجه التحديد، يتضمن الإعداد المقدمة هنا إلى جانب ألياف الليزر الإدخال للإثارة متعدد الألوان وذراع إضاءة تجارية في مسار الإثارة، الذي يسمح المبرمجة تحكم زاوية الإثارة، للتبديل بين وضع النقل البري الدولي وفي وضع برنامج التحصين الموسع. في مسار الانبعاثات، كاسيت عدسة أسطوانية قابلة للإزالة [هومبويلت] يوضع داخل الجسم المجهر للتصوير ثلاثي الأبعاد بريال، ويوضع مقسم شعاع تجارية قبل كاميرا امككد التي يمكن تمكين بشكل انتقائي للكشف عن قنوات متعددة في الانبعاثات في نفس الوقت.

Protocol

1-المجهر التصميم والجمعية

1. مسار الإثارة
   ملاحظة: يتضمن مسار الإثارة أشعة الليزر ومكونات التباين (DIC) التدخل التفاضلية والجسم مجهر وذراعها الإضاءة.
   1. إعداد جدول ضوئية عزل الاهتزازات. على سبيل المثال، يعطي جدولاً التخميد هيكلية من 48 × 96 x 12 '' مساحة كافية لكافة المكونات.
      ملاحظة: بناء الهيكل في غرفة مع التحكم في درجة الحرارة (مثل، 21.4 ± 0.55 درجة مئوية). استقرار درجة الحرارة أمر حاسم للحفاظ على محاذاة البصري.
   2. تثبيت جهاز مجهر مجهز بذراع إضاءة للاتصال بالألياف الضوئية، 100 × النفط-الغمر TIRF الهدف العدسة، ومكونات DIC.
   3. ضع أربعة رؤساء الليزر (647 نانومتر، 561 نانومتر، 488 نانومتر، و 405 نانومتر، مطوقة الشكل 1B) الحرارة المصارف على الطاولة الضوئية، وتأكد من أشعة الليزر المنبعثة لها نفس الارتفاع وهي قصيرة قدر الإمكان لضمان استقرار جيدة (مثل ، 3 '').
      ملاحظة: إذا كان رأس ليزر يجلس على ارتفاع أقل من غيرها الليزر، وضع صفيحة ألومنيوم بسماكة كافية تحته. دائماً ضمان الحد الأقصى من الاتصال بين المصارف الحرارة والجدول البصرية لتبديد الحرارة أفضل (الشكل 1B). الليزر بحاجة إلى أن تكون قوية بما يكفي لتصوير ريال. انظر الجدول للمواد. من المستحسن أن يكون الليزر تنظيف المرشحات أمام ليزر صمام ثنائي.
   4. تثبيت بطاقة الحصول على بيانات من خلال واجهة interconnect (PCI) مكون طرفية في محطة عمل والاتصال أشعة الليزر باستخدام هذه البطاقة. التحكم في السلوكيات ON/OFF الليزر الترانزستور الترانزستور منطق (TTL) إخراج وتكيفهم السلطة بإخراج تمثيلية لهذه البطاقة (الشكل 1). تثبيت الفحص المجهري سليم التصوير البرمجيات (تجارية أو [هومبويلت]) للتحكم في بطاقة حيازة البيانات، فضلا عن الجسم المجهر.
   5. جبل المرايا وشق شعاع مزدوج اللون (590 و 525 و 470 طويلة تمرير مرشحات) لما يتصاعد منها. استخدام يتصاعد مرآة مستقرة جداً للمرايا. استخدام شق دائري مع الاحتفاظ بحلقات لتجنب ثني أي من شق شعاع مزدوج اللون (الشكل 1).
   6. وضع المرايا وشق شعاع مزدوج اللون على الطاولة الضوئية الجمع بين أشعة الليزر (الشكل 1B). لتحقيق المحاذاة الأكثر استقرارا، تجعل هذا الترتيب كله حسب الاتفاق قدر الإمكان، واستخدام الوظائف البصرية 1 ''-سمك. ترتيب الليزر حيث أن الليزر الطول الموجي أقصر أقرب إلى اقتران الألياف البصرية (الشكل 1B) نظراً للطول الموجي القصير الأضواء تتبدد أكثر في الهواء.
   7. الجمع بين أشعة الليزر في ألياف الضوئية طريقة واحدة. للقيام بذلك، بناء مقرنة ألياف في قفص نظام من خلال الخطوات التالية:
      1. تحميل لوحة محول ألياف في جبل محور ع ترجمة (الشكل 1E، الفريق الموجود في أقصى اليمين).
      2. جبل عدسة يبنوا متعامي (البعد البؤري = 7.5 ملم) في لوحة قفص (الشكل 1E، الفريق الثاني من اليسار).
      3. اتصال أجزاء اثنين أعلاه بمد قضبان شكل قفص. جبل القفص على الطاولة الضوئية مع تصاعد بين قوسين على الوظائف 1 '' سميكة ضوئية (الشكل 1E، الفريق الأوسط).
      4. محاذاة 647-نانومتر الليزر أولاً مع ألياف الضوئية طريقة واحدة (نهاية FC/آسيا والمحيط الهادئ إلى المقرنة).
         ملاحظة: استخدام ألياف البصرية وضع متعددة من قبل استخدام الألياف الضوئية طريقة واحدة قد تساعد عملية المحاذاة محاذاة الخام. ضبط زوايا المرايا وشق شعاع مزدوج اللون (الشكل 1، بالمقابض التكيف)، فضلا عن المسافة بين العدسة يبنوا متعامي ولوحة محول الألياف (الشكل 1E، عن طريق ضبط محور ع الترجمة جبل) للحصول على الليزر أقصى إنتاج الطاقة عن طريق الألياف.
      5. حالما يتم محاذاة أول ليزر، مؤقتاً تثبيت زوج من القزحيات ومحاذاة بقية الليزر واحداً تلو الآخر (الشكل 1F). التحقق من كفاءة المحاذاة مع مقياس طاقة.
      6. ترك واحدة القزحية الجزء الأمامي من لوحة محول للحد من انعكاسات الليزر.
         ملاحظة: قوي الظهر انعكاسات يمكن أن تقلل من عمر مصادر الليزر. بشكل اختياري، يمكن تثبيت عازل بصري أمام كل رئيس الليزر لإزالة الأفكار تماما.
   8. توصيل الطرف الآخر من الألياف الضوئية للذراع إضاءة المجهر (الشكل 1 ح).
   9. تصميم وتثبيت "التكبير عدسة (ماج)" من خلال الخطوات التالية:
      ملاحظة: يمكن استخدام الليزر لتصوير برنامج التحصين الموسع-الأسفار من العينة، ولكن حجم الضيق شعاع الليزر كل حدود المنطقة المضاءة من العينة إلى منطقة عدة مرات أصغر من الحجم الفعلي للاستشعار الكاميرا المقابلة، لا سيما بالنسبة أحدث كاميرات (مع 18.8 مم في طول قطري مقارنة بطول 11.6 ملم التقليدية). وهكذا، من المستحسن توسيع شعاع لتحقيق إضاءة أكبر وتملق للعينة.
      1. تصميم ماج العدسة، والتي يمكن أن تندرج في ذراع الإضاءة (الشكل 1 ح).
         ملاحظة: يعتمد تصميم عدسة ماج على حيث يتم تثبيته. ويبين الشكل 1 ح مثال للتثبيت في الذراع الإضاءة، ولكن يمكن تثبيته في أي بقعة بعد أشعة الليزر وتحديدالمنطقه (انظر المناقشة). التصميم مع التصميم بمساعدة الكمبيوتر وصياغة البرامج.
      2. ضع اثنين achromatic عدسات مقعرة واحدة (البعد البؤري = و₁)، والآخر محدب (البعد البؤري = و₂) في حامل العدسة ماج الصنع (الشكل 2 ألف و 2 (ج))، مع المسافة يساوي مجموع أطوال بهم، و₁ + و₂ = (-25) + 50 = 25 مم (الشكل 2).
         ملاحظة: مع هذا الاختيار لأطوال، عدسة ماج يوسع الشعاع و₂/| إف₁| = طيات 2. توفر العدسة ماج براعة. ويمكن إزالتها باستئناف الإضاءة العادية دون توسيع الحزم (الشكل 2D) أو إدراجها في الاتجاه المعاكس لتركيز شعاع الليزر لتحقيق شدة إثارة أقوى.

2-انبعاث المسار

ملاحظة: مسار الانبعاثات تتكون من عدسة أسطوانية قابلة للإزالة وعجلة تصفية حاجز الفاصل انبعاثات كاميرا امككد (الشكل 1). لتحقيق أفضل نقطة انتشار الدالة (PSF) من جزيئات مفردة، يتم وضع منظور DIC بعيداً عن العدسة والهدف.

1. إدراج مخصص-تصميم كاسيت أسطواني (عدسة ثلاثية الأبعاد)، التي يمكن أن تندرج في محلل DIC اليدوي فتحه في جسم المجهر (الشكل 3).
   ملاحظة: هذا التصميم لا يضر محلل DIC حيث يمكن إدراج كتلة محلل في البرج عامل التصفية.
2. وضع العدسة ثلاثية الأبعاد من 10 أمتار من البعد البؤري في الكاسيت وأدخله في مسار شعاع انبعاث لخلق تأثير الاستجماتيزم اللازمة لاستخراج إحداثي z كل جزيء واحد¹⁴.
   ملاحظة: بشكل اختياري، يمكن وضع كاسيت عدسة ثلاثية الأبعاد أو الخروج من مسار الانبعاثات (الشكل 3).
3. تثبيت تقسيم شعاع مزدوج اللون متعدد فرقة في برج التصفية داخل الجسم المجهر.
4. تثبيت عوامل الانبعاثات.
   ملاحظة: يتم اختيار عوامل الانبعاثات حسب فلوروفوريس المفضل. اعتماداً على وحدة التصوير، تستخدم عوامل الانبعاثات وضعت في مواقع مختلفة كما هو موضح أدناه:
   1. لتصوير متسلسل متعدد الألوان برنامج التحصين الموسع-الأسفار أو تصوير ريال، استخدام مرشحات الانبعاثات توضع في عجلة تصفية حاجز متصل بجانب الجسم المجهر للتقليل من الاهتزاز في الجسم المجهر أثناء تبديل القناة (الشكل 1).
   2. لكشف متعدد الألوان المتزامنة (مثلاً، تجارب سمفريت)، وضع عامل تصفية آخر في الخائن انبعاثات (الاختيار الخطوة 4 للحصول على التفاصيل).
      ملاحظة: عادة، مقسم انبعاث تجارية وضعين للتحويل (أي، "المشاركة" أو "تجاوز" وسائط). لفصل الأضواء الانبعاثات لونياً للتصوير بالألوان متعددة متزامنة (وضع "المشاركة")، يتم استخدام مكعب تصفية عقد شق شعاع مزدوج اللون اثنين وثلاثة عوامل الانبعاثات ("ثلاثية المكعب،" الرقم 4 و 4 د). ويستخدم في تركيبة مع المكعب الثلاثي فتحه فارغة في عجلة تصفية الحاجز. للتصوير بالألوان متعددة متسلسلة، من ناحية أخرى، يتم استبدال المكعب الثلاثي مكعب يحتوي فقط على مرآة داخل ("تجاوز المكعب،" الشكل 4A و 4 د).
5. قم بتثبيت الكاميرا امككد كالجزء الأخير من مسار الانبعاثات. استخدام اتصال USB PCI بتحقيق معدل إطار بسرعة.
   ملاحظة: من المستحسن كاميرا امككد للكشف عن جزيء واحد الأكثر حساسية، ولكن كاميرا سكموس متقدمة يمكن أن تكون بديلاً.

3-حيود محدودة التصوير مع برنامج التحصين الموسع-الإثارة

1. ضبط زاوية عرضية الليزر الإثارة إلى وضع برنامج التحصين الموسع في الذراع الإضاءة.
2. فك الارتباط مع العدسة ثلاثية الأبعاد إذا شارك (الشكل 3، اللوحة اليمنى).
3. إدراج المكعب الالتفافية في التقسيم الانبعاثات (الشكل 4A و 4E، اللوحة السفلية).
4. (اختياري) إدراج العدسة ماج لمنطقة إضاءة موسعة (الشكل 2D، اللوحة اليمنى).
   ملاحظة: مع استخدام عدسة ماج و 100 × النفط-غمر عدسة الهدف، حوالي 91 × 91 ميكرومتر² يمكن أن تكون مضيئة بالتساوي، مما يلغي الحاجة استخدام مصدر ضوء أبيض ومكعبات تصفية متعددة.
5. استخدام الفحص المجهري التصوير البرمجيات اتخاذ متعدد القنوات، و/أو Z-مكدس، والوقت الفاصل بين الصور.
   ملاحظة: هناك العديد من البرامج المتاحة للتصوير المجهري، وليس فقط من الشركات المصنعة للمجهر، بل أيضا من شركات الطرف الثالث أو مفتوحة المصدر للمطورين.

4-متعدد القنوات تصوير جزيء واحد بما في ذلك سمفريت

ملاحظة: نقل إلى موضع "فارغ" في عجلة تصفية الحاجز، حيث أنه يمكن أن تصل إلى جميع الانبعاثات مع أي الطول الموجي للمجموعة الثانية من مرشحات/مزدوج اللون شق شعاع في المقسم والانبعاثات.

1. لإعداد الكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان المعطل تداولها سطح الجزيئات¹⁵ استخدام الإثارة TIRF، بما في ذلك قياس سمفريت، وضبط زاوية الليزر الإثارة عرضية إلى الزاوية TIRF. فض الاشتباك ماج العدسة والعدسة ثلاثية الأبعاد.
2. المشاركة في وضع ثلاث قنوات في التقسيم الانبعاثات (الشكل 1) من خلال الخطوات التالية:
   1. استبدال المكعب الالتفافية مع مكعب "معايرة" الذي يسمح للضوء للذهاب من خلال جميع القنوات (الشكل 4 باء و 4E).
   2. قم بتشغيل الكاميرا تحت DIC (أي، لا يوجد عامل تصفية الانبعاثات في عجلة تصفية الحاجز) وضبط الفتحة المقسم الانبعاثات حتى ثلاث قنوات منفصلة تماما تظهر على الشاشة.
      ملاحظة: إجراء هذه الخطوة مع ضوء غرفة مضاءة، لتصور كل القنوات.
   3. تشغيل مقابض التحكم ضبط رأسية وأفقية في المقسم والانبعاثات ومحاذاة القنوات الثلاث (الشكل 4E و 4F) تقريبا.
   4. إيقاف الكاميرا واستبدال المكعب المعايرة مع مكعب ثلاثية (الشكل 4 و 4E).
   5. ضع عينة مع الخرز متعدد القنوات 100 نانومتر على رأس 100 × عدسة الهدف والتركيز على العينة.
   6. قم بتشغيل الكاميرا والليزر 488 نانومتر والتكبير والتصغير في واحدة من الخرز مشرق وناعما محاذاة القنوات الثلاث التي تحول التكيف التحكم المقابض مرة أخرى (الشكل 4E وز 4).
      ملاحظة: حبات 100 نانومتر الأقنية ينبعث أطوال موجية مختلفة من الضوء على الإثارة 488 نانومتر، تمكين المحاذاة ثلاث قنوات.
3. قم بتشغيل الكاميرا وأشعة الليزر، التركيز، وإيجاد موقف جيد مع كثافة بقعة معقولة. ضبط الوقت الليزر السلطة والتعرض لتحقيق مستويات مقبولة من الإشارات إلى الضجيج وفوتوبليتشينج. استخدام الفحص المجهري برامج التصوير لتأخذ صوراً بمرور الزمن.

5-ريال تصوير

ملاحظة: هذا هو جزيء واحد المستندة إلى الكشف المجهري ريال.

1. لإعداد تصوير ريال، إدراج العدسة ثلاثية الأبعاد وإزالة العدسة ماج. تعيين وقت التعرض للكاميرا في قنوات الليزر المناسبة (مثل، مرض التصلب العصبي المتعدد 5-60). تحديد وتعيين يدوياً زاوية عرضية الليزر الإثارة الأمثل أن تكون الزاوية TIRF.
2. ضع العينة في التصوير المخزن المؤقت¹⁶ريال. تسمح المخزن المؤقت لحجته لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل التصوير.
   ملاحظة: تنتهي ريال التصوير المخزن المؤقت بعد 1 ساعة تقريبا، لذا يجب ريال جديد التصوير المخزن المؤقت تبعاً لذلك.
3. تأخذ صورة DIC قبل تصوير ريال. بغية إيجاد ارتفاع الهدف الصحيح لريال، الذي يحسن تأثير الاستجماتيزم، استخدم DIC التصوير للعثور على الطائرة المتوسطة للخلايا. تعريف الطائرة بالارتفاع الذي الخلايا الانتقال من "الخفيفة" بالصور "الظلام" ويبدو أن تصبح شفافة (الشكل 5Aو 5B وج 5). حالما يتم تحديد المستوى البؤري المطلوب، إشراك نظام تصحيح z-الانجراف (الشكل 1A).
4. إجراء تصوير ريال. تغيير قوة 405 نانومتر الليزر للحفاظ على كثافة معقولة 'وامض على' البقع.
   ملاحظة: في حين أنه من الممكن لتغيير الليزر 405 نانومتر يدوياً، أكثر ملاءمة لتشغيل رمز اقتناء بيانات مبرمجة للحفاظ على كثافة البقع "امض على". هنا مثال عن كيف تتم تلقائياً. شفرة المصدر متاح عند الطلب (الشكل 6).
   1. بدء الحصول على التصوير مع 0 واط/سم² الليزر البنفسجي السلطة.
   2. عد الوميض على البقع في فترة زمنية معينة.
   3. تعدل قوة الليزر البنفسجي حيث أن يتم الإبقاء على عدد البقع وامض على عتبة المعرفة من قبل المستخدم "عد" في مجال الرؤية. زيادة قوة الليزر البنفسجي عندما ينخفض عدد البقع وامض على عتبة عد الأصوات.
   4. إنهاء اقتناء عندما ينخفض عدد البقع وامض على عتبة العد باستخدام قوة الليزر البنفسجي الأقصى.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الحد الأقصى لتعيين بشكل مختلف اعتماداً على سطوع عينة، ولكن لا يزيد عن 130 واط/سم². اعتماداً على الهدف الفعلي لتصوير ريال، يمكن إنهاء هذه التعليمات البرمجية الحصول التلقائي يدوياً في أي وقت تريده.
5. تحقق من سلوك وامض وبسفس البقع قريبا بعد بداية اقتناء.
   ملاحظة: إذا كان سلوك وامض ليست مثالية، تغيير زاوية عرضية الليزر الإثارة أو استبدالها في المخزن المؤقت للتصوير. تتوقع أخذ عينات "عمودي"، "الأفقي" والأشكال "الماس" من PSF، تمثل فلوروفوريس من أسفل، أعلاه، وضمن المستوى البؤري، على التوالي (الشكل 5). إذا كان إظهار معظم البقع بسفس الأفقي أو العمودي، ثم المستوى البؤري إيقاف من مركز الخلايا وحتى إنهاء التجربة وضبط المستوى البؤري مرة أخرى. وجود فقاعة هواء في النفط الغمر أو غيرها من العوامل المحلية يمكن أن تؤثر على نوعية بسفس، ولذلك قد يكون من الضروري لاستبدال النفط أو تغيير إلى منطقة تصوير مختلفة للعينة.
6. لتحليل البيانات، استخدام المصدر المفتوح (في الإضافات إيماجيج المعاهد الوطنية للصحة) أو الرموز المتاحة تجارياً للكشف عن سينترويدس لكل نقطة في كل إطار التصوير واستخراج قيم z لكل نقطة من عرض x و y¹⁴.
   ملاحظة: في هذا التقرير، رمز مصدر وضعت أصلاً في واحدة من أقرب جزيء واحد على أساس الكشف عن ريال⁸ تعديل للكشف عن ثلاثي الأبعاد¹⁶ وتم استخدامه.
7. وفي حالة التصوير باللونين، صورة فلوروفوري مع الطول الموجي الإثارة وقتاً أطول، تليها واحدة مع الطول الموجي أقصر الإثارة. تشغيل التعليمات البرمجية اقتناء الآلي وبالمثل إلى الموضحة في الخطوة 5، 4، ولكن مع ليزر تصوير مختلفة.
   ملاحظة: يجب تصحيح لوني بين الصور مع فلوروفوريس مختلفة (مثلاً، والصبغ الأحمر والصبغ الأصفر والأخضر). هنا هي الخطوات.
   1. شل عدة حبات الأقنية 100 نانومتر على ساترة زجاجية، تجنب تكوين مجموعات.
   2. التقاط صور منها في قنوات مختلفة من الإثارة.
   3. استخراج (X, Y, Z) بتنسيق من البرمجيات (الخطوة 5، 6).
   4. ارسم ΔX_أنا = X-_1i X 2_طاء والمادة ΔY_i = Y_1i -ص_2i (لحبات مختلفة و 1 و 2 قنوات الألوان المختلفة) كل على حدة ويصلح لهم مع الوظائف المناسبة. حفظ المهام.
      ملاحظة: الوظائف الخطية كافية في معظم الحالات. حالما يتم تحديد هذه المهام، ليس لديه هذا القياس بأن يتكرر في كل مرة للتصوير.
   5. في تصوير ريال اللونين الفعلية عينة من الفائدة، تطبيق الوظائف إلى زيغ الصحيحة (X, Y). للاتجاه z زيغ، القيام بالحصول على ΔZ = ض₁ -ض₂ حبات الأقنية أو عينات مرجعية معروفة الأقنية المصنف جنبا إلى جنب مع عينة الفائدة.
      ملاحظة: عكس (س، ص) زيغ، الاتجاه z زيغ ليس جيدا استنساخه في كل تجربة، ويرجع ذلك أساسا إلى صيانة غير كاملة الاتجاه z التركيز عند التبديل القناة. ومن ثم، يوصي بإجراء التصحيح في كل مرة. ΔZ = ض₁ -ض₂ في الغالب مستقلة (X, Y)، حتى مجرد عدد قليل من حبات أو العينات المرجعية سيكون كافياً كل منطقة عينة كل الاهتمام. ارسم الصور ريال اللونين النهائية شيدت في برمجيات تصور ثلاثي الأبعاد وتحقق ΔZ يدوياً.

النتائج

ويسمح هذا المجهر مرنة واستنساخه بالتبديل بين مختلف أساليب التصوير. هنا نعرض عينة من الصور التي تم جمعها مع كل وحدة التصوير.

يوضح الشكل 5 PSF جزيء وامض في أثناء اقتناء ريال. يتم بناؤها الآلاف من مثل هذه الصور لإنشاء الصورة الن...

Discussion

نظام المجهر الهجين هذا يلغي الحاجة إلى شراء مجاهر متعددة. التكلفة الإجمالية لجميع أجزاء، بما في ذلك الجدول البصرية، والبرمجيات والجدول التثبيت العمالة ومحطة العمل، هو حوالي 230,000 دولار. أجزاء آلة مخصصة، بما في ذلك ماج العدسة والعدسة ثلاثية الأبعاد، ويتكلف حوالي مبلغ 700 (التكلفة تعتمد على ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E microscope stand	Nikon	Ti-E
Objective lens	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M	This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block	Nikon	Ti-A	This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system	Nikon	PFS	This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top	TMC	783-655-02R
Optical table bases	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink	Cobolt	11658 (HS-03)	Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink	Coherent	1193289	Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable	L-com	CC58C-6	RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter	L-com	BA1087	Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optical Filter Changer
Emission Splitter	Cairn	OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter	Chroma	ET700/75M	Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET595/50M	Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET525/50M	Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set	Chroma	49000	installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 long pass filter	Chroma	T590LPXR-UF1	for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter	Chroma	T525LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter	Chroma	T470LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647)	Chroma	zet640/20x	for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488)	Semrock	LL01-488-25	for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source	Excelitas	X-Cite120LED	used only for DAPI imaging
Mirror mount	Newport	SU100-F3K
Optical posts	Newport	PS-2
Clamping fork	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring	Thorlabs	CMRR	used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount	Thorlabs	SM1Z	Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible
Achromatic Doublet lens	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm
Cage Plate	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap
Cage Assembly Rod	Thorlabs	ER4	Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm
Cage Mounting Bracket	Thorlabs	CP02B	30 mm Cage Mounting Bracket
Single mode optical fiber	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multi mode optical fiber	Thorlabs	M42L01	Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens"
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens"
Retaining ring	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens"
Nylon-tipped screw	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens"
3D lens	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, rectangular cylindrical lens
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 888
100 nm multichannel beads	Thermo	T7279, TetraSpeck microspheres
red dye	Thermo	Alexa Fluor 647
yellow-green dye	GE Healthcare	Cy3
green dye	GE Healthcare	Cy3B
blue dye	Thermo	Alexa Fluor 488