실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

요약

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

초록

형광 현미경 검사 법 생물학 분자에 제자리에서 감지 하 고 그들의 역학과 실시간으로 상호 작용을 모니터링 하는 강력한 도구입니다. 기존의 피-형광 현미경 검사 법, 뿐만 아니라 다양 한 이미징 기술은 특정 실험 목표를 달성 하기 위해 개발 되었습니다. 널리 사용 되는 기술의 일부 구조적 변화와 angstrom 해상도와 단일 분자 검출 기반 분자 상호 작용을 보고할 수 있는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (smFRET) 포함 슈퍼 해상도 (SR) 이미징, twentyfold 회절 제한 된 현미경 검사 법에 비해 공간 해상도를 약 10를 강화 수 있습니다. 여기에 우리가 고객 설계 통합된 시스템을 병합 한 현미경, 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 SR 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출을 포함 한 여러 이미징 방법 제시 smFRET 이미지를 포함 하 여. 다른 이미징 방법은 쉽고 reproducibly 광학 요소를 전환 하 여 얻을 수 있습니다. 이 설정 루틴 및 감소 된 비용 및 개별 목적에 대 한 별도 현미경 건물 상대적인 공간에 다양 한 이미징 실험에 대 한 필요와 함께 생물 과학에 어떤 연구소에 의해 채택 하는 것이 더 쉽습니다.

서문

형광 현미경 현대 생물 과학 연구를 위한 중요 한 도구 이며 형광 이미징 정기적으로 많은 생물학 실험실에서 수행 됩니다. Fluorophores에 대 한 관심의 생체에 태그를 지정, 우리가 직접 현미경 그들을 시각화 하 고 지역화, 구조, 상호 작용, 및 조립 상태 vivo 또는 생체 외에서시간에 따른 변화를 기록 수 있습니다. 기존의 형광 현미경 있다 회절 한정 된 공간 해상도 측면 방향으로 200 ~ 300 nm와 ~ 500-700 nm 축 방향^1,2에 이다, 따라서, 이미징의 100s에 제한 나노미터-미크론 규모입니다. 회절 한계를 깰 수 있는 다양 한 SR microscopies 분자 어셈블리 또는 조직에 미세한 세부 정보를 공개 하기 위해 개발 되었습니다. SR를 달성 하는 데 사용 하는 전략 등이 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경^3,4 구조화 조명 현미경 (SIM)^5,6, 등의 비선형 광학 효과 ⁷, 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)⁸ , photoactivated 지역화 현미경 (팜)⁹, MINFLUX¹⁰등 둘의 조합 등 단일 분자의 확률론 탐지. 이러한 SR microscopies 중 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 단일 분자 현미경 설정에서 상대적으로 쉽게 수정할 수 있습니다. 반복적인 활성화 및 photoactivatable 형광 성 단백질 (FPs) 또는 관심의 생체에 태그 사진 전환 염료의 이미징, 공간 해상도 10-20 nm¹¹를 도달할 수 있다. 분자 상호 작용 및 구조적 정보를 실시간, angstrom 나노미터 분해능의 역학이 필요 합니다. smFRET^12,13 는이 해상도 달성 하기 위해 하나의 방법입니다. 일반적으로, 관심사의 생물학 질문에 따라 다른 공간 해상도 이미징 방법 필요 합니다.

일반적으로, 이미지의 각 유형에 대 한 특정 여기 / 방출 광 구성 필요 합니다. 예를 들어, 단일 분자 검출에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 조명 방법 중 하나는 특정 자극 각도 프리즘을 통해 또는 대물 렌즈를 통해 달성 될 필요가 총 내부 반사 (사격)을 통해서이다. SmFRET 검출에 대 한 기증자와 수락자 염료에서 방출 필요가 공간적으로 분리 하 고는 전자-멀티, 전 하 결합 소자 (EMCCD), 거울 및 dichroic 빔 스플리터 집합으로 달성 될 수 있는의 다른 부분에 지시 배출 경로에 배치. 3 차원 (3 차원) SR 이미징, 원통형 렌즈¹⁴등 광학 부품 방출 경로에 난시 효과 일으킬 필요 합니다. 따라서, homebuilt 또는 상업적으로 사용할 수 있는 통합된 현미경 이미징 방법의 각 유형에 대 한 일반적으로, 기능적으로 전문화, 고 유연에 같은 설정 다른 이미징 방법 사이 전환 하는. 여기에 우리가 현재 세 가지 다른 이미징 방법 사이 조정 하 고 재현할 수 스위치를 제공 하는 비용 효율적인, 하이브리드 시스템: 회절 제한 된 해상도, 단일 분자 검출 기반 SR 기존의 피 형광 이미징 이미징, 그리고 smFRET (그림 1A) 이미지를 포함 하 여 다 색 단일 분자 검출. 특히, 여기에 제시 된 설정 멀티 컬러 여기 입력된 레이저 섬유 커플링을 포함 하 고 있습니다 여기 경로에 상업 조명 팔 피 모드 및 사격 모드 사이 전환 하려면 여기 각도의 제어 프로그램. 배출 경로에 이동식 homebuilt 원통형 렌즈 카세트 3 차원 SR 이미징 위한 현미경 신체 내 되 고 상업 빔 스플리터는 여러 배출 채널 검색을 선택적으로 사용할 수 있는 EMCCD 카메라 앞 동시에.

프로토콜

1. 현미경 설계 및 조립

1. 여기 경로
   참고: 여기 경로 레이저, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 구성 요소, 현미경 신체와 그것의 조명 팔을 포함 됩니다.
   1. 진동 절연 광학 테이블을 준비 합니다. 예를 들어 48 x 96 x 12'의 구조적 댐핑 테이블 모든 구성 요소에 대 한 충분 한 공간을 제공합니다.
      참고: (예를 들어, 21.4 ± 0.55 ° C) 온도 제어와 방에 설정을 빌드하십시오. 온도 안정성은 광학 줄 맞춤을 유지 하기 위해 중요 합니다.
   2. 광학 섬유 연결에 대 한 조명 팔으로는 현미경 몸 설치 100 기름 침수 TIRF 목표 렌즈, 그리고 DIC 구성 요소 X는.
   3. 4 레이저 헤드 배치 (647 nm, 561 nm, 488 nm, 그리고 405 nm, 그림 1B에서 둘러싸고) 광학 테이블에 그들의 열 싱크 그리고 있는지 확인 내보낸된 레이저 광선 같은 높이 위치 (예: 좋은 안정성을 보장 하기 위해 가능한 한 짧게 3').
      참고: 경우 레이저 머리 다른 레이저 보다 짧은 높이에, 아래 적절 한 두께와 알루미늄 플레이트를 넣어. 항상 열 싱크 및 최고의 방열 (그림 1B)에 대 한 광학 테이블 사이의 최대 접촉이 되도록 합니다. 레이저는 SR 이미징 충분히 강력 할 필요가 있다. 자료의 표를 참조 하십시오. 레이저 다이오드 레이저 앞 필터를 청소 하는 것이 좋습니다.
   4. 데이터 수집 카드 주변 기기 구성 요소 상호 연결 (PCI) 인터페이스를 통해 워크스테이션에 설치 하 고이 카드와 함께 레이저를 연결 합니다. 트랜지스터-트랜지스터 논리 (TTL) 출력으로 레이저의 ON/OFF 동작 및이 카드 (그림 1C)의 아날로그 출력 그들의 전원 조정 제어 합니다. 현미경 몸 뿐만 아니라 적절 한 현미경 이미징 (상업 또는 homebuilt) 데이터 수집 카드를 제어 하는 소프트웨어를 설치 합니다.
   5. 그들의 각각 마운트를 거울과 dichroic 빔 스플리터 (590, 525, 및 긴 필터를 통과 하는 470)를 탑재 합니다. 매우 안정적인 미러 마운트를 사용 하 여 거울에 대 한. 않도록 모든 dichroic 빔 스플리터 (그림 1D)의 반지를 유지와 함께 원형 스플리터를 사용 합니다.
   6. 레이저 광선 (그림 1B)를 결합 하 여 광학 테이블에 거울과 dichroic 빔 스플리터를 놓습니다. 가장 안정 된 맞춤을 달성 하기 위해 전체 배치를, 소형 만들고 1'-두께 광 게시물을 사용 하 여. 이후 파장이 짧은 빛 발산 공중에 더 짧은 파장 레이저는 광섬유 커플링 (그림 1B)에 가까이 있도록 레이저를 정렬 합니다.
   7. 단일 모드 광섬유에 레이저 광선을 결합 합니다. 이렇게 하려면 다음 단계를 통해 케이지 시스템에서 섬유 커플러를 구축:
      1. (그림 1E, 왼쪽 패널) z 축 번역 마운트에서 섬유 어댑터 플레이트를 탑재 합니다.
      2. 무색 남자 용 상의 렌즈 마운트 (초점 거리 = 7.5 m m)는 감 금 소 접시 (그림 1E, 왼쪽에서 두 번째 패널).
      3. 확장 막대 감 금 소를 형성 하 여 위의 두 부분을 연결 합니다. 부류 1'-두꺼운 광 게시물 (그림 1E, 중간 패널)에 장착 된 광학 테이블에 케이지를 탑재 합니다.
      4. 먼저 단일 모드 광섬유 (커플러 FC/APC 끝) 647-nm 레이저를 맞춥니다.
         참고: 단일 모드 광섬유를 사용 하기 전에 멀티 모드 광섬유를 사용 하 여 거친 정렬 정렬 과정을 도울 수 있다. 무색 남자 용 상의 렌즈 (그림 1E, z 축 번역 마운트를 조정 하 여) 섬유 어댑터 플레이트 사이의 거리 뿐만 아니라 dichroic 빔 스플리터 (그림 1D, 조정 손잡이 의해), 그리고 거울의 각도 조정 얻을 섬유를 통해 최대 레이저 전원 출력입니다.
      5. 첫 번째 레이저의 맞춤 완료 되 면, 일시적으로의 쌍을 설치 하 고 하나 하나 레이저의 나머지 부분 (그림 1 층)을 정렬. 파워 미터와 맞춤 효율성을 확인 하십시오.
      6. 레이저의 반사를 줄이기 위해 어댑터 플레이트 앞 한 아이리스를 남겨 주세요.
         참고: 강력한 다시 반사 레이저 소스의 수명 줄일 수 있습니다. 선택적으로, 반사를 완전히 제거 하려면 각 레이저 머리 앞 광 아이 솔 레이 터를 설치할 수 있습니다.
   8. (그림 1 H) 현미경의 조명 팔을 광섬유의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
   9. 디자인 하 고 "확대 렌즈 (마그네틱 렌즈)" 다음 단계를 통해 설치:
      참고: 레이저는 샘플의 피 형광 이미징에 사용할 수 있지만 각 레이저의 좁은 빔 크기 제한 지역 여러 번 해당 카메라 센서의 실제 크기 보다 작은 샘플의 조명된 영역 특히 최신 (함께 대각선 길이 기존의 11.6 m m 길이에 비해 18.8 m m) 카메라. 따라서, 그것은 샘플의 크고 아첨 조명 달성 하 빔 확장 하는 것이 좋습니다.
      1. 조명 팔 (그림 1 H)에 들어갈 수 있는 탄 창 렌즈 디자인.
         참고: 매기 렌즈의 디자인 설치 됩니다 어디에 따라 달라 집니다. 레이저 광선은 조명을된 ( 토론참조) 후 어떤 자리에 설치 될 수 있습니다 하지만 그림 1 H 조명 팔에서 설치의 예를 보여줍니다. 컴퓨터 지원 설계 및 제도 소프트웨어와 함께 그것을 디자인.
      2. 장소 두 achromatic 렌즈, 한 오목 (초점 거리 f₁=), 볼록 하나 (초점 거리 f₂=) f_{1 그들의 촛점의 합계에 동등한 거리와 집에서 만든 매기 렌즈 홀더 (그림 2A 및 2 C)} + f₂ = (-25) + 50 = 25 m m (그림 2B).
         참고: 초점 길이의이 선택, 매기 렌즈 확장 빔을 f₂/ | f₁| = 2 폴드입니다. 매기 렌즈 다양성을 제공합니다. 그것은 일반 조명 광선 (그림 2D)를 확대 하지 않고 다시 시작을 제거 하거나 강한 자극 강도 달성 하기 위해 레이저 광선을 초점을 반대 방향으로 삽입 될 수 있습니다.

2. 배출 경로

참고: 배출 경로 이동식 원통형 렌즈, 배리어 필터 휠, 방출 스플리터, 그리고 EMCCD 카메라 (그림 1G)의 구성 됩니다. 최고의 포인트를 달성 하기 위해 단일 분자의 기능 (PSF) 확산, DIC 프리즘은 대물 렌즈에서.

1. 사용자 정의 디자인 수동 DIC 분석기에 들어갈 수 있는 원통형 렌즈 (3 차원 렌즈) 카세트 현미경 몸 (그림 3C)에 슬롯을 삽입 합니다.
   참고:이 디자인 분석기 블록 필터 포 탑에 삽입할 수 있습니다 이후 DIC 분석기를 타협은 하지.
2. 카세트에 초점 거리의 10 m의 3 차원 렌즈를 놓고 모든 단일 분자¹⁴의 z 좌표를 추출 하는 데 필요한 난시 효과 만드는 방출 빔 경로에 삽입 합니다.
   참고: 필요에 따라 3 차원 렌즈 카세트 놓일 수 있다 또는 방출 경로 (그림 3C).
3. 현미경 신체 내부 필터 포 탑에서 멀티 밴드 dichroic 빔 스플리터를 설치 합니다.
4. 배기 필터를 설치 합니다.
   참고: 방출 필터 기본 fluorophores에 따라 선택 됩니다. 이미징 모듈에 따라 다른 위치에 배치 하는 방출 필터는 아래 설명 된 대로 사용 됩니다.
   1. 순차적 멀티 컬러 피-형광 이미징 또는 SR 이미징, 채널 스위치 (그림 1G) 동안 현미경 신체에 진동을 최소화 하기 위해 현미경 시체 옆 연결 배리어 필터 휠에 방출 필터를 사용 합니다.
   2. 동시 멀티 검색 (예를 들어, smFRET 실험), 방출 스플리터 (확인 단계 4 자세한)에 설정 하는 다른 필터를 배치 합니다.
      참고: 일반적으로, 상업적인 방출 스플리터는 두 전환 모드 (즉, "약혼" 또는 "무시" 모드). 2 색 성 빔 스플리터 및 3 개의 방출 필터 필터 큐브 chromatically 동시 멀티 컬러 이미징 ("약혼된" 모드)에 대 한 방출 빛을 분리 하는 ("트리플 큐브," 그림 4C 와 4d). 배리어 필터 휠에 빈 슬롯 트리플 큐브와 함께에서 사용 됩니다. 다른 한편으로, 순차적 멀티 컬러 이미징, 트리플 큐브 ("우회 큐브," 그림 4A 와 4 D) 내부 거울은 큐브도 바뀝니다.
5. 배출 경로의 마지막 부분으로 EMCCD 카메라를 설치 합니다. 빠른 프레임 속도 달성 하기 위해 USB PCI 연결을 활용 합니다.
   참고: EMCCD 카메라는 가장 중요 한 단일 분자 검출을 위한 좋지만 고급 sCMOS 카메라 대안이 될 수 있습니다.

3. 회절 제한 피 여기 이미징

1. 피-모드 조명 팔에서을 여기 레이저 부수적 각도 조정 합니다.
2. (그림 3C, 오른쪽 패널) 종사 하는 경우 3 차원 렌즈를 분리 합니다.
3. 우회 큐브 방출 스플리터 (그림 4A 및 4E, 하단 패널)에 삽입 합니다.
4. (선택 사항) 확대 조명 영역 (그림 2D, 왼쪽된 패널)에 대 한 매기 렌즈를 삽입 합니다.
   참고: 매기 렌즈와 기름 침수 렌즈 X 100의 사용, 약 91 x 91 µ m² 수 수 조명 균등 하 게, 백색 광원을 사용 하 여 여러 필터 큐브 필요가 없습니다.
5. 시간 경과 이미지 및/또는 Z-스택, 현미경 이미징 소프트웨어 멀티 채널을 사용 합니다.
   참고: 여러 프로그램이 있다 현미경 이미징, 현미경 제조 업체에서 뿐만 아니라 제 3 자 회사 또는 오픈 소스 개발자에서 사용할 수 있습니다.

4. 멀티 채널 단일 분자 이미징 등 smFRET

참고: 어떤 파장을 가진 모든 방출 방출 스플리터에 필터/dichroic 빔 스플리터의 두 번째 집합에 도달할 수 있도록 배리어 필터 바퀴에서 "빈" 위치로 이동 합니다.

1. 다 색을 설정 하려면 표면 움직일 분자¹⁵ TIRF 여기, smFRET 측정을 포함 하 여를 사용 하 여 단일 분자 검출 여기 레이저 부수적 각도 TIRF 각도를 조정 합니다. 매기 렌즈와 3 차원 렌즈를 분리 합니다.
2. 다음 단계를 통해 방출 스플리터 (그림 1G)에 참여 3 채널 모드:
   1. "교정 큐브"와 바이패스 큐브 교체 빛 (그림 4B 와 4E) 모든 채널을 통해 갈 수 있는.
   2. DIC (즉, 배리어 필터 휠에 방출 필터)에서 카메라를 켭니다 하 고 3 개의 완전히 분리 된 채널 화면에 나타날 때까지 방출 스플리터의 조리개를 조정 합니다.
      참고: 모든 채널을 시각화 하는 점등 방 빛와이 단계를 수행 합니다.
   3. 수직/수평 조정 제어 손잡이 방출 분배기 설정와 약 3 채널 (그림 4E 및 4F)를 맞춥니다.
   4. 카메라를 끄고 트리플 큐브 (그림 4C , 4E) 교정 큐브를 바꿉니다.
   5. 샘플에 X 렌즈와 초점 100 위에 100 nm 멀티 채널 구슬과 샘플을 놓습니다.
   6. 카메라 및 488 nm 레이저, 밝은 구슬 중에 확대 하 고 정밀 하 게 조정 제어 손잡이 다시 (그림 4E 및 4 G)를 설정 하 여 3 개의 채널을 정렬.
      참고: 100 nm 멀티 채널 구슬 3 채널 정렬 있도록 488 nm 여기에 빛의 다른 파장을 방출 한다.
3. 카메라와 레이저, 포커스를 설정 하 고 합리적인 현장 밀도와 좋은 위치를 찾을. 허용 신호-잡음 및 photobleaching 수준을 달성 하기 위해 레이저 전원 및 노출 시간을 조정 합니다. 현미경 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 시간 경과 이미지를 데리고.

5. SR 이미징

참고:이 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 검사 법입니다.

1. 명함 이미지를 설정 하려면, 3 차원 렌즈를 삽입 하 고 매기 렌즈를 제거 합니다. 적절 한 레이저 채널 (예를 들어, 5-60 ms)에서 카메라의 노출 시간을 설정 합니다. 확인 하 고 수동으로 TIRF 각도 되도록 최적의 여기 레이저 부수적 각도 설정 합니다.
2. SR 버퍼¹⁶이미징에 샘플을 놓습니다. 버퍼 이미징 하기 전에 적어도 10 분 동안 equilibrate를 허용 한다.
   참고: SR 이미징 버퍼 약 1 시간 후에 만료 됩니다, 그리고 그래서 새로운 SR 따라 버퍼 이미징.
3. SR 영상 전에 DIC 이미지를 가져가 라. SR, 난시 효과 최적화를 위한 적절 한 객관적인 높이 찾기 위해 DIC 이미징 셀의 중간 비행기를 찾을 수를 사용 합니다. 높이는 셀 "어두운" 이미지를 "빛"에서 전환 하 고 투명 하 게 표시 하 여 비행기를 식별 (그림 5A, 5B, 5c). 원하는 초점 비행기 결정 되 면 z 드리프트 보정 시스템 (그림 1A)를 갖습니다.
4. 명함 이미지를 수행 합니다. ' 깜박이-에 ' 관광 명소의 적당 한 밀도 유지 하기 위해 405 nm 레이저 전원을 변경 합니다.
   참고: 405 nm 레이저를 수동으로 변경할 수 있지만, 그것은 더 편리 "점멸-에" 관광 명소의 밀도 유지 하기 위해 프로그램된 데이터 수집 코드 실행. 여기에 어떻게 그것 자동으로 실시의 예가입니다. 소스 코드는 요청 (그림 6).
   1. 0 W/c m² 바이올렛 레이저 파워와 이미지 수집을 시작 합니다.
   2. 특정 기간에 깜박임에 관광 명소의 수를 계산.
   3. 깜박임에 반점의 수는 사용자 정의 "카운트 임계값" 보기의 필드 위에 유지 되도록 바이올렛 레이저 파워를 조절. 깜박임에 반점의 수 카운트 임계값 미만으로 떨어지면 바이올렛 레이저 파워를 증가.
   4. 깜박임에 반점의 수 최대 바이올렛 레이저 파워를 사용 하 여 카운트 임계값 미만으로 떨어지면 인수를 종료 합니다.
      참고: 샘플 밝기에 따라 다르게 설정 하지만 130 W/c m²보다 작은 최대가 될 수 있습니다. SR 이미징의 실제 목표에 따라이 자동 수집 코드 수동으로 원하는 언제 든 지 종료 될 수 있습니다.
5. 인수를 시작 후 곧 점멸 동작과 PSFs의 관광 명소를 확인 합니다.
   참고: 깜박이 동작 하지 않으면 이상적인, 여기 레이저 부수적 각도 변경 하거나 대체 이미징 버퍼. "수직", "수평"와 "다이아몬드" 모양의 PSF, 대표 fluorophores 아래에서 위에, 초점 비행기 내에서 각각 (그림 5D)의 샘플링을 기대 합니다. 대부분 관광 명소는 수직 또는 수평 PSFs를 보여주면 다음 초점면 꺼져 세포의 센터에서 그래서 실험을 종료 하 고 초점 비행기를 다시 조정. 석유를 대체 하거나 샘플의 다른 이미지 영역을 변경 하는 일을 해야 할 수도 있습니다 그래서 침수 기름 또는 다른 로컬 요소에서 공기 방울이 존재 PSFs의 품질, 달라질 수 있습니다.
6. 데이터 분석에 대 한 각 영상 프레임에 각 명소의 중심을 감지 하 여 x 및 y 너비¹⁴에서 각 명소의 z 값을 추출 (NIH ImageJ 플러그인)에서 오픈 소스 또는 상업적으로 사용할 수 있는 코드를 사용 합니다.
   참고:이 보고서에서 원래 초기 단일 분자 검출 기반 SR⁸ 중에서 개발한 소스 코드 3 차원 탐지¹⁶ 에 대 한 수정 그리고 사용 되었다.
7. 2 색 이미지의 경우 더 이상 여기 파장, 단파장 여기 한 다음 fluorophore 이미지. 마찬가지로 단계 5.4, 하지만 다른 이미징 레이저를 설명 하는 것 자동된 수집 코드를 실행 합니다.
   참고: 다른 fluorophores (예를 들어, 붉은 염료와 노란색-녹색 염료)와 이미지 사이 색수차 수정 한다. 여기 스텝이 있다.
   1. 클러스터 형성을 피하고 유리 coverslip에 여러 100 nm 멀티 채널 구슬 무력화
   2. 다른 여기 채널에 그들의 이미지를 가져가 라.
   3. 소프트웨어 (5.6 단계)에 의해 그들의 (X, Y, Z) 좌표 추출 물.
   4. Δ X_나 플롯 X =_1i -_2i 와 δ Y_i X = Y_1i -Y_2i (내가 다른 구슬, 이며 1와 2는 다른 색상 채널) 별도로 적절 한 기능을 가진 그들을 맞는. 함수를 저장 합니다.
      참고: 선형 함수는 대부분의 경우에서 충분 합니다. 이 함수를 확인 하는이 측정은 화상의 각 시간 반복 될 필요가 없습니다.
   5. 관심의 샘플의 실제 2-컬러 명함 이미징, (X, Y) 올바른 색수차 기능 적용 됩니다. Z-방향 색수차에 대 한 ΔZ를 취득 하 여 실시 = Z₁ -Z₂ 에 멀티 채널 구슬 또는 알려진된 기준 멀티 채널 샘플의 샘플 함께 시드.
      참고: (X, Y)와 달리 색수차, z-방향 색수차 채널 전환 시 불완전 한 z-방향 초점 유지 보수로 인해 주로 각 실험에서 잘 재현 되지 않습니다. 따라서, 각 시간 보정을 수행 하는 것이 좋습니다. ΔZ = Z₁ -Z₂ 는 주로 독립의 (X, Y), 그래서 그냥 몇 가지 구슬 또는 참조 샘플 각 샘플 지역 당 충분 한 것. 3 차원 시각화 소프트웨어에 생성 된 최종 2 컬러 명함 이미지를 플롯 하 고 ΔZ를 수동으로 확인 합니다.

결과

이 현미경에는 유연 하 고 다른 이미징 방법 전환 재현할 수 있습니다. 여기 우리가 각 영상 모듈와 수집 된 샘플 이미지를 보여줍니다.

그림 5D 는 SR 중 깜박이에 분자의 PSF를 보여 줍니다. 같은 이미지의 수천은 최종 명함 이미지 (그림 5E)를 생성 하 재건. 그림 5E

토론

이 하이브리드 현미경 시스템 여러 현미경을 구입할 필요가 없습니다. 광학 테이블, 테이블 설치 노동, 소프트웨어 및 워크스테이션을 포함 한 모든 부분에 대 한 비용 총 약 230000 달러 이다. 사용자 정의 가공 부품, 매기 렌즈 등 3 차원 렌즈 비용 약 $700 (비용은 다른 기관에서 실제 비용에 따라 달라 집니다). 전형적인 상용 통합 시스템 위한 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 비용 이상의 $300000 ~ 400000...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E microscope stand	Nikon	Ti-E
Objective lens	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M	This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block	Nikon	Ti-A	This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system	Nikon	PFS	This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top	TMC	783-655-02R
Optical table bases	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink	Cobolt	11658 (HS-03)	Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink	Coherent	1193289	Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable	L-com	CC58C-6	RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter	L-com	BA1087	Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optical Filter Changer
Emission Splitter	Cairn	OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter	Chroma	ET700/75M	Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET595/50M	Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET525/50M	Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set	Chroma	49000	installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 long pass filter	Chroma	T590LPXR-UF1	for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter	Chroma	T525LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter	Chroma	T470LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647)	Chroma	zet640/20x	for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488)	Semrock	LL01-488-25	for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source	Excelitas	X-Cite120LED	used only for DAPI imaging
Mirror mount	Newport	SU100-F3K
Optical posts	Newport	PS-2
Clamping fork	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring	Thorlabs	CMRR	used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount	Thorlabs	SM1Z	Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible
Achromatic Doublet lens	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm
Cage Plate	Thorlabs	CP1TM09	30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap
Cage Assembly Rod	Thorlabs	ER4	Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm
Cage Mounting Bracket	Thorlabs	CP02B	30 mm Cage Mounting Bracket
Single mode optical fiber	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multi mode optical fiber	Thorlabs	M42L01	Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens"
Achromatic Doublet lens (mag lens)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens"
Retaining ring	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens"
Nylon-tipped screw	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens"
3D lens	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, rectangular cylindrical lens
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 888
100 nm multichannel beads	Thermo	T7279, TetraSpeck microspheres
red dye	Thermo	Alexa Fluor 647
yellow-green dye	GE Healthcare	Cy3
green dye	GE Healthcare	Cy3B
blue dye	Thermo	Alexa Fluor 488