어깨의 접착성 Capsulitis의 쥐 모델

요약

이 프로토콜에는 vivo에서 쥐의 모델을 접착성 capsulitis 선물 한다. 모델 모션 (ROM)와 증가 관절 경직의 감소 회전 범위에 오랜된 시간 동안 여분 관절 봉합 고정으로 갑 공동의 내부 고정 포함 되어 있습니다.

초록

이 제안은 vivo에서 쥐 모델 연구이 상태와 유사한 arthrofibrosis의 다른 etiologies에 대 한 잠재적인 치료 옵션에 대 한 접착성 capsulitis의 생성을 목표로 한다. 모델 포함 어깨의 여분 관절 고정 상 박 골의 봉합에 스카풀라를 통해 쥐에서 관절 내부 공간을 침입 하 고 감소 회전 ROM과 증가 관절에 발생 하지 않고 보조 contracture 결과 강성입니다.

우리 10 Sprague-Dawley 쥐가이 연구 목적으로 사용합니다. 기본 ROM 측정 자동 동원 정지 하기 전에 찍은 사진. 고정 봉합을 제거 했다 고 평가 했다 ROM과 관절 경직에 변화 하기 전에 쥐 동원 정지의 8 주를 받게 했다. ROM에 있는 뜻깊은 감소 귀착되 었 다 동원 정지 여부를 평가 하려면 운동학에 변화 계산 했다. ROM 후속 기간에 각 시간 지점에서 측정 되었다와 기준선 내부 및 외부 ROM 측정에 비해 했다. 강성, 공동 활동을 평가 하기 위해 60 °의 초기 외부 회전 및 80 °의 초기 내부 회전에 도달 하는 데 필요한 토크 (t_ext 와 t_int )의 차이 확인 하 여 계산 했다.

후속 주 0에 있는 여분 관절 봉합 고정 제거 후 우리는 총 ROM 기준에 비해 63% 감소를 발견. 19% 제한 주위를 늦추고 진행과 함께 후속, 5 주까지 지속적인 개선을 관찰 합니다. 속 행의 8 주에 아직도 후속 날 0 rom에 있습니다. 또한,의 18% 제한, 우리 13.3 Nmm 기준선에 비교 될 때 증가 하는 토크를 발견. 8 주, 총 토크는 1.4 ± 0.2 측정 되었다 Nmm 초기 측정 보다 높은. 이 작품의 지속적인 감소 ROM과 외경으로 어깨 접착성 capsulitis 쥐 모델을 소개 합니다.

서문

어깨의 접착성 capsulitis는 자주 언된 어깨 또는 어깨 contracture 라고 합니다. 그것은 아마도 결과로 고급 섬유 증 및 공동 contracture^1,2,3통증과 제한 자동 모션 특징 이다. 조건이 공동 캡슐^2,3(유형 I 및 III) 결과 조밀한 콜라겐 매트릭스와 섬유 및 myofibroblast 셀 채용을 포함 한다. 성별, 당뇨병 mellitus, 갑 상선, 외상 성 부상, 및 머리말 붙인된 동원 정지^4,,56을 포함 하 여 공동 contracture 개발을 위한 많은 가능한 위험 요인이 있다.

효과적인 치료 옵션 부족 하 고 주로 보수적인 치료와 개선 되지 않고 있다 극단적인 경우에 외과 릴리스의 형태로 개입으로 물리 치료를 포함 합니다. 가장 좋은 치료 방법은 불확 실한 남아 있고 의료 분야^7,8년 큰 관심의 대상이 되었습니다. 새로운 치료 옵션의 개발 내부 관절 유발된 외상에 의존 하지 않는 조건에 대 한 재현 동물 모델을 필요 합니다. 최적의 접착성 capsulitis 모델 질병의 두 가지 주요 특징을 포함 한다: contracture 어깨 캡슐 및 모션 (ROM)의 범위에서 장기 감소. Schollmeier 외. ⁹ 개에 어깨 contracture 개발 하는 캐스트를 사용 하 여 첫 번째 공동 contracture 모델 중 하나를 설명 합니다. 그들은 또한 ROM과 관절 내부의 압력에서 변화 immobilization⁹의 정지 후 정상 수준으로 돌아 보고. 그러나, 연구에 언급 한 중요 한 제한 캐스트 기법을 사용 하는 동물 사이의 다리 위치에 변화 이다. 쉽게 재현 가능한 모델, 칸 노 외. 를 얻기 위하여 ¹⁰ 나중 어깨의 경직 된 내부 고정을 사용 하는 접착제 capsulitis 쥐 모델 제시. 그러나, 그들은 그들의 모델 ROM에 상당한 감소를 달성, 비록 그들은 않았다 진술 하지 이러한 변화 했다 임시 또는 오래 지속 여부. 우리의 연구의 목적은 ROM과 관절 경직에 장기간된 여분 관절 갑 합동 동원 정지의 효과 조사 하 여 적합 한 비보에 어깨 contracture 쥐 모델을 만드는 것 이었다.

프로토콜

연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 베스 이스라엘 여자 집사 의료 센터에 의해 승인 되었다. 불필요 한 장시간된 마 취를 방지 하 고 또한 저체온증을 피하기 위해 주의 되었다. 동물 각 ROM 측정 세션에서가 중 되었고 체중 감량에 대 한 모니터링.

1. 연구 주제

1. 13 주 이전 수술과 몸 무게의 250-300 g 사이의 범위 시 10 Sprague-Dawley 쥐를 사용 합니다.

2. 수술

1. 마 취 및 수술 동원 정지 하기 전에, 초기 토크 외부 회전의 60 °와 80 ° 내부 회전의 회전 각도의 함수로 측정 (단계 5 참조).
2. 마 취 유도 실에서 흡입을 통해 5 %isoflurane 유발 하 고 수술을 통해 코 통해 2 %isoflurane 유지할.
   1. 동물 아래 물 히터를 사용 하 여 마 취 동안 체온을 유지 하기 위해.
   2. 통증 제어를 위해 쥐의 몸 무게에 따라 1.2 mg/kg의 복용량에 피하 지속 출시 buprenorphine를 관리 합니다.
3. Immobilize 왼쪽된 갑 납치 (상 박 골의 샤프트과 견 갑 골 척추 사이의 각도)¹⁰ 의 60 °의 각도로 관절 ^{, 11}.
   1. 상 박 골의 축에 평행 하 게 후부 세로 절 개를와 함께 수술을 시작 합니다. 바로 갑 아래 피부 절 개를 공동 확인 하 고 약 3 cm에 대 한 확장.
   2. 2 봉합 (꼰된 폴리에스터) 갑 공동 안팎의 상 박 골의 샤프트 원심 2/3 견 갑 골의 측면 가장자리를 통해 피어 싱으로 고정을 사용 하 고 이후 그림 1A에서 볼 수 있듯이 강화. 상 완 동맥 같은 중요 구조 constricting 피하려고 노력을 가져가 라.
      참고: 외과 기술은 다른 계획 (X 및 Y)를 영향을 주지 않고 납치 (Z)의 60 ° 자동 합동을 제한 할 수 있는 장점이 있습니다. 주위에 상 완 골과 견 갑 골의 측면 테두리 통해 봉합을 배치 하 여 두 구조체의 근사값은 달성 하 고 견 갑 골 블레이드 평면 유지. 강화는 봉합, 후 팔은 고정 휴식 위치 X 및 Y 평면을 고려할 때, 납치의 60 °에 Z 비행기 간주 됩니다 때. 이 미세 3 계획에 공동 위치 조정의 실패에서 생성 될 수 있는 동물 사이 가변성을 제한 하 생각 된다.

3. 절 개 폐쇄

1. 적절 한 hemostasis 후 피부 클립을 사용 하 여 피부 절 개를 닫습니다.
2. 마 취를 중단 하 고 따뜻한 환경에서 감독 복구 동물 허용. 동물 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복, 후의 감 금 소를 다시 반환 합니다.
3. 절차 후 바로 정상적인 활동에 반환을 동물 허용. 동물 자동 공동을 해결 하기 위해 내부 봉합에 주로 의존 하는 제한 없이 이동 하실 수 있습니다.
4. 감염에 대 한 모니터링 하려면 첫 번째 수술 후 1 주일 동안 매일 절 개 사이트를 검사 합니다.
5. 수술 후 10^일 하루에 상처 클립을 제거 합니다.
   참고: 절차 동안, 근육의 아무 조작 그리고 기술은 어떤 내부 관절 외상, 따라서 capsular 및 관절 연속성 및 해부학 무결성 유지를 포함 하지 않았다. 어느 외부 제 지 나 활동 제한 우리의 프로토콜에서 뒤를 이었다.
6. 진통 지속 출시 buprenorphine를 사용 하 여 마 취 유도에서 시작 하는 1.2 mg/kg의 복용량에 피하 주사 하 고 필요한 경우 모든 72 h를 반복을 제공 합니다.

4. 봉합 사 제거 동원 정지 후 8 주

1. 마 취 유도 실에서 흡입을 통해 5 %isoflurane 유도 후 수술을 통해 코 통해 2 %isoflurane 지속. 통증 제어를 위해 쥐의 몸 무게에 따라 1.2 mg/kg의 복용량에 피하 지속 출시 buprenorphine를 관리 합니다.
2. 이전 절차에서 흉터 위에 절 개를 확인 합니다.
3. 잘라는 봉합 하 고 상 완 골과 견 갑 골에서 제거 합니다.
4. 절 개 상처 클립을 닫습니다.
5. 감염의 어떤 표시 든 지 검출 하기 위하여 첫 번째 주 동안 매일 절 개 사이트를 검사 합니다. 통증과 고통 뿐만 아니라 모니터링 합니다.
6. 수술 후 10^일 하루에 상처 클립을 제거 합니다.

5. 범위의 모션 및 공동 강성 측정

1. 동원 정지는 팔 클램프, 센서 조립 및 선회 차축¹¹의 구성 된 사용자 지정된 장치를 사용 하 여 전후 ROM 및 수동 어깨 역학을 측정 합니다. 이것은 수술 전 수행 (초기 계획) 및 봉합 사 제거 후 지속적으로.
   1. 봉합 사 제거 (후속 일 0) 직후 측정 ROM 그리고 연속적으로 두 번 주.
   2. 매주 한 번, 10% 미만 기록 시 이전 시간 지점에서 변경 하는 측정을 줄일 수 있습니다.
      참고: 테스트 후 ROM 주, 각 동물의 ROM 바꾸지 않았다 크게 시험 시간 포인트 사이 (10% 미만 변경). 따라서, 우리는 느꼈다 일주일에 한 번에 일주일에 두 번에서 테스트 주파수 감소 충분, ROM이 시점에서 고원 하 듯.
2. 마 취 유도 5%와 2% (약 5 분), 절차의 전체 길이 대 한 유지 보수에 대 한 측정을 효율적으로 촉진 하기 위하여 isoflurane 통해 정밀 기화 기를 사용 하 여 측정을 실시 합니다. 동물 아래 물 히터를 사용 하 여 마 취 동안 체온을 유지 하기 위해.
3. 위치 레이저 가이드의 도움으로 ROM 측정을 위해 제대로 동물입니다. 위치는 팔 클램프 forelimb 감지 축과 90 ° 앞으로 굴곡에 상 완 골의 긴 축에 맞춰집니다. 손목과 팔꿈치 그림 1B에서 볼 수 있듯이 여 forelimb 보안.
4. 일관 된 방식에서 ROM과 토크를 평가 하기 위해 스테퍼 모터에 의해 수동 forelimb 회전을 제어 합니다. 마이크로컨트롤러와 스테퍼 모터를 제어 합니다. 경사 계, 시작과 측정의 끝을 나타내기 위해 토크 센서에서 그와 함께에서에서 사용 하 여 입력.
5. 마이크로컨트롤러는 컴퓨터와 사내 개발된 MATLAB 코드를 사용 하 여 컨트롤을 연결 합니다.
6. 초기 측정, 주기 센서 어셈블리 3 번 외부 회전의 60 °와 80 ° 초기 토크 측정을 얻기 위해 내부 회전의 사이 대 한 (외부: t_내선 및 내부: t_int) 나중에 비교를 위해.
7. ROM 측정을 위해를 사용 하 여 각 동물의 토크 값 (t_ext 와 t_int) 그들의 자신의 기준선 측정에서 프로그램에서 미리 설정 된 입력 변수 변화 회전 롬 사용에 기준선 측정으로 감지 중지 비교 후속 ROM 측정 지점입니다. 변화는 0.2 ° 해상도 감지 했다.
8. 강성 측정을 위해 프로그램에서 미리 설정 된 입력으로 원래 회전 각도 60 ° 외부 회전 및 80 ° 내부 회전을 사용 하 여 토크에 변화를 감지 하기 위해. 변경 0.01 Nmm의 해상도 함께 발견 했다.
9. 각 ROM 평가와 같은 날에 동물을 무게. 비늘에 동물을 놓고 그들의 대 중을 기록 합니다. 이러한 데이터는 연구 기간 동안 동물의 건강 상태를 평가 하는 도구 중 하나로 사용 되었다.
10. 복구, 다음 그들의 감 금 소에 쥐를 반환 하 고 통증이 나 조 난의 흔적에 대 한 모니터링 합니다. Sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지이 테스트를 통해 어떤 동물도는 무인 왼쪽입니다.
    참고: ROM 및 토크 측정 {빌라 Camacho 2015} 우리의 그룹에 의해 이전에 보고 된 사용자 지정 된 장치와 달성 했다. 장치는 스테퍼 모터에 의해 회전 하 고 사용자 지정 MATLAB 스크립트에 의해 제어의 구성 된 맞춤 지 그. 토크 센서 및 관성 측정 단위 토크를 캡처하고 표본의 조음 동안 데이터를 배치 하는 데 사용 됩니다.

6. 사후 Immunohistologic 분석

1. 8 주 ROM 측정 기간의 끝에, CO₂ 노출 쥐를 안락사.
2. 둘 다 왼쪽 부 (움직일) 및 disarticulating에서 척 골, 상 완 골과 쇄 골과 흉 강에서 견 갑 골 단면 (건강 관리) 어깨를 오른쪽.
3. 수정 삭제 어깨 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린의 솔루션에 3 일 뒤에 또 다른 2 달 동안 pH 7.4에 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 10%의 솔루션에 decalcification.
4. 이 과정 동안, 샘플 통에 부드러운 동요 주기를 놓고 4 ° c.에 저장 모니터링 매주 microcomputed tomography (uCT) 검사와 공동 자동의 decalcification.
   참고: EDTA는 점차적으로 감소 크리스탈 크기^12,,1314는 인회석 크리스탈 외부 표면에서 칼슘 이온 chelating 에이전트. 이 과정은 매우 느리고 부드러운, 그리고 immunohistochemistry (IHC) 등 기술에 대 한 유지 해야 하는 특정 조직 요소를 검색 하는 데 사용 됩니다. 속도는 EDTA는 견본 decalcifies pH는 용액의 농도에 따라 달라 집니다. 산도, 측면에서 그것은 수에서 범위 7 7.4, 더 알카라인 솔루션 decalcification 속도 가속. 그러나, 더 높은 pH 수준의 솔루션 주요 조직 요소를 손상 수 있습니다. 또한, 같은 실험에 대 한 일반적인 EDTA 농도 거짓말 사이 10% ~ 14%, 하지만 그것은 매우 중요 한 그래서이 적어도 3 ~ 4 배 decalcification 액체의 교체를 위해서는 칼슘, 채권 일단 활성 에이전트 고갈 된다 기억 하 당 주¹⁵.
5. Decalcification 과정 체결 했습니다 일단 갑 관절 조직학 단면에 대 한 파라핀 스택에 탑재 합니다. 동양 코로나 조각 수 있도록 샘플. 상 박 골의 머리의 50% 깊이에서 얻은 조각 (센터, 중간 coronally) 그림 1에 나와 있습니다. Immunohistochemical 얼룩 거리 조직 공동의 존재를 과산화 효소-안티-과산화 효소 방법을 사용 하 여 수행 합니다. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. 나트륨 구 연산 염 버퍼 솔루션 (10 m m 나트륨 구 연산 염, 0.05% 트윈 20, pH 6.0, 95-100 ° C에서 5 분을 위한 미리 데워) 플라스틱 Coplin jar에는 일반 전자 레인지에서 10 분 동안 배치 슬라이드 물속에 넣고 전자 레인지 방사선 항 원 복구 수행 중간 힘에서. 슬라이드를 실 온에서 30 분 동안 냉각 허용 합니다.
7. 30 분, 혈 청 염소와 차단을 수행 하 고는 기본 마우스 모노 클론 항 체 (1:400 희석) 4 ° c.에 하룻밤 fibronectin와 표본 품 어
8. 1 차적인 항 체를 가진 외피 후 씻어 두 번 PBS와 표본 (0.5 ug/mL) 10 분; 그리고 2 차 항 체 (1:400 희석)에 30 분 동안 공액 염소 antimouse IgG-과산화 효소와 함께 품 어.
9. PBS와 두 번 표본 세척 (2.5 µ g/mL) 10 분 및 3,30 diaminobenzidine 테 염화 및 30% 과산화 수소 10 분 Counterstain Carazzi hematoxylin와에 대 한 어둠 속에에 폭로 대 한 통에.

결과

모션의 범위

후속 날 0, 우리가 발견 초기에 비해 총 ROM에 63% 감소 (P <.001. 19% 제한에 진행 중지 될 때까지 주 5 후속, ROM의 점진적 개선 관찰 (P < 0.001). 나머지 제한, 총 ROM의 18%에 따라 최대 8 주에 아직도 분명 했다 (P < 0.001).

뻣 뻣 함

후속 날 ...

토론

이 연구는 갑 공동의 내부 고정을 통해 어깨의 접착성 capsulitis의 쥐 모델을 제공합니다. 게다가, 그것은 고정 제거 후 최소 8 주 동안 총 ROM의 확장된 감소를 보여준다. 다른 시간 지점에서 ROM에 변경 계산 하려면 측정 동물 특정 기준선에 비교 되었다. 반대로, 칸 노 외. ¹⁰ 변경 비보 전 ROM을 결정 하기 위하여 동물의 모든에 대 한 표준화 된 토크를 사용.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus