使用一个荧光显微镜进行多种成像模式

摘要

在这里, 我们提出了一个实用的指南, 建立一个综合显微镜系统, 合并传统的 epi 荧光成像, 单分子检测的超分辨率成像和多色单分子检测, 包括单分子荧光共振能量转移成像, 成一种以经济高效的方式进行设置。

摘要

荧光显微术是检测生物分子原位和实时监测其动力学和相互作用的有力工具。除了常规的免疫荧光显微镜外, 还开发了各种成像技术来实现特定的实验目标。一些广泛使用的技术包括单分子荧光共振能量转移 (smFRET), 它可以报告构象变化和分子相互作用与埃分辨率, 和单分子检测基于超分辨率 (SR) 成像, 与衍射有限显微镜相比, 它可以提高约十到多倍的空间分辨率。在这里, 我们提出了一个客户设计的集成系统, 它在一个显微镜中合并多种成像方法, 包括常规的 epi 荧光成像、基于单分子检测的 SR 成像和多色单分子检测,包括 smFRET 成像。通过切换光学元件, 可以轻松、可重复地实现不同的成像方法。这种设置很容易通过任何生物科学的研究实验室, 需要进行例行和多样化的成像实验, 以降低成本和空间相对于建立单独的显微镜为个人目的。

引言

荧光显微镜是现代生物科学研究的重要工具, 在许多生物实验室中都经常进行荧光成像。通过用荧光基团标记感兴趣的生物分子, 我们可以在显微镜下直接可视化它们, 并记录在体内或体外的定位、构象、相互作用和装配状态的时间依赖性变化。传统的荧光显微镜具有衍射有限的空间分辨率, 在横向方向上约为 200-300 nm, 在轴向^1、2中为 500-700 nm, 因此仅限于100s 的成像。纳米到微米级。为了揭示分子组装或组织中更精细的细节, 开发了各种能打破衍射极限的 SR microscopies。用于实现 SR 的策略包括非线性光学效应, 如受激发射损耗 (STED) 显微镜^3、4和结构化照明显微镜 (SIM)^{5、6、 7}、随机检测单个分子, 如随机光学重建显微术 (风暴)⁸和光活化定位显微镜 (PALM)⁹, 以及两者的组合, 如 MINFLUX¹⁰。在这些 sr microscopies 中, 基于单分子检测的 sr 显微镜可以相对容易地从单分子显微镜设置中进行修改。通过重复激活和成像光敏荧光蛋白 (FPs) 或在感兴趣的生物分子标记的光交换染料, 空间分辨率可以达到 10-20 nm¹¹。要获得实时的分子相互作用和构象动力学信息, 需要埃到纳米分辨率。smFRET^12,13是实现这一决议的一种方法。通常, 根据感兴趣的生物学问题, 需要不同空间分辨率的成像方法。

通常, 对于每种类型的成像, 都需要特定的激励和/或发射光学配置。例如, 单分子检测最常用的照明方法之一是通过全内部反射 (TIR), 在这种情况下, 需要通过棱镜或通过物镜实现特定的激励角度。对于 smFRET 检测, 供体和受体染料的排放需要在空间上分离, 并定向到电子乘法、电荷耦合器件 (EMCCD) 的不同部分, 这可以通过一组反射镜和双色光束分配器实现。放置在排放路径中。对于三维 (3-D) SR 成像, 需要在发射路径中产生散光效应的光学元件, 如圆柱透镜¹⁴。因此, 自制或商业上可用的集成显微镜通常在功能上专门用于每种类型的成像方法, 并且在相同的设置下不灵活地在不同的成像方法之间切换。在这里, 我们提出了一个经济高效的混合系统, 提供三种不同成像方法之间的可调节和重复的开关: 传统的 epi-荧光成像, 衍射有限分辨率, 单分子检测 SR。成像和多色单分子检测, 包括 smFRET 成像 (图 1A)。具体而言, 此处提供的设置包含多色激励的光纤耦合输入激光器和激励路径中的商业照明臂, 允许对激励角度进行编程控制, 以便在 epi 模式和 TIR 模式之间切换。在发射路径中, 可拆卸的自制圆柱透镜盒放置在显微镜机身内, 用于3维 SR 成像, 在 EMCCD 摄像机前放置一个商用光束分配器, 可选择性地启用检测多个发射通道同时。

研究方案

1. 显微镜设计和组装

1. 激励路径
   注: 激励路径包括激光器、差分干涉对比度 (DIC) 分量、显微镜本体及其照明臂。
   1. 准备一个隔振的光学表。例如, 结构阻尼表为 48 x 96 x 12 "为所有组件提供足够的空间。
      注: 在具有温度控制的房间内建立设置 (例如, 21.4 ±0.55 摄氏度)。温度稳定性对于保持光学对准至关重要。
   2. 安装一个显微镜机身, 配有用于光纤连接的照明臂、100X 油浸 TIRF 物镜和 DIC 组件。
   3. 放置四激光头 (647 nm, 561 nm, 488 nm, 和 405 nm, 包围在图 1B) 及其在光学表上的散热器, 并确保发射的激光光束具有相同的高度和尽可能短, 以确保良好的稳定性 (例如:, 3 ")。
      注意: 如果激光头的高度比其他激光器高, 请在其下方放置足够厚的铝板。始终确保散热器与光学工作台之间的最大接触, 以获得最佳散热 (图 1B)。激光器需要足够强大的 SR 成像。参见材料表。建议在二极管激光器前面有激光清理过滤器。
   4. 通过工作站上的外设组件互连 (PCI) 接口安装数据采集卡, 并将激光器与此卡连接。通过晶体管-晶体管逻辑 (TTL) 输出控制激光器的开/关行为, 并通过此卡的模拟输出进行功率调节 (图 1C)。安装适当的显微成像软件 (商业或自制) 来控制数据采集卡以及显微镜本体。
   5. 将镜像和分色光束分配器 (590、525和470长通滤波器) 安装到各自的底座上。为后视镜使用非常稳定的镜像支架。使用带挡圈的环形分配器, 以避免二色光束分配器的弯曲 (图 1D)。
   6. 将镜面和分色分光器放在光学表上, 以组合激光光束 (图 1B)。为了实现最稳定的对准, 使整个布置尽可能紧凑, 并使用 1 "厚度光学柱。安排激光器, 使较短的波长激光器更接近光纤耦合 (图 1B), 因为短波长的光在空气中消散得更多。
   7. 将激光光束结合成单模光纤。为此, 请通过以下步骤在笼式系统中构建光纤耦合器:
      1. 在 z 轴平移安装中安装光纤适配器板 (图 1E, 最左侧的面板)。
      2. 在笼板上安装消色差双峰透镜 (焦距 = 7.5 mm) (图 1E, 左侧的第二面板)。
      3. 将上述两部分连接到延长杆上, 形成一个保持架。将固定架安装在 1 "-厚光学柱上的安装支架上 (图 1E, 中间板)。
      4. 将 647 nm 激光器首先与单模光纤 (FC/APC 端到耦合器) 对齐。
         注: 在使用单模光纤之前, 使用多模光纤进行粗对齐可能有助于对齐过程。调整后视镜和分色光束分配器的角度 (图 1D, 按调整旋钮), 以及消色差双折射透镜与光纤适配器板之间的距离 (图 1E, 通过调整 z 轴平移安装) 以获得通过光纤实现最大激光功率输出。
      5. 一旦第一个激光的对准完成, 暂时安装一对虹膜, 并把其余的激光器一个一个一个 (图 1F)。使用功率计检查校准效率。
      6. 将一个虹膜放在适配器板的前面, 以减少激光器的反射。
         注: 强背反射可减少激光源的使用寿命。另外, 可以在每个激光头前安装一个光学隔离器, 以完全消除反射。
   8. 将光纤的另一端连接到显微镜的照明臂 (图 1H)。
   9. 通过以下步骤设计并安装 "放大透镜 (mag 透镜)":
      注: 激光器可用于样品的外延荧光成像, 但每台激光器的窄光束尺寸将样品的照明面积限制在比相应摄像机传感器实际尺寸小几倍的区域, 特别是对于较新的相机 (与传统的 11.6 mm 长度相比, 对角线长度为 18.8 mm)。因此, 扩大光束以实现样品的更大和更平坦的照明是可取的。
      1. 设计可装入照明臂的 mag 透镜 (图 1H)。
         注意: mag 透镜的设计取决于它将安装在哪里。图 1H显示了照明臂中安装的一个示例, 但在激光光束准直后, 它可以安装在任何位置 (参见讨论)。用计算机辅助设计和绘图软件设计它。
      2. 将两个消色差透镜、一个凹 (焦距 = f₁) 和一个凸 (焦距 = f₂) 放在国产的 mag 透镜支架中 (图 2A和2C), 其距离等于焦距的总和, f₁+ f₂ = (-25) + 50 = 25 mm (图 2B)。
         注意: 在选择焦距时, mag 透镜将光束扩展到 f₂/| f₁|= 2 折叠。mag 透镜提供多功能性。它可以被移除以恢复常规照明, 而无需扩展光束 (图 2D) 或插入反向以聚焦激光光束以达到更强的激发强度。

2. 排放路径

注: 发射路径由可移动的圆柱透镜、阻隔滤波器轮、发射分配器和 EMCCD 摄像机 (图 1G) 组成。为了达到单分子的最佳点传播功能 (PSF), DIC 棱镜被放离物镜。

1. 定制设计的圆柱透镜 (3 维透镜) 盒, 可放入手动 DIC 分析仪插入槽在显微镜体 (图 3C)。
   注意: 此设计不会危及 DIC 分析仪, 因为分析仪块可以插入过滤塔。
2. 将焦距为 10 m 的3维透镜放置在磁带盒中, 并将其插入发射光束路径中, 以创建提取每一个分子¹⁴的 z 坐标所需的散光效果。
   注意: (可选) 3 维镜头盒可以放置在发射路径中或外 (图 3C)。
3. 在显微镜机身内部的滤塔中安装多波段二向分色分束器。
4. 安装排放过滤器。
   注: 根据首选荧光基团选择排放过滤器。根据成像模块, 放置在不同位置的排放过滤器使用如下所述:
   1. 对于顺序多色 epi-荧光成像或 SR 成像, 使用在显微镜本体旁边连接的阻隔滤光片中的发射过滤器, 以最小化通道开关中显微镜主体的振动 (图 1G)。
   2. 对于同时多色检测 (例如smFRET 实验), 请将另一个滤波器集放在发射分配器中 (检查步骤4以了解详细信息)。
      注意: 通常, 商业发射分配器有两种可切换模式 (即"啮合" 或 "旁路" 模式)。为同时进行多色成像 ("啮合" 模式) 分离发光灯色, 使用两个分色分光器和三排放滤波器的过滤立方体 ("三重立方体"图 4C和4D)。阻隔过滤轮中的一个空槽与三重立方体结合使用。另一方面, 对于顺序多色成像, 三重立方体被一个立方体 ("旁路立方体"图 4A和4D) 所取代。
5. 将 EMCCD 相机安装为发射路径的最后一部分。利用 USB PCI 连接实现快速帧速率。
   注意: EMCCD 相机推荐用于最敏感的单分子检测, 但高级 sCMOS 相机可以作为替代方法。

3. 具有外延激励的衍射有限成像

1. 在照明臂中调整激发激光器的附带角度到 epi 模式。
2. 如果啮合, 请松开3维透镜 (图 3C, 右面板)。
3. 在发射分配器中插入旁路立方体 (图 4A和4E, 底部面板)。
4. 可选为加宽的照明区域插入 mag 透镜 (图 2D, 左面板)。
   注意: 使用 mag 透镜和100X 油浸物镜, 大约 91 x 91 µm²可以均匀照明, 无需使用白色光源和多个滤镜立方体。
5. 使用显微成像软件进行多通道和/或 Z 堆栈和/或延时图像。
   注意: 有多个程序可用于显微成像, 不仅从显微镜制造商, 也从第三方公司或开源开发人员。

4. 多通道单分子成像, 包括 smFRET

注: 移动到屏障过滤器轮中的 "空" 位置, 以便所有波长的发射都能到达发射分配器中的第二组滤波器/分色光束分配器。

1. 建立表面固定化分子的多色单分子检测¹⁵使用 TIRF 激励, 包括 smFRET 测量, 将激发激光器的偶发角调整为 TIRF 角。松开 mag 透镜和3维透镜。
2. 通过以下步骤在发射分配器 (图 1G) 中接合三通道模式:
   1. 将旁路立方体替换为 "校准立方体", 允许光线穿过所有通道 (图 4B和4E)。
   2. 在 DIC 下打开摄像机 (即阻隔滤波器轮中没有排放滤波器), 并调整发射分配器的光圈, 直到屏幕上出现三个完全分离的通道。
      注意: 在房间灯光照射下执行此步骤, 可视化所有通道。
   3. 转动发射分配器上的垂直/水平调节控制旋钮, 大致对准三通道 (图 4E和4F)。
   4. 关闭相机, 并用三重立方体替换校准立方体 (图 4C和4E)。
   5. 将 100 nm 多通道珠子的样品放置在100X 物镜的顶部, 并将焦点放在样品上。
   6. 打开相机和 488 nm 激光, 放大其中一个明亮的珠子, 并通过再次转动调整控制旋钮 (图 4E和4G) 精细对准三通道。
      注: 100 nm 多通道珠子在 488 nm 激发时发出不同波长的光, 从而实现三声道对齐。
3. 打开相机和激光, 对焦, 并找到一个良好的位置与合理的光斑密度。调整激光功率和曝光时间, 实现可接受的信噪比和光漂白电平。使用显微成像软件拍摄延时图像。

5. SR 成像

注意: 这是基于单分子检测的 SR 显微术。

1. 要设置 SR 成像, 请插入3维透镜并取下 mag 透镜。将相机的曝光时间设置在适当的激光通道中 (例如, 5-60 ms)。确定并手动设置最佳激发激光器的偶发角为 TIRF 角。
2. 将示例放置在 SR 映像缓冲区¹⁶中。在成像前允许缓冲区平衡至少10分钟。
   注意: sr 成像缓冲器在大约1小时后过期, 因此请相应地制作新的 sr 成像缓冲器。
3. 在 SR 成像之前拍摄 DIC 图像。为了找到合适的 SR 的目标高度, 优化了散光效应, 利用 DIC 成像找到了细胞的中间平面。根据单元格从 "光" 过渡到 "深色" 图像并显示为透明 (图 5A、 5B和5C) 的高度来识别基准面。一旦确定了所需的焦平面, 请参与 z 漂移校正系统 (图 1A)。
4. 进行 SR 成像。更改 405 nm 激光功率, 以保持合理的 "闪烁" 点密度。
   注意: 虽然可以手动更改 405 nm 激光, 但运行编程数据采集代码以保持 "闪烁" 点的密度更方便。下面是如何自动进行的示例。源代码可根据要求提供 (图 6)。
   1. 以0瓦/cm²紫激光功率启动成像采集。
   2. 计算某个时间段内闪烁点的数量。
   3. 调制紫激光功率, 使闪烁点的数量保持在用户定义的 "计数阈值" 在视野中。当闪烁点数降至计数阈值以下时, 增加紫色激光功率。
   4. 使用最大紫激光功率将闪烁点数降至低于计数阈值时终止采集。
      注意: 根据样品亮度, 最大可设置为不同, 但不高于130瓦特/厘米²。根据 SR 成像的实际目标, 此自动采集代码可以在任何所需的点手动终止。
5. 在开始采集后不久, 检查 PSFs 的闪烁行为和斑点。
   注意: 如果闪烁行为不理想, 请更改激发激光器的附带角度或更换成像缓冲器。预计将对 PSF 的 "垂直"、"水平" 和 "菱形" 形状进行抽样, 分别代表来自下方、上方和焦点平面内的荧光基团 (图 5D)。如果大多数斑点显示垂直或水平 PSFs, 则焦点平面从单元格的中心关闭, 因此终止实验并再次调整焦点平面。浸泡油或其他局部因素中存在气泡会影响 PSFs 的质量, 因此可能需要更换机油或更改样品的不同成像区域。
6. 对于数据分析, 使用开源 (在 NIH ImageJ 插件中) 或商业上可用的代码来检测每个成像帧中每个点的质心, 并从 x 和 y 宽度¹⁴提取每个点的 z 值。
   注: 在本报告中, 最初在基于单分子检测的 SR⁸中的一个源代码被修改为3维检测¹⁶ , 并被使用。
7. 在双色成像的情况下, 用较长的激发波长对荧光团进行图像, 其次是具有较短的激发波长。运行自动购置代码类似于步骤5.4 中所述的, 但使用不同的成像激光器。
   注意: 在不同荧光基团 (例如, 红色染料和黄绿色染料) 的图像之间应校正色差。下面是步骤。
   1. 在玻璃盖玻片上固定多个 100 nm 多通道珠子, 避免形成簇。
   2. 在不同的激励通道中拍摄它们的图像。
   3. 按软件提取其 (X、Y、Z) 坐标 (步骤 5.6)。
   4. 绘图ΔX_i = x_1i -x_2i和ΔY_i = y_1i -y_2i (我是为不同的珠子, 和1和2是不同的颜色通道) 分开, 并适合他们适当的功能。保存函数。
      注意: 在大多数情况下, 线性函数是足够的。确定这些函数后, 每次成像时不必重复此测量。
   5. 在实际的双色 SR 成像中, 对感兴趣的样本应用函数来校正 (X、Y) 色差。对于 z 方向色差, 通过获取ΔZ = z₁ -z₂获得多通道珠子或已知的参考多通道样本与感兴趣的样本一起进行。
      注: 与 (X, Y) 色差不同, z 方向色差在每个实验中都无法重现, 主要是由于通道切换时的 z 方向对焦维护不完整。因此, 建议每次进行校正。ΔZ = z₁ -z₂主要是独立于 (X, Y), 所以只有几个珠子或参考样品将是足够的每个样本区域的兴趣。在3维可视化软件中绘制构建的最终双色 SR 图像, 并手动检查ΔZ。

结果

这种显微镜允许在不同的成像方法之间进行灵活和可重复的切换。这里我们展示了每个成像模块收集的样本图像。

图 5D显示了 SR 采集过程中闪烁的分子的 PSF。数以千计的这样的图像被重建, 以生成最终的 SR 图像 (图 5E)。图 5E显示了与图 7A

讨论

这种混合显微镜系统无需购买多台显微镜。所有零件的总成本, 包括光学表、表安装人工、软件和工作站, 约为23万美元。定制加工部件, 包括 mag 透镜和3维透镜, 成本约为700美元 (成本取决于不同机构的实际费用)。用于基于单分子检测的 SR 显微显微镜的典型商业可用集成系统的成本超过30万美元 ~ 40万, 且不容易 smFRET 测量, 或在不使用白光的情况下为合理的视野提供 epi 成像。源。因此, 此处介绍的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E microscope stand	Nikon	Ti-E
Objective lens	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M	This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block	Nikon	Ti-A	This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system	Nikon	PFS	This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top	TMC	783-655-02R
Optical table bases	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink	Cobolt	11658 (HS-03)	Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink	Coherent	1193289	Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable	L-com	CC58C-6	RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter	L-com	BA1087	Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optical Filter Changer
Emission Splitter	Cairn	OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter	Chroma	ET700/75M	Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET595/50M	Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET525/50M	Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set	Chroma	49000	installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 long pass filter	Chroma	T590LPXR-UF1	for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter	Chroma	T525LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter	Chroma	T470LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647)	Chroma	zet640/20x	for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488)	Semrock	LL01-488-25	for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source	Excelitas	X-Cite120LED	used only for DAPI imaging
Mirror mount	Newport	SU100-F3K
Optical posts	Newport	PS-2
Clamping fork	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring	Thorlabs	CMRR	used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount	Thorlabs	SM1Z	Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible
Achromatic Doublet lens	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm
Cage Plate	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap
Cage Assembly Rod	Thorlabs	ER4	Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm
Cage Mounting Bracket	Thorlabs	CP02B	30 mm Cage Mounting Bracket
Single mode optical fiber	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multi mode optical fiber	Thorlabs	M42L01	Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens"
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens"
Retaining ring	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens"
Nylon-tipped screw	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens"
3D lens	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, rectangular cylindrical lens
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 888
100 nm multichannel beads	Thermo	T7279, TetraSpeck microspheres
red dye	Thermo	Alexa Fluor 647
yellow-green dye	GE Healthcare	Cy3
green dye	GE Healthcare	Cy3B
blue dye	Thermo	Alexa Fluor 488