ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Summary

כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.

Abstract

קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות מולקולות ביולוגיות בחיי עיר ולנטר את הדינמיקה ואת אינטראקציות בזמן אמת. בנוסף מיקרוסקופ אפינפרין קונבנציונלי-זריחה, פותחו טכניקות הדמיה שונות כדי להשיג את מטרותיה ניסיוני. כמה הטכניקות בשימוש נרחב כוללים קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת תהודה העברת אנרגיה (smFRET), אשר יכול לדווח על שינויים הסתגלותי ואינטראקציות מולקולרית עם רזולוציה אנגסטרום, המבוססת על זיהוי מולקולה בודדת סופר רזולוציה (SR) הדמיה, אשר יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית כ עשר כדי twentyfold בהשוואה מיקרוסקופ עקיפה-מוגבלת. כאן אנו מציגים מעוצבת ללקוח משולב מערכת, אשר ממזג שיטות הדמיה מרובות במיקרוסקופ אחד, כולל הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה של צבע רב גילוי מולקולה בודדת, כולל הדמיה smFRET. שיטות הדמיה שונות ניתן להשיג בקלות, reproducibly על ידי החלפת רכיבים אופטיים. זה קל לאמץ על ידי כל מעבדה למחקר במדעי הביולוגיה עם צורך השגרה וניסויים הדמיה מגוונות עלות מופחתת וחלל ביחס בניין נפרד מיקרוסקופים לצורכי הפרט.

Introduction

קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופים כלים חשובים למחקר במדעי הביולוגיה המודרנית, הדמיה פלורסנט מתבצע באופן שגרתי על מעבדות ביולוגיה רבות. על-ידי תיוג מולקולות של עניין עם fluorophores, אנו יכולים ישירות לדמיין אותם תחת המיקרוסקופ, לתעד את השינויים תלויי-זמן לוקליזציה, קונפורמציה, אינטראקציה, ואת מכלול המדינה vivo בתוך או במבחנה. קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופים יש רזולוציה מרחבית עקיפה-מוגבלת, אשר ~ 200-300 ננומטר בכיוון לרוחב ו ~ 500-700 nm, הכיוון צירית^1,2, והם, לכן, מוגבל לדימות-שים את הכסף בתיק של סולם ננומטר-כדי-מיקרו. על מנת לחשוף פרטים עדינה הרכבה מולקולרי או הארגון, פותחו microscopies SR שונים שיכולים לשבור את מגבלת עקיפה. אסטרטגיות כדי להשיג SR כוללים אפקטים אופטיים ליניארי, כגון פליטה מאולצת דלדול (STED) מיקרוסקופיה^3,4 , תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM)^{5,6, 7}, זיהוי סטוכסטי של מולקולות יחיד, כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)⁸ ו photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל)⁹, שילוב של שניהם, כגון MINFLUX¹⁰. בין אלה microscopies SR, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופים ניתן לשנות בקלות יחסית של מלכודת מיקרוסקופ מולקולה בודדת. עם הפעלת החוזרות על עצמן, הדמיה של חלבונים פלורסנט photoactivatable (FPs) או צבעי תמונה-להחלפה מתויגים על מולקולות של עניין, רזולוציה מרחבית יכולים להגיע nm 10-20¹¹. כדי לקבל מידע על אינטראקציות מולקולרית הסתגלותי נדרש דינאמיקה של רזולוציה בזמן אמת, אנגסטרום-כדי-ננומטר. ^12,smFRET¹³ היא גישה אחת כדי להשיג החלטה זו. באופן כללי, בהתאם השאלות הביולוגי של עניין, נדרשים בשיטות הדמיה עם רזולוציות שונות מרחבית.

בדרך כלל, עבור כל סוג של הדמיה, נדרשת תצורה אופטי מסוים עירור ו/או פליטה. למשל, באחת השיטות הנפוצות ביותר תאורה לגילוי מולקולה בודדת היא באמצעות החזרה גמורה (טיר), שבו זווית עירור ספציפי צריך להיות מושגת דרך פריזמה או דרך העדשה אובייקטיבי. עבור זיהוי smFRET, פליטת התורם והן מקבל צבע צריך להיות מופרדים במרחב ו בוים על חלקים שונים האלקטרון-הכפלת, תשלום מצמידים מכשיר (EMCCD), אשר יכולה להיות מושגת עם סדרה של מראות, מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר ממוקם בנתיב פליטה. עבור תלת-ממדיים (3-D) SR הדמיה, רכיב אופטי, כגון עדשה גלילית¹⁴, יש צורך לגרום אפקט אסטיגמציה בנתיב פליטה. לכן, homebuilt או זמינים מסחרית מיקרוסקופים משולב, בדרך כלל, באופן פונקציונלי התמחה עבור כל סוג של הדמיה שיטה, אינם גמישים כדי לעבור בין שיטות הדמיה שונות על הסידור זהה. כאן אנו מציגים מערכת היברידית חסכונית, המספקת מתגים מתכווננת, לשחזור בין שלוש שיטות הדמיה שונות: הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי עם רזולוציה מוגבלת עקיפה, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה, זיהוי חד-מולקולה צבע רב, כולל smFRET הדמיה (איור 1 א'). באופן ספציפי, הסידור המובאת כאן מכיל סיבים מצמידים לייזרים קלט של צבע רב עירור, זרוע תאורה מסחרי בנתיב עירור, אשר מאפשר מתוכנת השליטה הזווית עירור, כדי לעבור בין epi-מצב ומצב טיר. בנתיב פליטה, קלטת עדשה גלילית homebuilt נשלף ממוקם בתוך הגוף מיקרוסקופ לדימות SR תלת-ממדי ולאחר במפצל קרן מסחרי ממוקמת לפני מצלמה EMCCD שיכול להפוך לזמין באופן סלקטיבי כדי לזהות ערוצים מרובים פליטה בעת ובעונה אחת.

Protocol

1. מיקרוסקופ ועיצוב ההרכבה

1. עירור נתיב
   הערה: הנתיב עירור כולל לייזרים התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), הגוף מיקרוסקופ, ורכיבים זרוע תאורה שלה.
   1. הכן טבלה בודדים רטט אופטי. לדוגמה, טבלה השיכוך מבנית של 48 x 96 x 12'' נותן די שטח פנוי עבור כל הרכיבים.
      הערה: לבנות את הסידור בחדר עם בקרת טמפרטורה (למשל, נמצא 21.4 ± 0.55 ° C). יציבות טמפרטורה חיוני לשמירה על היישור אופטי.
   2. התקן גוף מיקרוסקופ הינו מצויד עם זרוע תאורה עבור חיבור סיב אופטי, של 100 X שמן-טבילה TIRF המטרה עדשות ורכיבים DIC.
   3. מקום 4 ראשים לייזר (647 nm, 561 nm, 488 ננומטר, 405 ננומטר, כיתרו ב איור 1B) שלהם חום כיורים על השולחן האופטי, ודא קרני לייזר הנפלט שיש באותו גובה ובאותו הם קצר ככל האפשר להבטיח יציבות טובה (למשל 3'').
      הערה: אם ראש לייזר יושב בגובה קצר יותר מאשר אחרים לייזרים, לשים צלחת אלומיניום בעובי נאותה מתחתיו. תמיד להבטיח מקסימום קשר בין מפזרי חום את טבלת אופטי עבור פליטת חום הטוב ביותר (איור 1B). הלייזרים צריך להיות חזק מספיק עבור SR הדמיה. עיין בטבלה של חומרים. מומלץ לעשות לייזר מסננים לנקות לפני דיודות לייזר.
   4. להתקין כרטיס רכישה נתונים דרך ממשק רכיבים היקפיים (PCI) interconnect תחנת עבודה וחבר לייזרים עם הכרטיס הזה. שליטה ON/OFF התנהגויות של הלייזרים לפי ההיגיון טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) פלט, והתאמה שלהם כוח, פלט אנלוגי של הקלף (איור 1C). התקן של מיקרוסקופיית נאות imaging התוכנה (מסחרי או homebuilt) כדי לשלוט כרטיס רכישה הנתונים, כמו גם הגוף מיקרוסקופ.
   5. לטעון את המראות ואת מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (590, 525 ו- 470 זמן לעבור מסננים) על סוסיהם בהתאמה. השתמש בטעינות יציב מאוד מראה על המראות. השתמש מפצלי מעגלית עם שמירה על טבעות כדי להימנע כל כיפוף מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (איור 1D).
   6. מקם את המראות ואת מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר על השולחן האופטי כדי לשלב את קרני לייזר (איור 1B). כדי להשיג את היישור היציב ביותר, להפוך את כל הסידור כמה קומפקטי ככל האפשר, השתמש בעמודי אופטי 1''-עובי. לסדר את הלייזרים כך לייזרים אורך גל קצר יותר קרובים יותר צימוד סיבים אופטיים (איור 1B) מאז קצר באורך הגל אורות להתפזר יותר באוויר.
   7. לשלב קרני לייזר סיב אופטי במצב יחיד. לשם כך, לבנות מצמד סיבים בתוך מערכת כלוב באמצעות השלבים הבאים:
      1. הר צלחת מתאם סיבים ב הר תרגום ציר z (איור 1E, החלונית הימנית).
      2. הר של עדשה כפיל אכרומטי (אורך מוקד = 7.5 מ מ) לתוך צלחת הכלוב (איור 1E, הפאנל השני מצד השמאל).
      3. לחבר את שני החלקים מעל באמצעות מוטות הארכה כדי ליצור כלוב. לטעון את הכלוב על השולחן אופטי עם הרכבה מרובעים על 1''-עבה ההצבות אופטי (איור 1E, בחלונית האמצעית).
      4. יישר את הלייזר 647-nm קודם עם סיב אופטי במצב יחיד (FC/APC סוף מחבר).
         הערה: יישור קשה באמצעות סיבים אופטיים רב במצב לפני באמצעות סיבים אופטיים במצב יחיד עשוי לסייע בתהליך יישור. להתאים את הזוויות של מראות, מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (איור 1D, על ידי התאמת ידיות), כמו גם המרחק בין העדשה כפיל אכרומטי לצלחת מתאם סיבים (איור 1E, על-ידי התאמת הר תרגום ציר z) כדי לזכות לייזר המרבי פלט חשמל באמצעות הסיבים.
      5. ברגע היישור של הלייזר הראשון נעשה, באופן זמני להתקין זוג קשתיות העין, ליישר את שאר לייזרים אחד (איור 1F). בדקו את יעילות יישור עם מד הכוח.
      6. השאר איריס אחד בחזית הלוח מתאם לצמצם ההשתקפויות של הלייזרים.
         הערה: חזק בחזרה השתקפויות. המצמצמים את אורך החיים של מקורות לייזר. לחלופין, ניתן להתקין isolator אופטי לפני כל ראש לייזר כדי להסיר לחלוטין את ההשתקפויות.
   8. חבר את הקצה השני של סיבים אופטיים הזרוע תאורה של המיקרוסקופ (איור 1 H).
   9. עיצוב ולהתקין "הגדלה העדשה (mag עדשה)" את השלבים הבאים:
      הערה: הלייזרים ניתן להשתמש עבור הדמיה epi-זריחה של המדגם, אך הגודל קרן צרה של כל לייזר מגביל את השטח של המדגם לאזור מספר פעמים קטן יותר מאשר הגודל הממשי של חיישן המצלמה המתאימה, במיוחד עבור החדשים מצלמות (עם 18.8 מ מ אורך אלכסון לעומת אורך 11.6 מ מ המקובלת). לפיכך, רצוי להרחיב את הקרן להשיג תאורה גדול ושטוח של המדגם.
      1. עיצוב העדשה mag, אשר יכול להתאים לתוך הזרוע תאורה (איור 1 H).
         הערה: העיצוב של העדשה mag תלוי איפה זה יותקן. איור 1 H מראה דוגמה של ההתקנה בזרוע תאורה, אבל זה יכול להיות מותקן בכל מקום. אחרי הקורות לייזר הן מקבילות (ראה דיון). עיצוב זה עם תכנון בעזרת מחשב, תוכנות שרטוט.
      2. במקום שתי עדשות אכרומטית, אחת קעורה (אורך מוקד = f₁), ואחת קמורה (אורך מוקד = f₂) ב- mag תוצרת בית עדשה המחזיק (איור 2 א ו- 2 C), עם מרחק שווה לסכום של אורכי מוקד שלהם, f₁ + f₂ = (--25) + 50 = 25 מ מ (איור 2B).
         הערה: כאשר בחירה זו של אורכי מוקד העדשה מאג מתרחבת הקרן ב- f₂/ | f₁| = קפלי 2. העדשה mag מספק רב-תכליתיות. שניתן יהיה להסיר כדי לחדש את תאורה רגיל מבלי להרחיב את הקורות (איור דו-ממדי) או הוספת בכיוון ההפוך למקד את קרן הלייזר כדי להשיג של העוצמה עירור חזק יותר.

2. פליטת נתיב

הערה: הנתיב פליטה מורכב של עדשה גלילית נשלף, גלגל מסנן מכשול, ספליטר פליטה של מצלמה EMCCD (איור 1 ג'י). כדי להשיג את הנקודה הטובה ביותר להפיץ את הפונקציה (PSF) של מולקולות יחיד, המנסרה DIC שם מן העדשה אובייקטיבי.

1. מותאמת אישית-עיצוב בקלטת עדשה גלילית (עדשה תלת-ממדי), אשר יכול להשתלב במנתח DIC ידנית להוסיף חריץ בגוף מיקרוסקופ (איור 3C).
   הערה: עיצוב זה לא מתפשרים במנתח DIC מאז בלוק מנתח יכול להיות מוכנס על הצריח מסנן.
2. הכנס את עדשת תלת-ממדי של 10 מ' אורך מוקד בקלטת והוספתו לתוך הנתיב קרן פליטה כדי ליצור את אפקט אסטיגמציה הדרושה עבור חילוץ הקואורדינטה z של כל מולקולה בודדת¹⁴.
   הערה: לחלופין, בקלטת עדשת תלת-ממדי ניתן להניח בתוך או מחוץ הנתיב פליטה (איור 3C).
3. להתקין מפצל קרן ודיקרואיק זוהר הלהקה רב על הצריח מסנן שבתוך הגוף מיקרוסקופ.
4. להתקין מסננים פליטה.
   הערה: המסננים פליטה נבחרים בהתאם fluorophores מועדף. בהתאם מודול ההדמיה, מסנני פליטה ממוקמים במקומות שונים משמשים כמפורט להלן:
   1. צבע רב רציפים epi-קרינה פלואורסצנטית לדימות או SR הדמיה, להשתמש במסנני פליטה להציב בגלגל מסנן מכשול מחובר ליד הגופה מיקרוסקופ כדי למזער את הרטט בגוף מיקרוסקופ במהלך ערוץ הבורר (איור 1 ג'י).
   2. לצורך זיהוי צבע רב בו זמנית (למשל, smFRET ניסויים), במקום אחר מסנן הממוקם על הפיצול פליטה (הסימון שלב 4 לפרטים).
      הערה: בדרך כלל, למפצל פליטה מסחרי יש שני מצבי להחלפה (קרי, "מאורסים" או "לעקוף" מצבי). כדי להפריד פליטת האור chromatically עבור צבע רב סימולטני הדמיה (מצב "מאורסים"), משמש קוביה מסנן מחזיק שני מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר ומסננים פליטה שלוש ("טריפל קוביה," דמות 4C ו- 4 D). חריץ ריק בגלגל מסנן מכשול משמש בשילוב עם הקוביה משולשת. מצד שני, להדמיית צבע רב רציפים, הקוביה טריפל מוחלף על ידי קוביה לו מראה בתוך ("עוקף קוביה," דמות 4A ו- 4 D).
5. להתקין את המצלמה EMCCD כמו החלק האחרון של השביל פליטה. לנצל את החיבור USB-PCI להשגת קצב מהיר.
   הערה: מצלמה EMCCD מומלצת גילוי מולקולה בודדת הרגישים ביותר, אך מצלמת sCMOS מתקדם יכול להיות חלופה.

3. עקיפה מוגבל הדמיה עם אפי-עירור

1. להתאים את הזווית מקריים של לייזרים עירור למצב epi-בזרוע תאורה.
2. נתק את העדשה תלת-ממדי אם מאורסת (איור 3C, לוח נכון).
3. להוסיף לקוביה מעקף המפצל פליטה (איור 4A ו- 4E, החלונית התחתונה).
4. (אופציונלי) הכנס את העדשה mag לאזור והורחבו תאורה (איור דו-ממדי, פאנל שמאלי).
   הערה: עם השימוש עדשה מג 100 X עדשה המטרה שמן-טבילה, בערך 91 x 91 מיקרומטר² יכול להיות מואר בצורה שווה, ומבטל את הצורך להשתמש מקור אור לבן והקוביות סינון מרובים.
5. השתמש של מיקרוסקופיית imaging התוכנה לקחת רב ערוצית, ו/או Z-מחסנית, ו/או תמונות בצילום מואץ.
   הערה: יש תוכניות מרובות זמינים עבור הדמיה במיקרוסקופ, לא רק מיצרנים מיקרוסקופ, אלא גם מחברות צד שלישי או מפתחי קוד פתוח.

4. רב ערוצית מולקולה בודדת הדמיה כולל smFRET

הערה: להזיז למשרת "ריק" במערכת סינון מחסום, כך כל הפליטה לכל אורך הגל יכול להגיע עד הסט השני של ודיקרואיק זוהר/מסננים מפצלי הקרן ב המפצל פליטה.

1. כדי להגדיר את צבע רב גילוי מולקולה בודדת של מולקולות השטח. מרותק למיטה¹⁵ באמצעות עירור TIRF, כולל מדידה smFRET, להתאים את הזווית מקריים של לייזרים עירור לזווית TIRF. נתק את העדשה mag, עדשת תלת-ממדי.
2. לעסוק את מצב שלושה ערוצים המפצל פליטה (איור 1 ג'י) את השלבים הבאים:
   1. להחליף לקוביה מעקף עם קוביה"כיול" זה מאפשר לאור לעבור דרך כל הערוצים (איור 4B ו- 4E).
   2. תדליק את המצלמה תחת DIC (כלומר, לא מסנן פליטה בגלגל מסנן מכשול) ולהתאים את הצמצם של המפצל פליטה עד שלושה ערוצים נפרדים לחלוטין יופיעו על המסך.
      הערה: לבצע שלב זה עם האור בחדר מואר, שתדמיין לעצמך את כל הערוצים.
   3. הפעל את ידיות שליטה אנכיים/אופקיים התאמת המפצל פליטה ויישר בערך שלושת הערוצים (איור 4E ו- 4F).
   4. כבה את המצלמה והחלף את הקוביה כיול קוביה טריפל (איור 4C ו- 4E).
   5. במקום מדגם עם חרוזים רב-ערוצי 100 ננומטר על גבי ה-100 X עדשה המטרה ונוחות על המדגם.
   6. הפעל את המצלמה ואת הלייזר 488 ננומטר, תקריב על אחד של חרוזים בהיר, דק ליישר את שלושת הערוצים על-ידי הפעלת את התאמת ידיות שליטה שוב (איור 4E ו- 4g).
      הערה: 100-nm חרוזים רב-ערוצי פולטים אורכי גל שונים של אור על עירור 488 ננומטר, המאפשר את היישור שלושה ערוצים.
3. להפעיל את המצלמה, לייזרים, מיקוד, למצוא משרה טובה עם צפיפות מקום סביר. להתאים את כוח לייזר וזמן חשיפה כדי להשיג רמות מקובל אות לרעש ו- photobleaching. השתמש מיקרוסקופיה של תוכנות ליצירת תמונות תמונות בצילום מואץ.

5. SR הדמיה

הערה: זהו יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופ.

1. כדי להגדיר את SR הדמיה, עדשת תלת-ממדי האצוהו הסנכה העדשה מג. להגדיר את זמן החשיפה של המצלמה הערוצים לייזר מתאים (למשל, ms 5-60). לקבוע ולהגדיר באופן ידני את זווית מקריים של לייזרים עירור אופטימלית להיות הזווית TIRF.
2. מקם את הדגימה SR הדמיה מאגר¹⁶. לאפשר מאגר המשמש equilibrate לפחות 10 דקות לפני הדמיה.
   הערה: מאגר הדמיה SR יפוג לאחר בערך 1 h, כך שעליך SR חדש הדמיה מאגר בהתאם.
3. קח תמונה של DIC לפני SR הדמיה. כדי למצוא את הגובה אובייקטיבית המתאים עבור SR, אשר מייעל את האפקט אסטיגמציה, להשתמש DIC הדמיה כדי למצוא את המטוס האמצעי של התאים. לזהות את המטוס על-ידי הגובה שבו תאי המעבר מ- "אור" תמונות "כהה" ומופיעים להפוך שקוף (איור 5A, 5B, ו- 5 C). ברגע שהמטוס מוקד הרצוי נקבע, לעסוק z-להיסחף תיקון המערכת (איור 1 א').
4. התנהגות SR הדמיה. לשנות את הכוח 405 ננומטר לייזר כדי לשמור על צפיפות סבירה של כתמים 'מהבהב-על'.
   הערה: אמנם זה ניתן לשנות באופן ידני את הלייזר 405 ננומטר, זה יותר נוח להפעיל קוד רכישת נתונים מתוכנת כדי לשמור על הצפיפות של כתמים "מהבהב-על". הנה דוגמה של איך זה מתבצע באופן אוטומטי. קוד המקור זמין על פי בקשה (איור 6).
   1. להתחיל הרכישה הדמיה עם עוצמת הלייזר סגול² W/ס מ 0.
   2. לספור את מספר המקומות מהבהב על תוך תקופה מסוימת.
   3. לווסת את עוצמת הלייזר סגול כך מספר מהבהב על כתמים נשמרת לעיל על-ידי המשתמש "הספירה סף" בתוך שדה הראייה. להגדיל את עוצמת הלייזר סגול כאשר מספר כתמים מהבהב על טיפות מתחת לסף ספירה.
   4. לסיים את הרכישה כאשר מספר כתמים מהבהב על טיפות מתחת לסף ספירה באמצעות כוח מרבי לייזר סגול.
      הערה: המקסימום ניתן להגדיר באופן שונה בהתאם הבהירות דגימה, אך גבוה מ- W/cm 130². בהתאם המטרה בפועל של ההדמיה SR, קוד זה רכישה אוטומטית יופרו באופן ידני בכל עת הרצוי.
5. בדוק את התנהגות מהבהב ואת PSFs נקודות זמן קצר לאחר תחילת הרכישה.
   הערה: אם ההתנהגות מהבהב אינה אידיאלית, לשנות את זווית מקריים של לייזרים עירור או להחליף את המאגר הדמיה. מצפה דגימה של "אנכי", "אופקי" ו "diamond" צורות של PSF, המייצג fluorophores מלמטה, מעל, ובתוך המטוס מוקד, בהתאמה (איור 5D). אם כתמים מרבית מציגות PSFs לאנכי או אופקי, ואז המטוס מוקד מבוטל מהמרכז של התאים, לסיים את הניסוי, להתאים את המישור מוקד שוב. נוכחות של בועת האוויר מהשמן טבילה או גורמים מקומיים אחרים יכולים להשפיע על האיכות של PSFs, ולכן יהיה צורך להחליף את השמן או שינוי אזור הדמיה שונות המדגם.
6. לניתוח נתונים, להשתמש בקוד פתוח (ב NIH ImageJ תוספים) או קודים זמינים מסחרית לשם זיהוי centroids של כל מקום בכל מסגרת הדמיה לחלץ ערכים-z של כל נקודה מ- x ו- y-ברוחב¹⁴.
   הערה: בדו ח זה, קוד מקור שפותחה במקור באחת המוקדם יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR⁸ שונה עבור זיהוי תלת-ממדי¹⁶ , היה בשימוש.
7. במקרה של שני צבעים הדמיה, תמונה של fluorophore עם הגל ארוך יותר עירור, ואחריו עם אורך גל קצר יותר עירור. להפעיל את הקוד רכישה אוטומטית באופן דומה לזו המתוארת בשלב 5.4, אבל עם לייזר הדמיה שונות.
   הערה: אברציה כרומטית אמור להיפתר בין תמונות שונות fluorophores (למשל, צבע אדום, צבע צהוב, ירוק). להלן השלבים.
   1. לשתק מספר החרוזים רב-ערוצי 100-nm coverslip זכוכית, הימנעות להרכיב אשכולות.
   2. קח תמונות של אותם בערוצים עירור שונות.
   3. תמצית שלהם (X, Y, Z) נקודות ציון על ידי תוכנה (שלב 5.6).
   4. מגרש ΔX_אני = X_1i - X_2i וΔY_i = Y_1i - Y_2i (על כך חרוזים שונים, ו 1 ו-2 הם ערוצי צבע שונה) בנפרד ולהתאים אותם עם פונקציות נאותה. שמור את הפונקציות.
      הערה: פונקציה קווית מספיקים ברוב המקרים. ברגע פונקציות אלה נקבעים, מדידה זו אין צורך לחזור בכל פעם הדמיה.
   5. בבפועל שני צבעים SR ההדמיה של מדגם של עניין, להחיל בפונקציות על הנכון (X, Y) אברציה כרומטית. עבור z-directional אברציה כרומטית, לנהל אותה על ידי קבלת ΔZ = Z₁ - Z₂ חרוזים רב-ערוצי או דגימות רב-ערוצי הייחוס המוכרת נזרע יחד עם הדוגמה של עניין.
      הערה: בניגוד (X, Y) אברציה כרומטית, אברציה כרומטית z-directional אינו טוב-לשחזור ניסוי, בעיקר בשל תחזוקה המוקד z-directional לא שלם על ערוץ מיתוג. לכן, מומלץ לבצע את התיקון בכל פעם. ΔZ = Z₁ - Z₂ הוא בעיקר תלוי (X, Y), אז רק כמה חרוזים או דוגמיות יהיה מספיק לכל כל אזור הדגימה של עניין. מגרש בנוי הסופי שני צבעים SR תמונות תוכנה להדמיה תלת-ממדי וסמנו ΔZ באופן ידני.

תוצאות

מיקרוסקופ זה מאפשר גמישות לשחזור מעבר בין שיטות הדמיה שונות. הנה אנחנו מראים תמונות לדוגמה הנאספים יחד עם כל מודול ההדמיה.

איור 5D מדגים את PSF של המולקולה מהבהב על במהלך רכישת SR. אלפי תמונות כאלה משוחזרים כדי ליצור את התמונה...

Discussion

מערכת מיקרוסקופ היברידית זו מבטלת את הצורך לרכוש מיקרוסקופים מרובים. הסכום הכולל עבור כל החלקים, כולל שולחן אופטי, שולחן העבודה ההתקנה, התוכנה, תחנת עבודה, הוא בערך דולר ועל 230,000 שמו. חלקים במכונה מותאם אישית, כולל עדשה mag, עדשת תלת-ממדי, עולה בסביבות 700 דולר (המחיר תלוי האישום בפועל במוסדות ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E microscope stand	Nikon	Ti-E
Objective lens	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M	This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block	Nikon	Ti-A	This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system	Nikon	PFS	This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top	TMC	783-655-02R
Optical table bases	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink	Cobolt	11658 (HS-03)	Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink	Coherent	1193289	Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable	L-com	CC58C-6	RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter	L-com	BA1087	Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optical Filter Changer
Emission Splitter	Cairn	OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter	Chroma	ET700/75M	Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET595/50M	Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET525/50M	Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set	Chroma	49000	installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 long pass filter	Chroma	T590LPXR-UF1	for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter	Chroma	T525LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter	Chroma	T470LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647)	Chroma	zet640/20x	for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488)	Semrock	LL01-488-25	for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source	Excelitas	X-Cite120LED	used only for DAPI imaging
Mirror mount	Newport	SU100-F3K
Optical posts	Newport	PS-2
Clamping fork	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring	Thorlabs	CMRR	used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount	Thorlabs	SM1Z	Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible
Achromatic Doublet lens	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm
Cage Plate	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap
Cage Assembly Rod	Thorlabs	ER4	Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm
Cage Mounting Bracket	Thorlabs	CP02B	30 mm Cage Mounting Bracket
Single mode optical fiber	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multi mode optical fiber	Thorlabs	M42L01	Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens"
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens"
Retaining ring	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens"
Nylon-tipped screw	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens"
3D lens	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, rectangular cylindrical lens
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 888
100 nm multichannel beads	Thermo	T7279, TetraSpeck microspheres
red dye	Thermo	Alexa Fluor 647
yellow-green dye	GE Healthcare	Cy3
green dye	GE Healthcare	Cy3B
blue dye	Thermo	Alexa Fluor 488