Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.

Zusammenfassung

Fluoreszenz-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug biologische Moleküle in Situ zu erkennen und ihre Dynamik und Interaktionen in Echtzeit zu überwachen. Neben konventionellen Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie wurden verschiedene bildgebende Verfahren entwickelt, um spezifische experimentelle Ziele zu erreichen. Einige der weit verbreiteten Techniken umfassen Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (SmFRET), die Konformationsänderungen und molekulare Interaktionen mit Ångström Auflösung und Einzelmolekül-Erkennung-basierten berichten können Super-Resolution (SR) bildgebende Verfahren, die die räumliche Auflösung etwa zehn zu Lampentyp im Vergleich zur Beugung begrenzte Mikroskopie erhöhen kann. Hier präsentieren wir Ihnen ein Kunde entwickelt integriertes System, das mehrere bildgebende Verfahren in einem Gerät, einschließlich der konventionellen Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich SmFRET Bildgebung. Verschiedene bildgebende Verfahren können durch optische Schaltelemente leicht und reproduzierbar erreicht werden. Dieses Set-up ist einfach, von jedem Forschungslabor in den biologischen Wissenschaften mit einem Bedürfnis nach Routine und diverse bildgebenden Experimenten zu einem reduzierten Preis und Platz im Vergleich zu separaten Mikroskope für individuelle Zwecke bauen erlassen.

Einleitung

Fluoreszenz Mikroskope sind wichtige Werkzeuge für die moderne biologische Forschung und Fluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Biologie Labors routinemäßig durchgeführt. Durch tagging Biomoleküle mit Fluorophore, können wir direkt unter dem Mikroskop zu visualisieren und erfassen die zeitabhängige Änderungen in Lokalisierung, Konformation, Interaktion, und Montage Zustand in Vivo oder in Vitro. Herkömmlichen Fluoreszenz Mikroskope haben eine Beugung begrenzte Ortsauflösung, die ~ 200-300 nm in seitlicher Richtung und ca. 500-700 nm in axialer Richtung^1,2, und sind daher beschränkt auf Bildgebung bei der 100 s von Nanometer-µm-Skala. Um Feinheiten in der molekularen Montage oder Organisation zu offenbaren, entstanden verschiedene SR-Microscopies, die die Beugungsgrenze brechen kann. Strategien zur Erreichung SR umfassen eine nichtlineare optische Effekte, wie z. B. stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie^3,4 und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)^{5,6, 7}, stochastische Erkennung von einzelnen Molekülen, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)⁸ und photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM)⁹und eine Kombination aus beidem, z. B. MINFLUX¹⁰. Unter diesen Microscopies SR können Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskope relativ leicht von einem Einzelmolekül-Mikroskop-Set-up geändert werden. Mit sich wiederholenden Aktivierung und Bildgebung von Photoactivatable fluoreszierenden Proteinen (FPs) oder Foto-schaltbare Farbstoffen markiert auf Biomoleküle von Interesse kann räumlicher Auflösung 10-20 nm¹¹erreichen. Informationen über molekulare Interaktionen und Konformationsänderungen gewinnen ist Dynamik in Echtzeit, Ångström-Nanometer Auflösung erforderlich. SmFRET^12,13 ist ein Ansatz, um diese Auflösung zu erreichen. In der Regel abhängig von der biologischen Fragen von Interesse, werden bildgebende Verfahren mit unterschiedlicher räumlicher Auflösung benötigt.

In der Regel ist für jede Art der Bildgebung, bestimmte Erregung und/oder Emission optische Konfiguration erforderlich. Zum Beispiel ist eines der am häufigsten verwendete Beleuchtung-Methoden für die Einzelmolekül-Erkennung durch Totalreflexion (TIR), in denen ein bestimmte Erregung Winkel durch ein Prisma oder durch das Objektiv erreicht werden muss. Für die Erkennung von SmFRET müssen Emissionen von Donor und Akzeptor Farbstoffe räumlich getrennt und gerichtet auf verschiedene Teile der Elektron-Multiplikation, – Coupled Ladegerät (EMCCD), die mit einer Reihe von Spiegeln und dichroitischen Strahlteilern erreicht werden kann in der Emission Weg gelegt. Für dreidimensionale (3D) ist SR imaging, eine optische Komponente, wie z. B. eine Zylinderlinse¹⁴, musste einen Astigmatismus-Effekt in der Emission Pfad führen. Daher Homebuilt oder kommerziell erhältliche integrierte Mikroskope sind in der Regel, funktionell für jede Art von bildgebendes Verfahren spezialisiert und sind nicht flexibel wechseln zwischen verschiedenen bildgebenden Verfahren auf die gleiche Set-up. Hier präsentieren wir Ihnen ein kostengünstige, Hybridsystem, das verstellbare und reproduzierbare wechselt zwischen drei verschiedenen bildgebenden Verfahren bietet: konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung mit Beugung begrenzte Auflösung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung, einschließlich SmFRET imaging (Abbildung 1A). Insbesondere das Setup hier vorgestellten enthält fasergekoppelte Eingabe Laser für mehrfarbige Erregung und ein kommerzielle Beleuchtung Arm in die Erregung Weg, wodurch programmiert Kontrolle der Erregung Winkel zwischen Epi-Modus und TIR-Modus wechseln. In der Emission Weg eine abnehmbare Homebuilt Zylinderlinse Kassette befindet sich innerhalb des Körpers Mikroskop für SR 3D-Imaging und ein kommerziellen Strahlteiler befindet sich vor einer EMCCD Kamera, die selektiv aktiviert werden kann, um mehrere Kanäle der Emission zu erkennen gleichzeitig.

Protokoll

(1) Mikroskop Konstruktion und Montage

1. Erregung Weg
   Hinweis: Der Erregung-Pfad enthält, Laser, differential Interferenz Kontrast (DIC) Komponenten, die Mikroskop-Körper und seine Beleuchtung Arm.
   1. Bereiten Sie einen Vibration isoliert optischen Tisch. Beispielsweise bietet eine strukturelle Dämpfung Tabelle mit 48 x 96 x 12'' genügend Platz für alle Komponenten.
      Hinweis: Erstellen Sie das Setup in einem Raum mit Temperaturregelung (z. B.21,4 ± 0,55 ° C). Temperaturstabilität ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der optischen Achse.
   2. Installieren Sie einen Mikroskop-Körper, der ausgestattet ist mit Beleuchtung Arm für LWL-Anschluss, ein 100 X Objektiv Ölimmersion TIRF und DIC Komponenten.
   3. Legen Sie vier Laserköpfe (647 nm, 561 nm, 488 nm und 405 nm, umkreist in Abbildung 1 b) ihre Kühlkörper auf dem optischen Tisch und stellen Sie sicher die ausgesandten Laserstrahlen haben die gleiche Höhe und sind so kurz wie möglich (z.B. gute Standfestigkeit 3'').
      Hinweis: Wenn eine Laser-Kopf in einer kürzeren Höhe als andere Laser sitzt, setzen Sie eine Alu-Platte mit ausreichend dicke darunter. Immer gewährleisten Sie maximalen Kontakt zwischen dem Kühlkörper und der optischen Tisch für die beste Wärmeabfuhr (Abbildung 1 b). Die Laser müssen stark genug sein für die SR-Bildgebung. Siehe Tabelle der Materialien. Es wird empfohlen, die Aufräumarbeiten Laserfilter vor Diodenlaser haben.
   4. Installieren Sie eine Datenkarte für die Übernahme durch eine periphere Component Interconnect (PCI)-Interface in einer Workstation zu und verbinden Sie Laser mit dieser Karte. Kontrollieren Sie die Laser ON/OFF Verhaltensweisen von Transistor-Transistor-Logik (TTL) Ausgang und ihre Leistungsanpassung durch den analogen Ausgang dieser Karte (Abbildung 1). Installieren Sie eine richtige Mikroskopie imaging-Software (kommerziell oder Homebuilt), die Datenkarte Übernahme zu kontrollieren sowie die Mikroskop-Körper.
   5. Montieren Sie Spiegel und dichroitischen Strahlteilern (590, 525 und 470 lange pass Filter) zu ihren jeweiligen Halterungen. Verwenden Sie sehr stabile Spiegelhalter für die Spiegel. Verwenden Sie kreisförmige Splitter mit Sicherungsringen um zu vermeiden, ein Verbiegen der dichroitischen Strahlteilern (Abbildung 1).
   6. Legen Sie die Spiegel und dichroitischen Strahlteilern auf dem optischen Tisch, die Laserstrahlen (Abbildung 1 b) zu kombinieren. Um die stabilsten Ausrichtung zu erreichen, machen Sie das ganze Arrangement so kompakt wie möglich zu, und verwenden Sie Dicke 1'' optische Beiträge. Ordnen Sie die Laser so an, dass die kürzere Wellenlänge Laser näher an der LWL-Kupplung (Abbildung 1 b), sind da kurzwellige Licht mehr in der Luft zu zerstreuen.
   7. Kombinieren Sie Laserstrahlen in eine Monomode-Glasfaser. Hierzu bauen Sie ein LWL-Koppler in einem Käfig-System folgende Schritte durch:
      1. Montieren Sie eine Adapterplatte Faser in eine z-Achse Übersetzung montieren (Abb. 1E, linken Panel).
      2. Montieren Sie eine achromatische Wams Objektiv (Brennweite = 7,5 mm) in einer Führungsscheibe (Abb. 1E, zweiten Fenster von links).
      3. Verbinden Sie die zwei Teile oben von Verlängerungsstangen in einem Käfig zu bilden. Montieren Sie den Käfig auf dem optischen Tisch mit Halterungen an den 1'' dicken optische Pfosten (Abb. 1E, mittleren Bereich).
      4. Ausrichten des 647-nm-Lasers zuerst mit einem Monomode-Glasfaser (FC/APC Ende der Koppler).
         Hinweis: Eine grobe Ausrichtung mit einem Multimode-Glasfaser, bevor die Monomode-Glasfaser den Alignment-Prozess mit Hilfe kann. Passen Sie den Winkel der Spiegel und dichroitischen Strahlteilern (Abbildung 1, von Einstellknöpfen), sowie der Abstand zwischen der achromatischen Doublet Linse und die Faser-Adapterplatte (Abbildung 1E, durch Anpassen der z-Achse Übersetzung Mount) zu gewinnen maximale Laserleistung durch die Faser.
      5. Sobald die Ausrichtung des ersten Lasers erfolgt, vorübergehend ein paar Iris zu installieren und den Rest der Laser eins nach dem anderen (Abb. 1F) ausrichten. Überprüfen Sie die Ausrichtung Effizienz mit einem Leistungsmesser.
      6. Lassen Sie eine Iris an der Vorderseite der Adapterplatte, die Reflexionen der Laser zu reduzieren.
         Hinweis: Strong wieder Reflexionen reduzieren die Lebensdauer der Laserquellen. Optional kann ein optischer Isolator vor jeder Laserkopf, die Reflexionen vollständig zu entfernen installiert werden.
   8. Verbinden Sie das andere Ende des Lichtleiters Beleuchtung Arm des Mikroskops (Abbildung 1 H).
   9. Entwerfen Sie und installieren Sie die "Vergrößerungslinse (Mag Objektiv)" durch die folgenden Schritte:
      Hinweis: Der Laser können für Epi-Fluoreszenz-Bildgebung der Probe verwendet werden, aber die schmalen Strahlgröße jeder Laser beschränkt das Leuchtfeld der Probe zu einer Fläche kleiner als die tatsächliche Größe der entsprechenden Kamera-Sensor, vor allem für die neuere Kameras (mit 18,8 mm Diagonale Länge im Vergleich zu den herkömmlichen 11,6 mm Länge). Daher ist es wünschenswert, erweitern Sie den Strahl um eine größere und flachere Beleuchtung der Probe zu erreichen.
      1. Design der Mag-Linse, die in der Beleuchtung Arm (Abbildung 1 H) passen.
         Hinweis: Das Design des Objektivs Mag hängt davon ab, wo es installiert werden soll. Abbildung 1 H zeigt ein Beispiel für die Installation im Studienarm mit Beleuchtung, aber es kann in jeder beliebigen Stelle installiert werden, nachdem die Laserstrahlen kollimierten (siehe Diskussion) sind. Mit einem Computer-aided-Design und Erstellung Software zu entwerfen.
      2. Legen Sie zwei achromatische Linsen, eine konkave (Brennweite = f₁), und eine konvexe (Brennweite = f₂) in den hausgemachten Mag Objektivhalter (Abbildung 2A und 2 C), mit dem Abstand gleich der Summe ihrer Brennweiten f₁ + f₂ = (-25) + 50 = 25 mm (Abb. 2 b).
         Hinweis: Mit dieser Auswahl an Brennweiten, erweitert das Mag Objektiv den Strahl durch f₂/ | f₁| = 2 Falten. Das Mag Objektiv bietet Vielseitigkeit. Es kann entfernt, um die normale Beleuchtung wieder aufzunehmen, ohne Ausbau der Balken (Abb. 2D) oder eingefügt in die umgekehrte Richtung zu konzentrieren, den Laserstrahl um eine stärkere Anregung Intensität zu erreichen.

2. Emission Pfad

Hinweis: Die Emission Pfad besteht aus abnehmbaren Zylinderlinse, ein Barriere-Filterrad, eine Emission Splitter und einer EMCCD Kamera (Abbildung 1). Um den optimalen Punkt zu erreichen verteilt Funktion (PSF) von einzelnen Molekülen, das DIC Prisma ist gesetzt, Weg von der Objektivlinse.

1. Custom-Design der Zylinderlinse (3-d-Objektiv)-Kassette, die in der manuellen DIC Analyzer passen kann einfügen Slot im Mikroskop Körper (Abbildung 3).
   Hinweis: Das Design den DIC-Analyzer beeinträchtigt nicht da ein Analysator-Block in der Filterrevolver eingefügt werden kann.
2. Legen Sie das 3-d-Objektiv 10 m Brennweite in der Kassette und legen Sie sie in den Strahlengang der Emission den Astigmatismus-Effekt für die Z-Koordinate jedes einzelne Molekül¹⁴extrahieren schaffen.
   Hinweis: Optional kann die 3-d-Objektiv-Kassette in oder aus dem Emissions-Weg (Abbildung 3) platziert werden.
3. Installieren Sie einen Multiband dichroitischer Strahlteiler in Filterrevolver innerhalb der Mikroskop-Körper.
4. Installieren Sie Emission-Filter.
   Hinweis: Die Emission Filter sind abhängig von der bevorzugten Fluorophore gewählt. Je nach imaging Modul dienen Emission Filter an verschiedenen Orten platziert, wie nachfolgend beschrieben:
   1. Verwenden Sie für sequentielle Multi-Color-Epi-Fluoreszenz-Bildgebung oder SR Bildgebung Emission Filter platziert in die Barriere Filterrad neben dem Mikroskop Körper verbunden, um die Schwingung im Mikroskop Körper während Kanalumschalter (Abbildung 1) zu minimieren.
   2. Legen Sie für gleichzeitige Multi-Color-Erkennung (z.B., SmFRET Experimente) einen weiteren Filter inmitten einer Emission-Splitter (Prüfschritt 4 für Details).
      Hinweis: In der Regel hat ein kommerzielle Emission Splitter zwei schaltbare Modi (d.h., "engagiert" oder "umgehen" Modi). Um Emissionen Lichter chromatisch für gleichzeitige Multi-Color Imaging ("engagiert" Modus) zu trennen, ein Filter Cube hält zwei dichroitischen Strahlteilern und drei Emission Filter verwendet ("dreifache Würfel," Abbildung 4 und 4 D). Ein leeres Feld in das Filterrad Barriere dient in Kombination mit dem dreifachen Würfel. Auf der anderen Seite für sequentielle Multi-Color Imaging wird der dreifache Würfel mit einem Quader ersetzt, die nur einen Spiegel im Inneren ("Bypass Würfel," Abbildung 4A und 4D) hat.
5. Installieren Sie die EMCCD Kamera, als der letzte Teil des Weges Emission. Nutzen Sie die USB-PCI-Verbindung um eine schnelle Bildrate zu erreichen.
   Hinweis: Eine EMCCD Kamera empfiehlt sich für die empfindlichsten Einzelmolekül-Erkennung, sondern eine erweiterte sCMOS Kamera kann eine Alternative sein.

(3) Beugung begrenzte Imaging mit Epi-Anregung

1. Stellen Sie die Erregung Laser anfallende Winkel Epi-Modus im Studienarm mit Beleuchtung.
2. Lösen Sie die 3-d-Objektiv wenn (Abbildung 3, rechts) engagiert.
3. Die Bypass-Cube in der Emission-Splitter (Abbildung 4A und 4E, Bodenplatte) einfügen.
4. (Optional) Legen Sie das Mag Objektiv für eine erweiterte Beleuchtung Bereich (Abb. 2D, links).
   Hinweis: Mit der Verwendung von einem Mag Objektiv und ein 100 X Objektiv Öl-Immersion, kann ca. 91 x 91 µm² gleichmäßig beleuchtet werden entfällt die Notwendigkeit, eine weiße Lichtquelle und mehrere Filter Cubes verwenden.
5. Verwenden Sie eine imaging-Software zu Multi-Channel, Mikroskopie und/oder Z-Stapel und/oder Zeitraffer Bilder.
   Hinweis: Es gibt mehrere Programme für die Mikroskopie Bildgebung, nicht nur von Mikroskop-Herstellern, sondern auch von Drittfirmen oder open-Source-Entwickler.

4. Multi-Channel Einzelmolekül-Bildgebung einschließlich smFRET

Hinweis: Verschieben Sie, eine "leere" Position in der Barriere Filterrad, so dass die Emission mit beliebiger Wellenlänge, der zweite Satz von Filtern/dichroitischen Strahlteilern Emission Splitter erreichen kann.

1. Zum Einrichten von Multi-Farberkennung Einzelmolekül-Oberfläche immobilisiert Moleküle¹⁵ mit TIRF Erregung, einschließlich SmFRET-Messung, einstellen Sie die Erregung Laser anfallende Winkel TIRF Winkel. Das Mag Objektiv und dem 3-d-Objektiv zu lösen.
2. Der drei-Kanal-Modus in der Emission-Splitter (Abbildung 1) durch die folgenden Schritte zu engagieren:
   1. Den Bypass-Würfel mit einem "Kalibrierung Cube" zu ersetzen, die lässt Licht durch alle Kanäle (Abbildung 4 b und 4E) gehen.
   2. Schalten Sie die Kamera unter DIC (d.h. keine Emission Filter in das Filterrad Barriere) und stellen Sie die Blende des Splitters Emission bis drei vollständig getrennte Kanäle auf dem Bildschirm angezeigt werden.
      Hinweis: Führen Sie diesen Schritt mit dem Raumlicht beleuchtet, um alle Kanäle zu visualisieren.
   3. Die Emission Splitter schalten Sie die vertikale/horizontale Anpassung Regler und grob richten Sie der drei Kanäle (Abbildung 4E und 4F aus).
   4. Schalten Sie die Kamera und ersetzen Sie die Kalibrierung Cube mit einem dreifachen Würfel (Abbildung 4 und 4E) zu.
   5. Legen Sie eine Probe mit 100 nm Multichannel-Perlen auf dem 100 X Objektiv und konzentrieren sich auf die Probe.
   6. Schalten Sie die Kamera und der 488 nm Laser, vergrößern Sie eines hellen Perlen und richten Sie fein der drei Kanäle durch drehen die Einstellung Regler wieder (Abbildung 4E und 4 G aus).
      Hinweis: Multichannel-Perlen 100 nm emittieren verschiedene Wellenlängen des Lichts auf 488 nm Anregung, damit die Dreikanal-Ausrichtung.
3. Schalten Sie die Kamera und Laser, Fokus, und finden Sie eine gute Position mit einer vernünftigen spot Dichte zu. Stellen Sie den Laser Power und Belichtung auf akzeptables Signal-Rausch- und Immunofluoreszenz Niveau zu erreichen. Verwenden Sie die Mikroskopie imaging-Software, um time-lapse Bilder zu nehmen.

5. SR Imaging

Hinweis: Dies ist Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskopie.

1. Um SR Bildgebung einzurichten, legen Sie die 3-d-Objektiv und entfernen Sie die Linse Mag. Legen Sie die Belichtungszeit der Kamera in den entsprechenden Laserkanälen (z.B.5-60 ms). Bestimmen Sie und legen Sie manuell die optimale Erregung Laser anfallende Winkel der TIRF Winkel sein.
2. Legen Sie die Probe in SR imaging Puffer¹⁶. Lassen Sie den Puffer für mindestens 10 Minuten vor Bildgebung equilibrate.
   Hinweis: SR bildgebenden Puffer läuft nach etwa 1 h, so machen neue SR imaging Puffer entsprechend.
3. Nehmen Sie eine DIC-Bild vor SR-Bildgebung. Verwenden Sie, um die richtige Höhe der Objektive für SR, finden, die den Astigmatismus Effekt optimiert, DIC imaging um zu der Mittelebene der Zellen zu finden. Das Flugzeug durch die Höhe, bei dem die Zellen Übergang von "Light", "dunkle" Bilder und durchsichtig scheinen, zu identifizieren (Abb. 5A, 5 bund 5 C). Sobald die gewünschte Schärfeebene feststeht, engagieren Sie die Z-Drift-Korrektur-System (Abbildung 1A).
4. Führen Sie SR-Bildgebung. Ändern Sie die 405 nm Laserleistung weiterhin eine angemessene Dichte "blinkt-on" stellen.
   Hinweis: Es ist, zwar möglich, die 405 nm Laser manuell zu ändern ist es bequemer, führen Sie einen programmierten Daten Akquisition Code, um die Dichte der "blinken-ein" Flecken zu erhalten. Hier ist ein Beispiel des wie sie automatisch durchgeführt wird. Der Quellcode ist verfügbar auf Anfrage (Abbildung 6).
   1. Beginnen Sie die bildgebende Übernahme mit 0 W/cm² violette Laser-Energie.
   2. Die Anzahl der blinken auf Flecken in einem bestimmten Zeitraum.
   3. Die violetten Laserleistung zu modulieren, so dass die Anzahl der blinkenden auf Flecken über eine benutzerdefinierte "zählen Schwelle" in das Blickfeld gehalten wird. Die violetten Laserleistung zu erhöhen, die Zählung Schwelle sinkt die Anzahl der blinkenden auf Flecken.
   4. Beenden Sie die Übernahme, sinkt die Anzahl der blinkenden auf Flecken unter der Zählung Schwelle mit der maximalen Violett Laser macht.
      Hinweis: Die maximale kann unterschiedlich je nach Probe Helligkeit einstellen, aber nicht höher als 130 W/cm². Je nach das eigentliche Ziel der SR Bildgebung kann diese automatische Erfassung Code manuell zu jedem gewünschten Zeitpunkt gekündigt werden.
5. Überprüfen Sie die blinkende Verhalten und PSFs der Spots bald nach Beginn der Übernahme.
   Hinweis: Wenn das blinkende Verhalten nicht ideal ist, die Erregung Laser anfallende Winkel ändern oder ersetzen des bildgebenden Puffers. Erwarten Sie eine Auswahl der "vertikalen", "horizontal" und "Rauten" PSF, repräsentieren Fluorophore von unten, oben und in der Brennebene jeweils (Abbildung 5). Wenn die meisten Spots entweder vertikal oder horizontal PSFs zeigen, dann die Brennebene ist weg von der Mitte der Zellen, also das Experiment zu beenden und die Brennebene erneut einstellen. Eine Präsenz der Luftblase in der Immersionsöl oder anderen lokalen Faktoren auswirken kann das PSFs Qualität, es kann notwendig sein, das Öl zu wechseln oder wechseln zu einem anderen bildgebenden Bereich der Probe.
6. Verwenden Sie für die Datenanalyse open Source (im NIH ImageJ Plugins) oder kommerziell verfügbaren Codes erkennen Zentroide von jedem Fleck in jedem bildgebenden Frame und Z-Werte von jedem Ort aus x und y-Breite¹⁴extrahieren.
   Hinweis: In diesem Bericht ein Quellcode, die ursprünglich in einem der frühesten Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR⁸ entwickelt wurde für 3-d-Erkennung¹⁶ geändert und diente.
7. Im Fall von zwei-Farben-Bildgebung, Bild der Fluorophor mit der längeren Wellenlänge der Erregung, gefolgt von den mit der kürzeren Wellenlänge der Erregung. Führen Sie den automatisierten Übernahme Code ähnlich beschrieben im Schritt 5.4, aber mit einem anderen bildgebenden Laser.
   Hinweis: chromatische Aberration sollten zwischen den Bildern mit verschiedenen Fluorophore (z.B., roten Farbstoff und gelb-grüne Färbung) korrigiert werden. Hier sind die Schritte.
   1. Mehrere 100 nm Multichannel-Perlen auf der Glas-Deckglas, Vermeidung von bilden Cluster zu immobilisieren.
   2. Nehmen Sie Bilder von ihnen in verschiedenen Erregung Kanälen.
   3. Auszug ihrer (X, Y, Z) durch Software (Schritt 5.6) koordiniert.
   4. Plot ΔX_ich = X_1i - X_2i und ΔY_i = Y_1i - Y_2i (i steht für verschiedene Perlen und 1 und 2 sind die verschiedenen Farbkanäle) getrennt und mit entsprechenden Funktionen passen. Speichern Sie die Funktionen.
      Hinweis: Lineare Funktionen sind in den meisten Fällen ausreichend. Sobald diese Funktionen bestimmt sind, muss diese Messung nicht jedes Mal der Bildgebung wiederholt werden.
   5. Gelten Sie in der eigentlichen Zweifarben-SR Bildgebung eine Stichprobe von Interesse die Funktionen für richtig (X, Y) chromatische Aberration. Für die Z-direktionale chromatische Aberration, führen es durch den Erwerb von ΔZ = Z₁ – Z₂ für Mehrkanal-Perlen oder bekannten Mehrkanal-Referenzproben ausgesät zusammen mit der Probe von Interesse.
      Hinweis: im Gegensatz zu (X, Y) chromatische Aberration, Z-direktionale chromatische Aberration ist nicht gut reproduzierbar in jedem Experiment, hauptsächlich aufgrund von unvollständigen Z-direktionale Fokus Wartungsarbeiten beim Kanalwechsel. Daher empfiehlt es sich, die Korrektur jedes Mal durchführen. ΔZ = Z₁ – Z₂ ist meist unabhängig von (X, Y), nur ein paar Perlen oder Referenzproben würde ausreichen pro jeder Probe-Bereich von Interesse. Grundstück errichteten letzten Zweifarben-SR Bilder in eine 3-d-Visualisierungs-Software und ΔZ manuell zu überprüfen.

Ergebnisse

Dieses Mikroskop ermöglicht flexible und reproduzierbare Umschalten zwischen verschiedenen bildgebenden Verfahren. Hier zeigen wir Beispielbilder mit jedem imaging Modul gesammelt.

Abbildung 5 zeigt die PSF des Moleküls blinken auf während der SR-Übernahme. Tausende solcher Bilder sind rekonstruiert worden, um das endgültige Bild SR (Abb. 5E) zu generieren.

Diskussion

Dieses Mikroskop Hybridsystem entfällt die Notwendigkeit, mehrere Mikroskope zu kaufen. Die Gesamtkosten für alle Teile, einschließlich der optischen Tisch, Tisch Einbau Arbeit, Software und Workstation, ist ungefähr $230.000. Benutzerdefinierte bearbeitet Teile, einschließlich der Mag Objektiv und 3-d-Objektiv kostet ca. $700 (der Preis hängt von der tatsächlichen Gebühren an verschiedenen Instituten). Typische kommerziell verfügbare integrierte Systeme für Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskopie mehr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E microscope stand	Nikon	Ti-E
Objective lens	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M	This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block	Nikon	Ti-A	This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system	Nikon	PFS	This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top	TMC	783-655-02R
Optical table bases	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink	Cobolt	11658 (HS-03)	Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink	Coherent	1193289	Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable	L-com	CC58C-6	RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter	L-com	BA1087	Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optical Filter Changer
Emission Splitter	Cairn	OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter	Chroma	ET700/75M	Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET595/50M	Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET525/50M	Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set	Chroma	49000	installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 long pass filter	Chroma	T590LPXR-UF1	for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter	Chroma	T525LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter	Chroma	T470LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647)	Chroma	zet640/20x	for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488)	Semrock	LL01-488-25	for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source	Excelitas	X-Cite120LED	used only for DAPI imaging
Mirror mount	Newport	SU100-F3K
Optical posts	Newport	PS-2
Clamping fork	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring	Thorlabs	CMRR	used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount	Thorlabs	SM1Z	Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible
Achromatic Doublet lens	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm
Cage Plate	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap
Cage Assembly Rod	Thorlabs	ER4	Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm
Cage Mounting Bracket	Thorlabs	CP02B	30 mm Cage Mounting Bracket
Single mode optical fiber	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multi mode optical fiber	Thorlabs	M42L01	Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens"
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens"
Retaining ring	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens"
Nylon-tipped screw	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens"
3D lens	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, rectangular cylindrical lens
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 888
100 nm multichannel beads	Thermo	T7279, TetraSpeck microspheres
red dye	Thermo	Alexa Fluor 647
yellow-green dye	GE Healthcare	Cy3
green dye	GE Healthcare	Cy3B
blue dye	Thermo	Alexa Fluor 488