Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Özet

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Özet

Floresans mikroskobu biyolojik moleküller üzerine çalışmaları in situ algılamak ve onların dinamiği ve etkileşim gerçek zamanlı olarak izlemek için güçlü bir araçtır. Geleneksel epi-floresan mikroskopi ek olarak, belirli deneysel hedeflere ulaşmak için çeşitli görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Bazı yaygın olarak kullanılan teknikler konformasyon değişiklikler ve angstrom çözünürlük ve tek molekül algılama tabanlı moleküler etkileşimleri bildirebilirsiniz tek molekül floresans rezonans enerji transfer (smFRET), dahil uzaysal çözünürlüğü için yaklaşık on twentyfold kırınım-sınırlı Mikroskopi için karşılaştırıldığında artırabilir görüntüleme-Süper çözünürlük (SR). Burada bir mikroskop, geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı SR görüntü ve çok renkli tek molekül algılama dahil olmak üzere birden çok görüntüleme yöntemleri birleştirir bir müşteri tasarlanmış entegre sistemi, mevcut, smFRET görüntüleme dahil olmak üzere. Farklı görüntüleme yöntemleri kolayca ve tekrarlanarak optik öğeleri geçiş yaparak elde edilebilir. Bu kurulum rutin ve düşük maliyet ve bireysel amaçlar için ayrı mikroskoplar bina göre alan çeşitli görüntüleme deneyler için bir ihtiyaç ile Biyoloji Bilimleri herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından evlat edinmek kolaydır.

Giriş

Floresans mikroskoplar modern biyolojik bilim araştırma için önemli araçlar ve floresan görüntüleme düzenli olarak birçok biyoloji laboratuvarlarında yapılan. Biomolecules fluorophores ile ilgi etiketleyerek, biz doğrudan onları mikroskop altında görselleştirmek ve yerelleştirme, uyum, etkileşim ve derleme devlet içinde VIVO veya vitrozamana bağımlı değişiklikleri kaydetmek. Geleneksel floresan mikroskoplar ~ 200-300 nm yanal yönde ve ~ 500-700 nm eksenel yönde^1,2ve vardır, bu nedenle, düşsel vasıl 100'ler için sınırlı olduğunu bir kırınım-sınırlı kayma çözünürlüğe sahip nanometre mikron ölçek. Moleküler derleme veya kuruluşunuzdaki ince ayrıntıları ortaya çıkarmak için kırınım sınırı zarar verebilir çeşitli SR microscopies geliştirilmiştir. SR elde etmek için kullanılan stratejiler içerir uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi^3,4 ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)^5,6, gibi doğrusal olmayan optik etkileri ⁷, Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)⁸ ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM)⁹ve MINFLUX¹⁰gibi her ikisinin bir birleşimi gibi tek moleküllerin Stokastik algılama. Bu SR microscopies arasında tek molekül algılama tabanlı SR mikroskoplar tek molekül mikroskop set-up nispeten kolayca değiştirilebilir. Tekrarlayan harekete geçirmek ve photoactivatable floresan proteinler (FPs) veya fotoğraf değiştirilebilir boyalar üzerinde ilgi biomolecules öğesini görüntüleme ile Uzaysal Çözünürlük 10-20 nm¹¹ulaşabilirsiniz. Moleküler etkileşimleri ve konformasyon bilgi elde etmek için gerçek zamanlı, angstrom nanometre çözünürlükte dynamics gereklidir. smFRET^12,13 bu çözünürlük elde etmek için bir yaklaşımdır. Genel olarak, faiz biyolojik sorular bağlı olarak, görüntüleme yöntemleri farklı uzamsal çözünürlük ile ihtiyaç vardır.

Tipik olarak, görüntüleme her türü için belirli uyarma ve/veya emisyon optik yapılandırmasına gerek yoktur. Örneğin, tek molekül algılama için en sık kullanılan aydınlatma yöntemlerden birini belirli uyarma açı bir prizma veya objektif lens yoluyla ulaşılması gereken toplam iç yansıma (tır), geçer. SmFRET tespiti için donör ve alıcısı boyalar emisyonları dağınık şekilde ayrılmış olup elektron-çarpımı, şarj kuplajlı birtakım aynalar ve dikroik ışın ayırıcılar ile elde edilebilir cihaz (EMCCD), farklı bölümlerine yönelik gerek emisyon yolundaki yerleştirilir. Üç boyutlu (3-D), düşsel bir optik, bir bileşen bir silindirik objektif¹⁴, SR emisyon yolundaki bir astigmat etkiye neden için gereklidir. Bu nedenle, homebuilt veya piyasada bulunan entegre mikroskoplar genellikle, işlevsel olarak görüntüleme yöntemi her türü için uzmanlaşmış olan ve aynı kurulum üzerinde farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş yapmak için esnek değildir. Burada üç farklı görüntüleme yöntemleri arasında ayarlanabilir ve tekrarlanabilir anahtarları sağlayan bir maliyet-etkin, hibrid sistemi mevcut: kırınım-sınırlı çözünürlük, tek molekül algılama tabanlı SR ile geleneksel epi-floresan görüntüleme görüntü ve çok renkli tek molekül algılama, smFRET (Şekil 1A) görüntüleme dahil olmak üzere. Özellikle, burada sunulan set-up fiber birleştiğinde giriş lazerler çok renkli uyarma için içerir ve epi- ve tır modları arasında geçiş yapmak için uyarma açı kontrolünü sağlar uyarma yolunda bir ticari aydınlatma kol programlanmış. Emisyon yolundaki bir çıkarılabilir homebuilt silindirik objektif Kaset 3-b SR görüntüleme için mikroskop gövdesi içinde yerleştirilir ve bir ticari ışın ayırıcı seçerek birden fazla emisyon kanal algılamak için etkin bir EMCCD kamera önce yerleştirilir aynı anda.

Protokol

1. mikroskop tasarım ve montaj

1. Uyarma yolu
   Not: Lazerler, fark girişim kontrast (DIC) bileşenleri, mikroskop beden ve onun aydınlatma kol uyarma yolu içerir.
   1. Titreşim izole optik masa hazırlamak. Örneğin, bir yapısal amortisörleri tablosu 48 x 96 x 12'' tüm bileşenler için yeterli alan sunuyor.
      Not: kurulum ile sıcaklık kontrolü (Örneğin, 21.4 ± 0.55 ° C) bir odada kurmak. Sıcaklık kararlılığı optik uyum korumak açısından önemlidir.
   2. Fiber optik bağlantı için bir aydınlatma kol ile donatılmış bir mikroskop vücut yüklemek bir 100 X Petrol-daldırma TIRF objektif lens ve DIC bileşenleri.
   3. Dört lazer kafaları yerleştirin (647 nm, 561 nm, 488 nm ve 405 nm, Şekil 1Badımında çevrili) ve optik masada onların ısı lavabolar ve aynı yükseklik ve vardır (Örneğin iyi istikrarı sağlamak olabildiğince kısa emin olun verilmiş lazer ışınları var 3'').
      Not: Eğer bir lazer kafa diğer lazerler daha kısa bir yükseklikte, altındaki yeterli kalınlığı ile bir alüminyum plaka koymak. Her zaman ısı alıcıları ve optik tablo için en iyi ısı dağılımı (Şekil 1B) arasında en fazla temas emin olun. Lazerler SR görüntüleme için güçlü olmak gerekir. Malzemelerin tabloyabakın. Bu lazer temizlik filtreleri diyot lazerler önünde olması tavsiye edilir.
   4. Bir iş istasyonu bir veri edinme kartı bir çevre birimi bileşen bağlantısı (PCI) arabirimi üzerinden yüklemek ve lazerler bu kart ile bağlayın. Lazerler ON/OFF davranışları çıkış transistör transistör mantık (TTL) tarafından ve bu kartın (Şekil 1 c) analog çıkış tarafından kendi güç ayarı denetler. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı (ticari veya homebuilt) veri alma kartı denetlemek için uygun bir mikroskobu mikroskop vücut yanı sıra yükleyin.
   5. Aynalar ve dikroik ışın kırma (590, 525 ve uzun filtreler geçiş 470) onların anılan sıraya göre bağlar için mount. Çok istikrarlı ayna bağlar için ayna kullanın. Dairesel kırma yüzük istinat ile herhangi bir dikroik ışın kırma (Şekil 1 d) eğilmesini önlemek için kullanın.
   6. Aynalar ve dikroik ışın kırma lazer ışınları (Şekil 1B) birleştirmek için optik masaya koyun. En istikrarlı hizalama sağlamak için tüm anlaşma mümkün olduğunca kompakt ve 1''-kalınlık optik mesaj kullanabilirsiniz. Kısa dalga boyu ışıklar daha havada dağıtmak bu yana kısa dalga lazerler fiber optik bağlantı (Şekil 1B) daha yakın olacak lazerler düzenleyin.
   7. Lazer ışınları bir tek modlu fiber optik birleştirmek. Bunu yapmak için aşağıdaki adımlarda bir kafes sisteminde bir fiber bağlantı kurmak:
      1. Bir z ekseni çeviri Mount (Şekil 1E, en soldaki panel) fiber adaptör plaka bağlayın.
      2. Bir akromatik tamamen objektif mount (odak uzaklığı 7.5 mm =) bir kafes plaka (Şekil 1E, soldan ikinci panel).
      3. Yukarıda iki bölümü arasında uzantısı çubuklar tarafından bir kafes oluşturmak için bağlantı. Kafes parantez 1''-kalın optik yazılarda (Şekil 1E, orta panel) montaj ile optik masaya monte.
      4. 647-nm lazer ilk tek modlu optik fiber (FC/APC sonuna coupler) ile hizalayın.
         Not: tek modlu fiber optik kullanmadan önce bir çok modlu fiber optik kullanarak bir kaba hizalama hizalama işlemi yardımcı olabilir. Aynalar ve dikroik ışın kırma (Şekil 1 d, ayarlama topuzlar tarafından), açılarını yanı sıra akromatik tamamen objektif ve lif adaptör plaka (z ekseni çeviri Dağı ayarlayarak1E rakam,) arasındaki mesafeyi ayarlamak kazanmak için en yüksek lazer fiber üzerinden çıkış gücü.
      5. İlk lazer hizalama işlem tamamlandıktan sonra geçici olarak süsen çifti yüklemek ve geri kalanı lazerler teker teker (Şekil 1F) hizalayın. Hizalama verimliliği ile güç ölçeri denetleyin.
      6. Bir gözü önünde lazerler yansımaları azaltmak için adaptör plaka bırakın.
         Not: Güçlü geri yansımaları lazer kaynakları ömrünü azaltabilir. İsteğe bağlı olarak, bir optik İzolatör yansımaları tamamen kaldırmak için her lazer kafa önünde yüklenebilir.
   8. Diğer ucunu fiber optik mikroskobu (Şekil 1 H) aydınlatma kol bağlayın.
   9. Tasarım ve "büyütme objektif (mag objektif)" aşağıdaki adımlarda yükleyin:
      Not: Lazerler örnek epi-floresan görüntüleme için kullanılabilir, ancak her lazer dar demet boyutunu örnek bir alana karşılık gelen fotoğraf makinesi sensörünün gerçek boyutundan daha küçük birkaç kez ışıklı alan özellikle için yeni sınırlar kameralarla (köşegen uzunluğu geleneksel 11,6 mm uzunluğa göre 18.8 mm). Böylece, bu örnek daha büyük ve daha düz aydınlatma elde etmek için ışın genişletmek için tercih edilir.
      1. Aydınlatma kol (Şekil 1 H) sığabilecek mag lens tasarımı.
         Not: Mag lens tasarımı nerede yüklü üzerinde bağlıdır. Şekil 1 H aydınlatma kolundan yükleme örneği gösterir ama sonra lazer ışınları collimated (bkz: tartışma) herhangi bir yerde yüklenebilir. Bir bilgisayar destekli tasarım ve çizim yazılımı ile tasarlayabilirsiniz.
      2. Koyun iki achromatic lens, bir içbükey (odak uzaklığı = f₁) ve bir konveks (odak uzaklığı = f₂) onların odak uzunlukları toplamı, için f_{1 eşit mesafe ile ev yapımı mag objektif tutucu (Şekil 2A ve 2 C),} + f₂ (-25) = + 50 = 25 mm (Şekil 2B).
         Not: Bu odak uzaklık seçeneği ile mag objektif ışın f₂tarafından genişletir / | f₁| = 2 pas geçiyor. Mag lens çok yönlülük sağlar. Normal aydınlatma kirişler (Şekil 2B) genişleyen olmadan devam etmek için kaldırılabilir veya daha güçlü bir uyarma yoğunluğu elde etmek için lazer ışını odaklanmak için ters yönde eklenir.

2. emisyon yol

Not: Emisyon yol çıkarılabilir bir silindirik lens, bir bariyer filtresi tekerlek, bir emisyon splitter ve bir EMCCD kamera (Şekil 1G) oluşur. En iyi noktaya ulaşmak için işlev (PSF) tek moleküllerin yaymak, DIC prizma uzak objektif lens alınır.

1. Özel-tasarım el ile DIC çözümleyicisine sığabilecek silindirik objektif (3-b objektif) kaset yuvası (Şekil 3 c) mikroskop gövdesine yerleştirin.
   Not: bir Çözümleyicisi blok filtre tarete eklenebilir bu yana bu tasarım DIC analyzer ödün vermeyen.
2. 3-b lens odak uzaklığı 10 m kasete ve astigmat etkisi her molekülünü¹⁴z koordinatı ayıklamak için gerekli oluşturmak için emisyon ışını yolun içine yerleştirin.
   Not: İsteğe bağlı olarak, 3-b objektif kaset içinde ya da dışında emisyon yol (Şekil 3 c) yerleştirilebilir.
3. Bir çok bantlı dikroik ışın ayırıcı filtre taret mikroskop vücut içinde yükleyin.
4. Emisyon filtreleri yükler.
   Not: Emisyon filtreler tercih edilen fluorophores bağlı olarak seçilir. Görüntüleme modülü bağlı olarak, farklı konumlarda yerleştirilmiş emisyon filtreler aşağıda açıklandığı gibi kullanılır:
   1. Sıralı çok renkli epi-floresan görüntüleme veya SR görüntüleme için mikroskop vücuttaki titreşim kanal anahtarı (Şekil 1G) sırasında en aza indirmek için mikroskop cesedin yanında bağlı bariyer filtresi tekerlek yerleştirilen emisyon filtreleri kullanın.
   2. Eşzamanlı çoklu renk algılama için (Örneğin, smFRET deneyleri), başka bir filtre bir emisyon splitter (onay adım 4 Ayrıntılar için) set koyun.
      Not: Genellikle, iki değiştirilebilir modu (yani, "meşgul" veya "atlamak" modları) bir ticari emisyon splitter vardır. İki dikroik ışın ayırıcılar ve üç emisyon filtre tutan bir filtre küp chromatically eşzamanlı çoklu renk görüntüleme ("Nişanlı" modu) için emisyon ışıklar ayırmak için kullanılır ("Üçlü küp," rakam 4 c ve 4 D). Bariyer filtresi tekerlek boş bir yuvaya çift küp ile birlikte kullanılır. Öte yandan, sıralı çok renkli görüntüleme için üçlü küp sadece bir ayna ("yan yol küp," Şekil 4A ve 4 D) içinde olan bir küp değiştirilir.
5. EMCCD kamera emisyon yolun son parçası olarak yükleyin. Hızlı kare hızı elde etmek için USB-PCI bağlantı kullanmak.
   Not: Bir EMCCD kamera en hassas tek molekül algılama için tavsiye edilir, ama bir Gelişmiş sCMOS kamera bir alternatif olabilir.

3. kırınım-sınırlı Epi-uyarma ile görüntüleme

1. Epi-aydınlatma kol modunda uyarma lazerler arızi açıya ayarlayın.
2. 3-b objektif olsa (Şekil 3 c, doğru kapı aynası) meşgul kapatın.
3. Yan yol küp emisyon splitter (Şekil 4A ve 4E, alt paneli) yerleştirin.
4. (İsteğe bağlı) Mag objektif genişletilerek aydınlatma alanı (Şekil 2B, sol panelde) için ekleyin.
   Not: bir mag lens ve 100 X Petrol-daldırma objektif lens kullanımı ile yaklaşık 91 x 91 µm² eşit olarak, beyaz bir ışık kaynağı ve birden çok filtre küpleri kullanma gereksinimini ortadan kaldırarak aydınlatılmış.
5. Bir mikroskobu görüntüleme yazılımı çok kanallı, almak ve/veya Z-yığın ve/veya Hızlandırılmış resimler kullanın.
   Not: Mikroskobu görüntüleme, sadece mikroskop üreticilerin aynı zamanda üçüncü taraf şirketler veya açık kaynak geliştiricileri için kullanılabilir birden çok program vardır.

4. çok kanallı Imaging tek molekül de dahil olmak üzere smFRET

Not: herhangi bir dalga boyu ile tüm emisyon emisyon splitter filtreler/dikroik ışın kırma ikinci kümesi ulaşabilirsiniz bariyer filtresi tekerlek "boş" bir konuma taşıyın.

1. Çok renkli tek molekül tespiti TIRF uyarma, smFRET ölçüm, dahil olmak üzere kullanarak yüzey immobilize molekülleri¹⁵ ayarlamak için uyarma lazerler arızi açı TIRF açıyla ayarlayın. Mag lens ve 3-b lens kapatın.
2. Üç kanallı modu aşağıdaki adımlarda emisyon splitter (Şekil 1G) meşgul:
   1. Bir "kalibrasyon küp" ile bypass cube yerine tüm kanallardan (Şekil 4B ve 4E) gitmek ışık sağlar.
   2. DIC (yani, hiçbir emisyon filtre bariyer filtresi tekerlek) altında kamera açmak ve üç tamamen ayrı kanal ekranda görününceye kadar emisyon splitter diyafram ayarlamak.
      Not: oda ışığı yaktı, tüm kanallar görselleştirmek için bu adımı gerçekleştirin.
   3. Yatay/dikey ayarı kontrol düğmeleri emisyon splitter açmak ve kabaca üç kanal (Şekil 4E ve 4F) hizalayın.
   4. Fotoğraf makinesini kapatın ve kalibrasyon küp çift küp (Şekil 4 c ve 4E) ile değiştirin.
   5. Bir örnek ile 100 X objektif lens ve odak üstünde 100-nm çok kanallı boncuk örnek üzerinde yerleştirin.
   6. Kamera ve 488-nm lazer açın, bir parlak boncuk üzerinde yakınlaştırma ve ince ayar kontrol düğmeleri yeniden (Şekil 4E ve 4 G) açarak üç kanal hizalayın.
      Not: 488-nm uyarma, üç kanallı hizalama etkinleştirme üzerine ışık farklı dalga boylarında 100-nm çok kanallı boncuk yayarlar.
3. Kamera ve lazerler, odak açmak ve makul bir nokta yoğunluğu ile iyi bir pozisyon bulmak. Lazer güç ve pozlama zaman kabul edilebilir sinyal-gürültü ve photobleaching seviyeleri elde etmek için ayarlayın. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı mikroskobu hızlandırılmış fotoğraf çekmek için kullanın.

5. SR görüntüleme

Not: Bu tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu olduğunu.

1. SR görüntüleme yukarı ayarlamak için 3-b objektif ekleyebilir veya mag objektif kaldırabilir. Kameranın çekim hızı (Örneğin, 5-60 ms) uygun lazer kanallarında ayarlayın. Belirlemek ve en uygun uyarma lazerler arızi açı TIRF açı için el ile ayarlayın.
2. Örnek arabellek¹⁶Imaging SR yerleştirin. Arabellek en az 10 dk önce görüntüleme için equilibrate izin.
   Not: SR görüntüleme arabellek yaklaşık 1 saat sonra sona eriyor, bu nedenle yeni SR arabellek buna göre görüntüleme olun.
3. DIC görüntü SR görüntüleme önce al. Doğru objektif yükseklik astigmat etkisi en iyi duruma getirir, SR için bulmak için hücrelerin orta uçak bulmak için Imaging DIC kullanın. Uçağın yükseklik tarafından hücreleri "karanlık" resimlere geçiş "light" ve şeffaf olmak için görünür tanımlamak (Şekil 5A, 5Bve 5 C). İstenen odak düzlemi belirlendikten sonra z-drift düzeltme sistemi (Şekil 1A) meşgul.
4. SR görüntüleme kuralları. 405 nm lazer güç noktalar 'yanıp sönen-açık' makul bir yoğunluğu korumak için değiştirin.
   Not: 405 nm lazer el ile değiştirmek mümkün olsa da, "yanıp sönen-tarih" noktalar yoğunluğu korumak için programlanmış veri alma kodu çalıştırmak daha uygun olur. İşte bir örneği nasıl otomatik olarak yürütülür. Kaynak kodu (Şekil 6) istek üzerine mevcuttur.
   1. Görüntüleme edinme 0 W/cm² menekşe lazer güç ile başlayın.
   2. Yanıp sönen üzerinde noktalar belli bir süre içinde saymak.
   3. Böylece yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını eşiğin bir kullanıcı tarafından tanımlanan"sayım" görüş alanı içinde tutulur menekşe lazer güç modüle. Yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını sayım eşiğin altına düştüğünde menekşe lazer gücünü arttırın.
   4. Yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını en fazla menekşe lazer güç kullanarak sayım eşiğin altına düştüğünde satın sonlandırın.
      Not: En fazla örnek parlaklık bağlı olarak farklı şekilde ayarlanmış, ancak 130 W/cm²' den daha yüksek olabilir. SR görüntüleme gerçek amacı bağlı olarak, bu otomatik satın alma kodu el ile istediğiniz herhangi bir noktada sonlandırılabilir.
5. Yanıp sönen davranış ve PSFs noktalar yakında satın başladıktan sonra kontrol edin.
   Not: Eğer yanıp sönen davranış ideal değil, uyarma lazerler arızi açısını değiştirebilir veya görüntüleme arabellek değiştirin. "Dikey", "yatay" ve "elmas" şekilleri fluorophores aşağıdan, yukarıda ve odak düzlemi içinde sırasıyla temsil eden PSF, (Şekil 5 d) bir örnekleme bekliyoruz. Çoğu noktalar dikey veya yatay PSFs gösterirsen, sonra odak düzlemi hücreleri Merkezi'nden kapalıdır, bu yüzden deneme sonlandırmak ve yine odak düzlemi ayarlamak. Yağ değiştirmek veya örnek bir farklı görüntüleme alanına değiştirmek gerekli olabilir bu yüzden hava kabarcığı Daldırma yağ veya diğer yerel faktörler varlığı PSFs kalitesini etkileyebilir.
6. Veri analizi için her spot cisimlerin görüntüleme her çerçevede algılamak ve x ve y genişlikleri¹⁴her spot z değerlerini ayıklamak için (NIH ImageJ eklentileri içinde) açık kaynak veya piyasada bulunan kodları kullanın.
   Not: Bu rapordaki orijinal erken tek molekül algılama tabanlı SR⁸ birinde gelişmiş bir kaynak kodu için 3-b algılama¹⁶ güncellenmiştir ve kullanılmıştır.
7. İki renkli görüntüleme söz konusu olduğunda, daha kısa uyarma dalgaboyu olan ardından uzun uyarma dalga boyu ile fluorophore görüntü. Otomatik satın alma kodu aynı şekilde adım 5,4, ancak farklı bir görüntüleme lazer ile açıklanan bir çalıştırın.
   Not: renk sapmaları görüntü farklı fluorophores (Örneğin, kırmızı boya ve sarı-yeşil boya) ile arasında düzeltilmelidir. Burada adımlar vardır.
   1. Birden fazla 100-nm çok kanallı boncuk kümeleri şekillendirme kaçınarak cam coverslip üzerinde hareketsiz.
   2. Onları farklı uyarma kanalları görüntülerini almak.
   3. Özü onların (X, Y, Z) yazılımı (adım 5.6) tarafından koordine eder.
   4. ΔX_ben Arsa = X_1I -_2i ve ΔY_i X Y_1I - Y_2i = (ben için farklı boncuk ve 1 ve 2 farklı renk kanalları) ayrı ayrı ve bunları uygun işlevleriyle uygun. İşlevleri kaydedin.
      Not: Doğrusal fonksiyonlar çoğu durumda yeterlidir. Bir kez bu işlevler belirlenir, bu ölçüm görüntüleme her seferinde yinelenmesi sahip değil.
   5. Bir örnek ilgi gerçek iki renkli SR görüntüleme içinde işlevleri (X, Y) doğru renk sapmaları için geçerlidir. Z yönlü renk sapmaları için ΔZ elde ederek yapmak = Z₁ - Z₂ çok kanallı boncuk ya da bilinen başvuru çok kanallı örnekleri faiz örnek ile birlikte tohumlari için.
      Not: (X, Y) farklı renk sapmaları, z yönlü renk sapmaları iyi-tekrarlanabilir kanal geçiş üzerine ağırlıklı olarak eksik z yönlü odak bakım nedeniyle her denemede değil. Bu nedenle, bu her zaman düzeltme yapmak için tavsiye edilir. ΔZ = Z₁ - Z₂ çoğunlukla (X, Y), bağımsız olarak sadece birkaç boncuk veya başvuru örnekleri ilgi her örnek alan yeterli olurdu. İnşa son iki renkli SR görüntüleri bir 3-D görüntüleme yazılımındaki arsa ve ΔZ el ile denetleyin.

Sonuçlar

Bu mikroskop esnek ve tekrarlanabilir farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş sağlar. Burada her görüntüleme modülü ile toplanan örnek resimleri göster.

Şekil 5 d üzerinde yanıp sönen molekül PSF SR alım sırasında gösterir. Böyle görüntüleri binlerce son SR görüntü (Şekil 5E) oluşturmak için yeniden. Şekil 5E...

Tartışmalar

Bu melez mikroskop sistem birden fazla mikroskoplar satın almak için ortadan kaldırır. Optik tablo, tablo yükleme işçilik, yazılım ve iş istasyonu, dahil bütün parçalar için maliyet yaklaşık $230.000 toplamdır. Mag lens ve 3-b lens, dahil, özel işlenmiş parçalar yaklaşık 700 $ (farklı kurumları gerçek masrafları maliyeti bağlıdır) maliyet. Tipik piyasada bulunan entegre sistemleri tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu fazla 300.000 $ maliyet için ~ 400.000 ve değil kolayca smFRET ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E microscope stand	Nikon	Ti-E
Objective lens	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M	This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block	Nikon	Ti-A	This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system	Nikon	PFS	This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top	TMC	783-655-02R
Optical table bases	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink	Cobolt	11658 (HS-03)	Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink	Coherent	1193289	Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable	L-com	CC58C-6	RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter	L-com	BA1087	Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optical Filter Changer
Emission Splitter	Cairn	OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter	Chroma	ET700/75M	Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET595/50M	Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET525/50M	Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set	Chroma	49000	installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 long pass filter	Chroma	T590LPXR-UF1	for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter	Chroma	T525LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter	Chroma	T470LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647)	Chroma	zet640/20x	for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488)	Semrock	LL01-488-25	for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source	Excelitas	X-Cite120LED	used only for DAPI imaging
Mirror mount	Newport	SU100-F3K
Optical posts	Newport	PS-2
Clamping fork	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring	Thorlabs	CMRR	used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount	Thorlabs	SM1Z	Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible
Achromatic Doublet lens	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm
Cage Plate	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap
Cage Assembly Rod	Thorlabs	ER4	Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm
Cage Mounting Bracket	Thorlabs	CP02B	30 mm Cage Mounting Bracket
Single mode optical fiber	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multi mode optical fiber	Thorlabs	M42L01	Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens"
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens"
Retaining ring	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens"
Nylon-tipped screw	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens"
3D lens	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, rectangular cylindrical lens
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 888
100 nm multichannel beads	Thermo	T7279, TetraSpeck microspheres
red dye	Thermo	Alexa Fluor 647
yellow-green dye	GE Healthcare	Cy3
green dye	GE Healthcare	Cy3B
blue dye	Thermo	Alexa Fluor 488