Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Resumen

Aquí presentamos una guía práctica de la construcción de un sistema de microscopía integrado, que combina la proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, proyección de imagen de una sola molécula basada en la detección de súper resolución y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de una sola molécula la proyección de imagen, en una puesta en marcha de una manera costo-eficiente.

Resumen

Microscopía de fluorescencia es una potente herramienta para detectar moléculas biológicas en situ y monitorear su dinámica y las interacciones en tiempo real. Además de microscopía de epifluorescencia convencional, han desarrollado varias técnicas de imagen para lograr objetivos experimentales específicos. Algunas de las técnicas ampliamente utilizadas incluyen la fluorescencia de una sola molécula resonancia transferencia de energía (smFRET), que puede reportar cambios conformacionales y las interacciones moleculares con la resolución del angstrom y basado en la detección de una sola molécula súper resolución (SR) la proyección de imagen, que puede mejorar la resolución espacial de aproximadamente diez a twentyfold comparado con microscopia de difracción limitada. Aquí presentamos un sistema integrado cliente-diseñado, que combina varios métodos de proyección de imagen en un microscopio, incluyendo proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, una sola molécula basada en detección SR la proyección de imagen y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo la proyección de imagen smFRET. Diferentes métodos de proyección de imagen pueden conseguirse fácilmente y reproducible elementos ópticos. Este montaje es fácil de adoptar por cualquier laboratorio de investigación en ciencias biológicas con la necesidad de rutina y diversos experimentos de imagen a un coste reducido y el espacio en relación con la construcción de microscopios distintos fines individuales.

Introducción

Microscopios de fluorescencia son herramientas importantes para la investigación de la ciencia biológica moderna y la proyección de imagen fluorescente se realiza de manera rutinaria en muchos laboratorios de biología. Por etiquetado de biomoléculas de interés con fluoróforos, directamente podemos visualizar al microscopio y registrar los cambios dependientes del tiempo en la localización, conformación, interacción y Asamblea estado in vivo o in vitro. Microscopios de fluorescencia convencionales tienen una resolución espacial limitada de la difracción, que es ~ 200-300 nm en la dirección lateral y ~ 500-700 nm en la dirección axial^1,2y, por tanto, se limita a la proyección de imagen en el 100s de escala de nanómetros a micras. Para revelar los detalles más finos en el conjunto molecular o la organización, se han desarrollado diferentes Microscopias de SR que pueden romper el límite de difracción. Estrategias utilizadas para lograr SR incluyen efectos ópticos no lineales, como estimulante de la emisión (STED) el agotamiento microscopía^3,4 e iluminación estructurada microscopia (SIM)^{5,6, 7}, estocástico detección de moléculas individuales, como estocásticos reconstrucción óptica microscopia (tormenta)⁸ y fotoactivado localización microscopia (PALM)⁹y una combinación de ambos, como el MINFLUX¹⁰. Entre estas microscopías SR, microscopios de SR basados en la detección de una sola molécula relativamente fácilmente modificable de un montaje de microscopio de la solo-molécula. Con activación repetitiva y la proyección de imagen de photoactivatable de proteínas fluorescentes (FPs) o colorantes foto conmutable con la etiqueta de biomoléculas de interés, la resolución espacial puede llegar a 10-20 nm¹¹. Para obtener información sobre las interacciones moleculares y conformacional dinámica en la resolución del angstrom a nanómetro, en tiempo real se requiere. smFRET^12,13 es un método para lograr esta solución. En general, según las preguntas biológicas de interés, se necesitan métodos por imágenes con resoluciones espaciales diferentes.

Por lo general, para cada tipo de proyección de imagen, configuración óptica excitación o emisión específica es necesaria. Por ejemplo, uno de los métodos de iluminación más utilizadas para la detección de una sola molécula es a través de la reflexión interna total (TIR), en el que un ángulo de excitación específico debe conseguirse a través de un prisma o a través de la lente del objetivo. Para la detección de smFRET, emisiones de donador y aceptor tintes necesitan espacialmente separados y dirigidos a diferentes partes de la electrónica-multiplicar, dispositivo de carga acoplada (EMCCD), que se logra con un conjunto de espejos y divisores de haz dicroicos colocado en la trayectoria de la emisión. Para tridimensional (3D) SR la proyección de imagen, un componente óptico, como una lente cilíndrica¹⁴, es necesaria para causar un efecto de astigmatismo en la trayectoria de la emisión. Por lo tanto, construcción propia o microscopios integrados comercialmente disponibles, generalmente, funcionalmente especializados para cada tipo de método de la proyección de imagen y no son flexibles para cambiar entre diferentes métodos de proyección de imagen en la misma instalación. Aquí presentamos un sistema híbrido rentable, que ofrece interruptores ajustables y reproducibles entre tres métodos de proyección de imagen: proyección de imagen de epi-fluorescente convencional con resolución de difracción limitada, una sola molécula basada en la detección de SR proyección de imagen y detección de una sola molécula varios color, incluyendo smFRET proyección de imagen (figura 1A). En concreto, el montaje que presentamos contiene fibra-juntado entrados láseres para la excitación de varios color y un brazo de iluminación comercial en la ruta de la excitación, que permite programa el control del ángulo de excitación, para cambiar entre modo de epi y TIR. En la trayectoria de la emisión, un cassette de lente cilíndrica de homebuilt desmontable se coloca dentro del cuerpo del microscopio para obtener imágenes de SR 3D, y un divisor de viga comercial se coloca antes de una cámara EMCCD que puede activarse selectivamente detectar múltiples canales de emisión al mismo tiempo.

Protocolo

1. montaje y diseño del microscopio

1. Camino de la excitación
   Nota: La ruta de excitación incluye láseres, componentes de interferencia diferencial (DIC) de contraste, el cuerpo del microscopio y el brazo de iluminación.
   1. Preparar una tabla óptica aislado de vibraciones. Por ejemplo, una tabla de amortiguación estructural de 48 x 96 x 12'' da suficiente espacio para todos los componentes.
      Nota: Construir la instalación en una sala con control de temperatura (por ejemplo, 21,4 ± 0,55 ° C). Estabilidad de la temperatura es fundamental para mantener la alineación óptica.
   2. Instalar un cuerpo de microscopio que está equipado con un brazo de iluminación para la conexión de fibra óptica a 100 X inmersión en aceite TIRF objetivo y componentes DIC.
   3. Coloque cuatro cabezas del laser (647 nm, 561 nanómetro, 488 nanómetro y 405 nm, rodeado en la figura 1B) y su calor se hunde en la tabla óptica, y asegúrese de que los rayos láser emitidos tienen la misma altura y son tan corto como sea posible para asegurar la buena estabilidad (p. ej. 3'').
      Nota: Si una cabeza del laser se encuentra a una altura más corta que otros láseres, poner una placa de aluminio con espesor adecuado por debajo de ella. Siempre asegurar el máximo contacto entre los disipadores de calor y la tabla óptica para la mejor disipación de calor (figura 1B). Los láseres deben ser lo suficientemente potentes para la proyección de imagen SR. Ver la tabla de materiales. Se recomienda tener filtros de limpieza láser delante de láseres de diodo.
   4. Instalar una tarjeta de adquisición de datos a través de una interfaz de interconexión (PCI) de componentes periféricos en una estación de trabajo y conectar los lasers con esta tarjeta. Control de comportamientos de ON/OFF de los láseres por lógica del transistor-transistor (TTL) de salida y su regulación de la potencia de la salida analógica de la tarjeta (figura 1). Instalar un microscopio adecuado imaging software (comercial o construcción propia) para controlar la tarjeta de adquisición de datos, así como el cuerpo del microscopio.
   5. Montaje de los espejos y divisores de haz dicroicos (590 525 y 470 largo pasar filtros) a sus respectivas monturas. Utilice soportes de espejo muy estable para los espejos. Use divisores circulares con anillos de retención para evitar cualquier deformación de los divisores de haz dicroicos (figura 1).
   6. Coloque los espejos y divisores de haz dicroicos sobre la mesa óptica para combinar los rayos láser (figura 1B). Para lograr la alineación más estable, hacer el arreglo entero tan compacta como sea posible y utilizar mensajes ópticos de 1'' de espesor. Colocar el láser para que los láseres de longitud de onda más cortos están más cercanos del acoplamiento de la fibra óptica (figura 1B) desde onda corta luces más disipan en el aire.
   7. Combina rayos láser en una fibra óptica de modo único. Para ello, construir un acoplador de la fibra en un sistema de jaula a través de los siguientes pasos:
      1. Monte una placa de adaptador de fibra en un monte de traducción del eje z (Figura 1E, panel de la izquierda).
      2. Monte un objetivo doblete acromático (longitud focal = 7,5 mm) en una placa de jaula (Figura 1E, segundo panel de la izquierda).
      3. Conecte las dos partes sobre barras de la extensión para formar una jaula. Monte la jaula sobre la mesa óptica con soportes en los postes de 1'' de espesor ópticos (Figura 1E, panel central).
      4. Alinear el láser 647 primero con una solo modo de fibra óptica (final FC/APC el acoplador).
         Nota: Una alineación aproximada usando una fibra óptica antes de usar fibra óptica monomodo puede ayudar en el proceso de alineación. Ajustar los ángulos de los espejos y divisores de haz dicroicos (figura 1, de perillas de ajuste), así como la distancia entre la lente del doblete acromático y la placa de adaptador de fibra (Figura 1E, ajustando el eje z traducción de montaje) para obtener potencia máxima del láser a través de la fibra.
      5. Una vez que se realiza la alineación del laser de primera, temporalmente instale a un par de lirios y alinear el resto de los lasers uno por uno (Figura 1F). Comprobar la eficacia de la alineación con un medidor de potencia.
      6. Deje un diafragma en la parte frontal la placa adaptadora para reducir los reflejos de los rayos láser.
         Nota: Fuerte atrás reflexiones pueden reducir la vida útil de fuentes láser. Opcionalmente, se puede instalar un aislador óptico frente a cada cabeza del laser para eliminar por completo los reflejos.
   8. Conecte el otro extremo de la fibra óptica en el brazo de iluminación del microscopio (figura 1 H).
   9. Diseño e instalación de la "lente de aumento (lente de mag)" a través de los siguientes pasos:
      Nota: El láser se puede utilizar para la proyección de imagen de epi-fluorescencia de la muestra, pero el tamaño de haz estrecho de cada láser limita el área iluminada de la muestra a un área varias veces más pequeño que el tamaño real del correspondiente sensor de la cámara, especialmente para los más nuevos cámaras (con 18,8 mm de longitud diagonal respecto a la longitud de 11,6 mm convencional). Por lo tanto, es deseable ampliar la viga para lograr una iluminación más grande y más plana de la muestra.
      1. Diseño de la lente del mag, que cabe en el brazo de iluminación (figura 1 H).
         Nota: El diseño de la lente mag depende donde se instalará. Figura 1 H muestra un ejemplo de la instalación en el brazo de iluminación, pero puede ser instalado en cualquier punto después de los rayos láser colimado (ver discusión). Diseño con un software de redacción y diseño asistido por ordenador.
      2. Colocar dos lentes acromáticas, uno cóncavo (longitud focal = f₁) y uno convexo (longitud focal = f₂) en el soporte del lente mag caseros (figura 2A y 2C), con la distancia igual a la suma de sus distancias focales, f₁ + f₂ = (-25) + 50 = 25 mm (figura 2B).
         Nota: Con esta opción de distancias focales, la lente mag expande la viga f₂/ | f₁| = 2 dobleces. El objetivo de mag proporciona versatilidad. Puede ser quitado para reanudar la iluminación regular sin ampliar las vigas (Figura 2D) o insertado en la dirección contraria para enfocar el rayo láser para lograr una intensidad más fuerte de excitación.

2. trayectoria de emisión

Nota: La ruta de la emisión se compone de una lente cilíndrica removible, una rueda de filtros de barrera, un separador de emisión y una cámara EMCCD (figura 1). Para lograr el mejor punto de extensión (PSF) la función de moléculas individuales, el prisma DIC se pone los lentes del objetivo.

1. Particulares el cassette de la lente cilíndrica (lentes 3D), que puede caber en el analizador manual de DIC Inserte la ranura en el cuerpo del microscopio (figura 3).
   Nota: Este diseño no compromete el analizador DIC ya que un bloque del analizador puede ser insertado en la torrecilla del filtro.
2. Coloque la lente 3D de 10 m de longitud focal en el cartucho y colóquelo en la trayectoria del haz de emisión para crear el efecto de astigmatismo es necesario para la extracción de la coordenada z de cada molécula individual¹⁴.
   Nota: Opcionalmente, el cassette de lentes 3-d puede colocarse dentro o fuera de la ruta de emisión (figura 3).
3. Instalar un divisor de haz dicroicos de varias bandas en la torrecilla del filtro dentro del cuerpo del microscopio.
4. Instalar filtros de emisión.
   Nota: Los filtros de emisión son elegidos dependiendo de los fluoróforos preferido. Dependiendo del imagen módulo, se utilizan filtros de emisión colocados en diferentes lugares como se describe a continuación:
   1. Para SR imágenes o imágenes multicolor secuencial epi-fluorescencia, usar filtros de emisión en la rueda de filtros de barrera conectada junto al cuerpo del microscopio para reducir al mínimo la vibración en el cuerpo del microscopio durante el conmutador de canal (figura 1).
   2. Para la detección simultánea de múltiples color (p. ej., smFRET experimentos), colocar otro filtro en un separador de emisión (cheque paso 4 para más detalles).
      Nota: Generalmente, un divisor de emisión comercial tiene dos modos conmutables (es decir, "comprometidos" o modos de "bypass"). Para separar luces de emisión cromáticamente para simultánea multicolor la proyección de imagen (modo "a"), se utiliza un cubo de filtro con dos divisores de viga dicroico y tres filtros de emisión ("triple cubo," figura 4 y 4 D). Una ranura vacía en la rueda de filtros de barrera se utiliza en combinación con el cubo triple. Por otro lado, imagen secuencial de varios colores, el cubo triple se sustituye por un cubo que tiene un espejo interior ("by-pass cubo," Figura 4A y 4D).
5. Instale la cámara EMCCD como la última parte de la trayectoria de la emisión. Utilizar la conexión USB-PCI para lograr una velocidad rápida.
   Nota: Se recomienda una cámara EMCCD para la detección más sensible de una sola molécula, sino una cámara sCMOS avanzado puede ser una alternativa.

3. proyección de imagen con Epi-excitación de difracción limitada

1. Ajuste ángulo incidental de los láseres de excitación al modo de epi en el brazo de iluminación.
2. Desenganchar la lente 3D si (figura 3, panel derecho).
3. Inserte el cubo de bypass en el separador de emisión (Figura 4A y 4E, panel inferior).
4. (Opcional) Inserte el lente mag para un área ampliada de la iluminación (Figura 2D, panel de la izquierda).
   Nota: Con el uso de una lente de mag y 100 X objetivo de inmersión en aceite, de 91 x 91 μm² pueden iluminar uniformemente, eliminando la necesidad de utilizar una fuente de luz blanca y varios cubos de filtro.
5. Usar un microscopio software multicanal, de tomar de imágenes Z-stack o imágenes de lapso de tiempo.
   Nota: Hay varios programas disponibles para la proyección de imagen de la microscopia, no sólo de los fabricantes del microscopio, sino también de terceras empresas o desarrolladores de código abierto.

4. la proyección de imagen de una sola molécula multicanal incluyendo smFRET

Nota: Mover a una posición "vacía" en la rueda de filtros de barrera, para que todos la emisión con cualquier longitud de onda puede alcanzar a la segunda serie de filtros/dicroicos divisores de viga en el separador de la emisión.

1. Para configurar varios colores una sola molécula detección de moléculas de superficie inmovilizado¹⁵ utilizando excitación TIRF, incluyendo medición de smFRET, ajuste el ángulo incidental de los láseres de excitación al ángulo TIRF. Desenganchar la lente mag y la lente 3D.
2. Participar del modo de tres canales en el partidor de emisión (figura 1) a través de los siguientes pasos:
   1. Vuelva a colocar el cubo de derivación con un cubo de"calibración" que permite que la luz ir por todos los canales (Figura 4B y 4E).
   2. Encender la cámara en DIC (es decir, no hay filtro de emisión en la rueda de filtros de barrera) y ajuste la abertura del separador de emisión hasta tres canales completamente separados aparecen en la pantalla.
      Nota: Realizar este paso con la luz de la habitación encendida, para visualizar todos los canales.
   3. Gire las perillas de control de ajuste vertical/horizontal en el separador de emisión y áspero alinear los tres canales (figura 4E y 4F).
   4. Apague la cámara y vuelva a colocar el cubo de la calibración con un cubo triple (figura 4 y 4E).
   5. Colocar una muestra con los granos multicanales 100 nm sobre el 100 X objetivo y enfoque en la muestra.
   6. Encienda la cámara y el láser de 488 nm, acercarse a uno de los granos brillantes y finalmente alinear los tres canales girando el control perillas de ajuste otra vez (figura 4E y 4 G).
      Nota: cuentas multicanales 100 nm emiten diferentes longitudes de onda de la luz por excitación de 488 nm, lo que permite la alineación de tres canales.
3. Encienda la cámara y láser, enfoque y encontrar una buena posición con una densidad de punto razonable. Ajustar el tiempo de exposición y potencia de láser para lograr niveles aceptables de signal-to-noise y photobleaching. Utilice el software de imágenes de la microscopia para tomar imágenes de lapso de tiempo.

5. SR la proyección de imagen

Nota: Esto es microscopia basada en detección de SR de una sola molécula.

1. Para configurar imágenes de SR, inserte la lente 3D y retirar la lente mag. Establecer el tiempo de exposición de la cámara en los canales de láser apropiada (e.g., 5-60 ms). Determinar y ajustar manualmente el ángulo incidental de los láseres de excitación óptima para ser el ángulo de la TIRF.
2. Colocar la muestra en SR de búfer¹⁶. Permitir que el tampón se equilibren para por lo menos 10 minutos antes de la proyección de imagen.
   Nota: Búfer imágenes SR expira después de aproximadamente 1 h, así que SR nuevo búfer de imagen en consecuencia.
3. Tomar una imagen DIC antes de la proyección de imagen SR. Para encontrar la altura adecuada del objetivo para el SR, que optimiza el efecto del astigmatismo, uso DIC imágenes para encontrar el plano medio de las células. Identificar el plano por la altura a la que las células de transición de la "luz" a las imágenes de "dark" y parecen ser transparentes (figura 5A, 5By 5C). Una vez que se determina el plano focal deseado, comprometer el sistema de corrección de deriva de z (figura 1A).
4. Imágenes de SR de conducta. Cambiar la potencia del láser de 405 nm para mantener una densidad razonable de 'parpadeando en' puntos.
   Nota: Aunque es posible cambiar manualmente el láser de 405 nm, es más conveniente ejecutar un código de adquisición de datos programados para mantener la densidad de "parpadea en" puntos. Aquí es un ejemplo de cómo se lleva a cabo automáticamente. El código fuente está disponible bajo petición (figura 6).
   1. Comenzar la adquisición de imágenes con 0 energía de láser violeta W/cm² .
   2. Contar el número de parpadear en puntos en un período determinado.
   3. Modulación de la potencia del láser violeta para que la cantidad de parpadeo en puntos se mantiene por encima un definido por el usuario"cuenta" en el campo de visión. Aumentar la potencia del laser de la violeta cuando el número de puntos parpadeando en cae por debajo del umbral de la cuenta.
   4. Terminar la adquisición cuando el número de puntos parpadeando en cae por debajo del umbral cuenta con la potencia máxima de láser violeta.
      Nota: El máximo puede ser ajustado diferentemente dependiendo de la luminosidad de la muestra, pero no más de 130 W/cm². Dependiendo de la meta real de la proyección de imagen del SR, este código de adquisición automática puede ser terminado manualmente en cualquier punto deseado.
5. Compruebe el comportamiento intermitente y las PSFs de los lugares poco después de partir de la adquisición.
   Nota: Si el comportamiento intermitente no es ideal, cambiar ángulo incidental de los láseres de excitación o cambie el búfer de imagen. Esperar que una muestra de "vertical", "horizontal" y "diamante" formas de PSF, que representa fluoróforos desde abajo, arriba y en el plano focal, respectivamente (figura 5). Si manchas la mayoría muestran PSFs verticales u horizontales, luego el plano focal está apagado desde el centro de las células, por lo tanto terminar el experimento y ajustar otra vez el plano focal. Presencia de burbujas de aire en el aceite de inmersión o de otros factores puede afectar la calidad de las PSFs, así que puede ser necesario cambiar el aceite o cambiar a un área diferente de la imagen de la muestra.
6. Para el análisis de datos, utilizar open source (en plugins ImageJ NIH) o códigos disponibles comercialmente para detectar centroides de cada punto en cada cuadro de imagen y extraer valores de z de cada punto de x y y anchos¹⁴.
   Nota: En este informe, un código fuente desarrollado originalmente en uno de los primeros sola molécula basada en detección SR⁸ fue modificado para la detección de 3D¹⁶ y fue utilizado.
7. En el caso de la proyección de imagen de dos colores, imagen el fluoróforo con el más longitud de onda de excitación, seguido con la más corta longitud de onda de excitación. Ejecute el código de adquisición automatizada de manera similar a la descrita en el paso 5.4, pero con un láser de diferentes.
   Nota: se debe corregir la aberración cromática entre las imágenes con diferentes fluoróforos (p. ej., colorante rojo y colorante amarillo-verde). Aquí están los pasos.
   1. Inmovilizar múltiples granos multicanales 100 nm en el cubreobjetos de vidrio, evitando la formación de clusters.
   2. Tomar imágenes de ellos en canales de excitación diferentes.
   3. Extracto de sus (X, Y, Z) coordenadas por software (paso 5.6).
   4. Parcela ΔX = X_1i - X_2i y ΔY_i = Y_1i - Y_2i (es para diferentes granos, y 1 y 2 son los canales de color diferente) por separado y que encajen con las funciones apropiadas. Guardar las funciones.
      Nota: Las funciones lineales son suficientes en la mayoría de los casos. Una vez determinadas estas funciones, esta medida no debe repetirse cada vez que de proyección de imagen.
   5. En la actual dos colores SR proyección de imagen de una muestra de interés, se aplican las funciones aberración cromática correcta (X, Y). Aberración cromática de z-direccional, la conducta obteniendo ΔZ = Z₁ - Z₂ para granos multicanales o referencia conocida multicanal muestras sembradas junto con la muestra de interés.
      Nota: a diferencia de (X, Y) aberración cromática, aberración cromática de z-direccional no es bien reproducibles en cada experimento, principalmente debido a un mantenimiento incompleto foco de direccional de z al cambiar de canal. Por lo tanto, se recomienda llevar a cabo la corrección cada vez. ΔZ = Z₁ - Z₂ es independiente de (X, Y), tan sólo unos pocos granos o muestras de referencia sería suficientes por cada uno área de la muestra de interés. Parcela construida final dos colores SR imágenes en un software de visualización 3D y comprobar manualmente ΔZ.

Resultados

Este microscopio permite flexible y reproducible de la conmutación entre diferentes métodos de proyección de imagen. A continuación os mostramos imágenes de la muestra con cada módulo de proyección de imagen.

Figura 5 muestra la PSF de la molécula de parpadear en durante la adquisición del SR. Miles de tales imágenes se reconstruyen para generar la imagen final de SR (...

Discusión

Este sistema de microscopio híbrido elimina la necesidad de comprar varios microscopios. El costo total para todas las partes, incluyendo la tabla óptica, mano de obra de instalación tabla, software y estación de trabajo, es aproximadamente $230.000. Piezas mecanizadas de costumbre, incluyendo la lente de mag y lentes 3-d, cuestan alrededor de $700 (el costo depende de las cargas reales en diversos institutos). Típicos disponibles en el mercado sistemas integran para microscopia de SR basados en la detección de una...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E microscope stand	Nikon	Ti-E
Objective lens	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M	This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block	Nikon	Ti-A	This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system	Nikon	PFS	This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top	TMC	783-655-02R
Optical table bases	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink	Cobolt	11658 (HS-03)	Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink	Coherent	1193289	Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable	L-com	CC58C-6	RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter	L-com	BA1087	Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optical Filter Changer
Emission Splitter	Cairn	OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter	Chroma	ET700/75M	Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET595/50M	Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET525/50M	Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set	Chroma	49000	installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 long pass filter	Chroma	T590LPXR-UF1	for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter	Chroma	T525LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter	Chroma	T470LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647)	Chroma	zet640/20x	for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488)	Semrock	LL01-488-25	for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source	Excelitas	X-Cite120LED	used only for DAPI imaging
Mirror mount	Newport	SU100-F3K
Optical posts	Newport	PS-2
Clamping fork	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring	Thorlabs	CMRR	used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount	Thorlabs	SM1Z	Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible
Achromatic Doublet lens	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm
Cage Plate	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap
Cage Assembly Rod	Thorlabs	ER4	Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm
Cage Mounting Bracket	Thorlabs	CP02B	30 mm Cage Mounting Bracket
Single mode optical fiber	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multi mode optical fiber	Thorlabs	M42L01	Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens"
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens"
Retaining ring	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens"
Nylon-tipped screw	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens"
3D lens	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, rectangular cylindrical lens
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 888
100 nm multichannel beads	Thermo	T7279, TetraSpeck microspheres
red dye	Thermo	Alexa Fluor 647
yellow-green dye	GE Healthcare	Cy3
green dye	GE Healthcare	Cy3B
blue dye	Thermo	Alexa Fluor 488