نموذج الفئران من اللاصق من على الكتف

Summary

ويقدم هذا البروتوكول نموذج الفئران في فيفو من اللاصق. ويشمل النموذج تثبيت داخلي من جلينوهوميرال المشترك مع التثبيت خياطة خارج المفصلي لتمديد وقت، أسفر عن مجموعة تناوب انخفاض الحركة (ROM) وزيادة صلابة مشتركة.

Abstract

ويهدف هذا الاقتراح لإنشاء نموذج الفئران في فيفو من اللاصق للبحث عن خيارات العلاج المحتملة لهذا الشرط ومسببات أخرى من أرثروفيبروسيس قابلة للمقارنة. ويشمل النموذج التثبيت خارج مفصلي الكتف في الفئران عن طريق المنكب على خياطة عضدي، أدى انكماش ثانوي دون غزو الفضاء داخل المفصل، ومما أدى إلى تناقص ROM التناوب والمشترك زيادة صلابة.

ونحن تستخدم الفئران سبراغ داولي 10 أغراض هذه الدراسة. أخذ القياسات ROM الأساس قبل تجميد جلينوهوميرال. الفئران تعرضوا لمدة 8 أسابيع للتثبيت قبل إزالة خيوط التثبيت وتم تقييم التغييرات في ROM وتيبس المفاصل. لتقييم ما إذا كان التثبيت أدت إلى انخفاض كبير في ROM، حسبت التغييرات في علم الحركة. وتم قياس في كل نقطة الوقت في فترة المتابعة ROM وتمت مقارنة بخط الأساس القياسات ROM الداخلية والخارجية. من أجل تقييم صلابة، وحركية مشتركة حسبت بتحديد الاختلافات في عزم الدوران (t_ext وتي_int ) اللازمة للوصول إلى تناوب 60 ° الأولية الخارجية والداخلية التناوب الأولى من 80 درجة.

بعد إزالة تثبيت خياطة خارج مفصلي في متابعة اليوم 0، وجدنا انخفاض نسبة 63 في المائة في مجموع مدمج بالمقارنة مع خط الأساس. لاحظنا التحسن المستمر حتى الأسبوع 5 للمتابعة، مع التقدم تباطؤ حول تقييد 19%. في الأسبوع 8 للمتابعة، كان لا يزال هناك قيداً 18% من "rom. وبالإضافة إلى ذلك"، في متابعة اليوم 0، وجدنا عزم الدوران بنسبة 13.3 نم عند مقارنة بخط الأساس. في الأسبوع 8، وتم قياس عزم الدوران الإجمالي أن 1.4 ± 0.2 نم أعلى من القياسات الأولية. ويدخل هذا العمل نموذج الفئران من الكتف اللاصق مع دائم ROM انخفاض وزيادة صلابة.

Introduction

اللاصق من على الكتف وكثيراً ما يشار إلى تجميد الكتف أو تقفع الكتف. ويتميز جلينوهوميرال تقييد الحركة والألم، ويفترض أنها نتيجة التليف المتقدم وانكماش المشتركة^1،،من²³. الشرط ينطوي على تعيين الخلية تنتجها الخلايا الليفية واروميه مع مصفوفة الكولاجين كثيفة الناتجة (أنواع الأول والثالث) في كبسولة مشتركة^2،3. وهناك العديد من عوامل الخطر المحتملة لتطوير انكماش مشتركة، بما في ذلك الجنس ومرض البول السكري، وفرط، والإصابات الرضية وتجميد طويلة^4،،من⁵⁶.

تفتقر إلى خيارات العلاج الفعال ومعظمها يشمل العلاج الطبيعي، مع التدخل في شكل الإفراج عن العمليات الجراحية في الحالات القصوى التي لم تتحسن مع الرعاية المحافظين. أن أسلوب العلاج بأفضل ما زال غير محدد وكانت موضع اهتمام كبير لسنوات في المجال الطبي^7،8. تطوير خيارات علاجية جديدة يتطلب نموذج قابل لإعادة الإنتاج الحيواني للشرط الذي لا يعتمد على الصدمة المستحثة داخل المفصل. ينبغي أن يشمل النموذج الأمثل اللاصق اثنين من الخصائص الرئيسية لهذا المرض: انكماش الكبسولة الكتف وتخفيض فترات طويلة في نطاق الحركة (ROM). شولميير et al. ⁹ وصف واحد من النماذج تقفع المشتركة الأولى باستخدام المدلى بها لتطوير انكماش الكتف في الأنياب. وأفادوا أيضا أن التغيرات في الضغط داخل المفصل ومدمج عادت إلى مستوياتها العادية بعد وقف تجميد⁹. بيد أن قيداً هاما المذكورة في الدراسة هو التباين في موقف أطرافهم بين الحيوانات بسبب استخدام تقنية المدلى بها. للحصول على نموذج أكثر استنساخه، كانو et al. بعد ذلك قدم ¹⁰ نموذج الفئران اللاصق باستخدام التثبيت الداخلية جامدة من الكتف. ومع ذلك، على الرغم من أنها حققت انخفاضا كبيرا في ROM مع نموذجهم، أنهم لم تذكر ما إذا كانت هذه التغييرات مؤقتة أو طويلة الأمد. وكان هدف دراستنا لخلق مناسبة في فيفو كتف انكماش الفئران نموذج التحقيق أثر التثبيت المشترك جلينوهوميرال مفصلي خارج فترات طويلة على ROM وتيبس المفاصل.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في بيت إسرائيل ديكونيس الطبي. وكان الحرص على تجنب التخدير فترات طويلة لا داعي لها، وأيضا لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. مرجح في كل دورة قياس ROM الحيوانات وترصد لفقدان الوزن.

1-دراسة الموضوعات

1. استخدام الفئران سبراغ داولي 10 أسابيع 13 من العمر في ذلك الوقت لعملية جراحية، والتي تتراوح بين 250-300 غرام وزن الجسم.

2-الجراحة

1. تحت التخدير وقبل التثبيت الجراحي، قياس عزم الدوران الأساس كدالة لزاوية الدوران بين 60 التناوب الخارجي و 80 درجة الاستدارة الداخلية (راجع الخطوة 5).
2. التخدير مع إيسوفلوراني 5% عن طريق الاستنشاق في دائرة التعريفي لحمل، وإدامة ثم مع إيسوفلوراني 2% من خلال مخروط الآنف طوال عملية جراحية.
   1. استخدم عنصر تسخين المياه على أساس تحت الحيوان للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء التخدير.
   2. غرض السيطرة على الألم، إدارة الإفراج المستدام البوبرينورفين تحت الجلد عند جرعة قدرها 1.2 ملغ/كغ تبعاً لوزن الجسم في الفئران.
3. المفاصل إيموبيليزي جلينوهوميرال اليسرى بزاوية 60 درجة من الاختطاف (الزاوية بين رمح عضدي والعمود الفقري المنكب)^{10 , 11}-
   1. بدء العملية الجراحية مع شق طولي الخلفي، وبالتوازي مع رمح عضدي. جعل شق الجلد فقط دون جلينوهوميرال المشتركة وتمتد لحوالي 3 سم.
   2. استخدام خيوط 2 (البوليستر مجدول) إلى شل المشتركة جلينوهوميرال، بثقب عبر الحافة الجانبية للكتف وحوالي ثلثي رمح عضدي البعيدة، وتشديد في وقت لاحق كما هو موضح في الشكل 1A. تتخذ مزيدا من الجهد لتجنب تقيد الهياكل الحيوية مثل شريان عضدي.
      ملاحظة: تقنية جراحية له ميزة كونها قادرة على الحد المشترك جلينوهوميرال في 60° الاختطاف (Z) دون التأثير على خطط أخرى (X و Y). عن طريق وضع خيوط حول عظم العضد ومن خلال الحدود الجانبية للكتف، حققت تقريبي للبنيتين والإبقاء على الطائرة بليد المنكب. بعد تشديد خياطة الجروح، الذراع هو ثابتة في موقف يستريح عند النظر في طائرات X و Y وفي 60° لاختطاف عندما يعتبر الطائرة Z. ويعتقد هذا الحد من تقلب بين الحيوانات التي قد تنشأ من عدم ضبط الموقف المشترك في هذه الخطط الثلاث.

3-إغلاق شق

1. بعد الأرقاء السليم، إغلاق شق الجلد باستخدام قصاصات الجلد.
2. وقف التخدير، والسماح للحيوان لاسترداد تحت إشراف في بيئة دافئة. بعد الحيوان يستعيد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية، العودة إلى قفصة.
3. مباشرة بعد هذا الإجراء، السماح للحيوانات بالعودة إلى النشاط العادي. تسمح للحيوانات التحرك دون قيود، تعتمد أساسا على خيوط داخلية لإصلاح المشترك جلينوهوميرال.
4. لمراقبة العدوى المحتملة، تفتيش المواقع شق يوميا خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة.
5. إزالة مقاطع الجرح في اليوم^ال 10 بعد الجراحة.
   ملاحظة: كان هناك لا تلاعب العضلات أثناء الإجراء، والأسلوب الذي لا ينطوي على أي صدمة داخل المفصل، ومن ثم الحفاظ على استمرارية الحافظة ومفصلي وسلامة التشريحية. وتلت لا الحد وكبح جماح لا النشاط الخارجي في لدينا بروتوكول.
6. توفير الحقن تحت الجلد بجرعة 1.2 ملغ/كغ، بدءاً من تحريض التخدير التسكين استخدام البوبرينورفين الإفراج المستدام، وتتكرر كل ح 72 إذا لزم الأمر.

4-خياطة إزالة 8 أسابيع بعد التثبيت

1. التخدير مع إيسوفلوراني 5% عن طريق الاستنشاق في دائرة التعريفي لحمل، ثم يستمر مع إيسوفلوراني 2% من خلال مخروط الآنف طوال عملية جراحية. غرض السيطرة على الألم، إدارة الإفراج المستدام البوبرينورفين تحت الجلد عند جرعة قدرها 1.2 ملغ/كغ تبعاً لوزن الجسم في الفئران.
2. جعل شق على رأس الندبة من الإجراء السابق.
3. قص خياطة الجروح وإزالة من عظم العضد والكتف.
4. إغلاق الشق مع مقاطع الجرح.
5. بحث في موقع شق يوميا خلال الأسبوع الأول للكشف عن أي علامات للعدوى. رصد الألم والحزن كذلك.
6. إزالة مقاطع الجرح في اليوم^ال 10 بعد الجراحة.

5-مجموعة من الحركة وتيبس المفاصل القياسات

1. قياس ميكانيكا الكتف ROM وسلبية قبل وبعد التثبيت باستخدام جهاز مخصص يتألف المشبك ذراع، وجمعية استشعار ومحور العجلة التمحور¹¹. وهذا يتم بريوبيراتيفيلي (خط الأساس) ومستمر بعد إزالة خياطة.
   1. مقياس مدمج مباشرة بعد إزالة خياطة (يوم المتابعة 0)، وبعد ذلك مرتين في أسبوع.
   2. خفض القياسات مرة واحدة أسبوعيا، تغيير عند تسجيل أقل من 10% من هذه النقطة الزمنية السابقة.
      ملاحظة: بعد إجراء اختبار ROM لأسابيع، جمهورية الجبل الأسود كل حيوان لم تتغير جذريا بين اختبار النقاط الزمنية (تغيير أقل من 10%). جمهورية الجبل الأسود على ما يبدو الهضبة عند هذه النقطة، ولذلك شعرنا أنه يكفي تقليل تكرار الاختبار من مرتين في أسبوع إلى مرة واحدة في أسبوع.
2. القيام بقياسات تحت التخدير استخدام isoflurane عبر المبخر الدقة في 5% لتحريض و 2% للصيانة لكامل طول الداخلي (حوالي 5 دقائق)، تيسيرا لقياس كفاءة. استخدم عنصر تسخين المياه على أساس تحت الحيوان للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء التخدير.
3. موقف الحيوان بشكل صحيح لقياس مدمج مع المعونة من دليل الليزر. موقف فوريليمب على ذراع المشبك في الانحناء إلى الأمام 90 درجة، مع المحور الاستشعار محاذي للمحور الطويل لعظم العضد. تأمين فوريليمب من المعصم والكوع كما هو موضح في الشكل 1 باء.
4. التحكم بالتناوب فوريليمب السلبي بمحرك السائر تقييم مدمج وعزم الدوران بطريقة متسقة. التحكم في المحرك السائر مع متحكم. استخدام مدخلات من الميل، بالتزامن مع تلك من جهاز استشعار عزم للإشارة إلى بداية ونهاية للقياسات.
5. قم بتوصيل متحكم دقيق إلى الكمبيوتر والتحكم باستخدام رمز MATLAB نمواً داخليا.
6. لقياسات أساسية فقط، دورة الجمعية العامة استشعار 3 مرات بين 60 التناوب الخارجي و 80 درجة الاستدارة الداخلية للحصول على قياسات العزم الأولية (الخارجية: t_ext والداخلية: تي_int) للمقارنة فيما بعد.
7. لقياسات ROM، استخدام قيم عزم كل الحيوانات في قياسات خط الأساس الخاصة بها (t_ext وتي_int) كمتغيرات الإدخال مسبقاً في البرنامج للكشف عن التغييرات في تناوب "استخدام rom." قياسات أساسية كمقارنة وقف نقطة للقياسات ROM اللاحقة. تم الكشف عن التغييرات مع قرار 0.2°.
8. لقياسات صلابة، استخدام زوايا التناوب الأصلي 60° التناوب الخارجية والداخلية التناوب 80 درجة كمدخل مسبقاً في البرنامج من أجل الكشف عن التغييرات في عزم الدوران. تم الكشف عن التغييرات بدقة 0.01 نم.
9. وزن الحيوانات في اليوم نفسه ككل تقييم ROM. ضع الحيوانات في جداول وسجل بها الجماهير. واستخدمت هذه البيانات كواحدة من الأدوات لتقييم الوضع الصحي للحيوان أثناء الدراسة.
10. في أعقاب الانتعاش، تعود الفئران إلى اقفاصها ورصد لعلامات الألم أو المعاناة. في جميع أنحاء هذا الاختبار، تركت لا الحيوان دون حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
    ملاحظة: قياسات مدمج وعزم الدوران تحققت مع جهاز مخصص، ذكرت سابقا بمجموعتنا {فيلا-كاماتشو 2015}. الجهاز هو رقصة مصنوعة خصيصا يتكون من رمح تدويرها بواسطة السائر موتور والتحكم بواسطة MATLAB برنامج نصي مخصص. تستخدم وحدة قياس القصور الذاتي وعزم الدوران استشعار التقاط عزم الدوران وقم بوضع البيانات أثناء صياغة للعينة.

6-بعد الوفاة إيمونوهيستولوجيك التحليل

1. في نهاية فترة 8 أسابيع ROM القياس، euthanize الفئران مع التعرض₂ CO.
2. تشريح كلا اليسار (معطلة) والحق الكتفين (مراقبة صحية) ديسارتيكولاتينج عظم العضد من الزند، وتقطيع الكتف من الترقوة وتجويف الصدر.
3. إصلاح الكتفين قصت في حل من 10% فورمالين مخزنة محايدة لمدة 3 أيام، تليها ديكالسيفيكيشن في إيجاد حل للإيثيلين حمض (يدتا) 10% على درجة الحموضة 7.4 لآخر شهرين.
4. أثناء هذه العملية، وضع العينات على شاكر دورة الانفعالات لطيف وتخزينها في 4 درجات مئوية. رصد ديكالسيفيكيشن جلينوهوميرال المشترك مع أسبوعية ميكروكومبوتيد التصوير المقطعي (uCT) مسح.
   ملاحظة: يدتا هو عامل شيلاتينغ التي تربط أيونات الكالسيوم من البلورة الاباتيت السطح الخارجي، الحد تدريجيا من كريستال حجم^12،،من¹³¹⁴. هذه العملية بطيئة للغاية ولطيف، ويتم استخدامه للكشف عن عناصر محددة من الأنسجة التي يجب الحفاظ عليها لتقنيات مثل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة). المعدل الذي ديكالسيفيس يدتا العينة اعتماداً على درجة الحموضة وتركيز للحل. من حيث درجة الحموضة، تتراوح من 7 إلى 7-4، مع حلول أكثر قلوية التعجيل بسرعة ديكالسيفيكيشن. ومع ذلك، يمكن أن تلحق الضرر الحلول مع أعلى مستويات الحموضة العناصر الرئيسية الأنسجة. وباﻹضافة إلى ذلك، تركيز يدتا المعتادة لمثل هذه التجارب يكمن بين 10 في المائة إلى 14 في المائة، ولكن من المهم جداً أن نتذكر أن يصبح استنفاد عامل نشط مرة واحدة من السندات للكالسيوم، حيث يتطلب هذا استبدال السائل ديكالسيفيكيشن على الأقل من 3 إلى 4 مرات كل أسبوع¹⁵.
5. متى تم إبرام عملية ديكالسيفيكيشن، جبل جلينوهوميرال المفاصل في أكوام البارافين لتقطيع غذائها. توجيه العينات للسماح للشرائح الاكليلية. الشرائح التي تم الحصول عليها على عمق 50% من الرأس عضدي (مركز، ومنتصف-التاج) ويرد في الشكل 1. أداء المناعي تلطيخ استخدام أسلوب البيروكسيديز-مكافحة-البيروكسيديز للدلالة على وجود أنسجة تليفية في المشترك. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. إجراء استرداد مستضد باشعاع الموجات الدقيقة بغمر الشرائح في جرة كوبلين بلاستيك في حل المخزن مؤقت سترات الصوديوم (سترات الصوديوم 10 ملم، 0.05% 20 توين، pH 6.0، يسخن لمدة 5 دقائق في 95 – 100 درجة مئوية) ووضع في فرن ميكروويف عادية لمدة 10 دقائق في المتوسط من السلطة. السماح للشرائح لتبرد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. تنفيذ حظر مع مصل الماعز لمدة 30 دقيقة، واحتضان العينات مع ماوس أساسي أحادية الاستنساخ جسم (تخفيف 1: 400) إلى فيبرونيكتين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
8. بعد الحضانة مع جسم الأولية، غسل العينات مرتين مع برنامج تلفزيوني (0.5 ميكروغرام/مل) لمدة 10 دقائق؛ واحتضان مع جسم ثانوية، الماعز أنتيموسي IgG-البيروكسيديز المتقارن (تخفيف 1: 400) لمدة 30 دقيقة.
9. تغسل العينات مرتين مع برنامج تلفزيوني (2.5 ميكروغرام/مل) في شاكر لمدة 10 دقائق، وفضح إلى 3,30-ديامينوبينزيديني تيتراهيدرو-كلوريد و 30% بيروكسيد الهيدروجين في الظلام لأدنى 10 كونتيرستين مع الهيماتوكسيلين كرزي.

النتائج

نطاق الحركة

0 يوم المتابعة، وجدنا انخفاض نسبة 63 في المائة في مجموع مدمج بالمقارنة مع خط الأساس (ف <.001. لاحظنا تحسن تدريجي لجمهورية الجبل الأسود حتى الأسبوع 5 للمتابعة، عندما توقف التقدم في تقييد 19% (ف < 0.001). القيود المتبقية، 18% من مجموع مدمج، كا...

Discussion

تقدم هذه الدراسة نموذج الفئران من اللاصق من الكتف من خلال التثبيت الداخلي المشترك جلينوهوميرال. وعلاوة على ذلك، فإنه يظهر إلى تخفيض مجموع ROM موسعة لمدة 8 أسابيع على الأقل بعد إزالة تثبيت البرنامج. ولحساب التعديلات في ROM في نقاط زمنية مختلفة، تم مقارنة القياسات الحيوان خطوط محددة. وفي المقا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus