Yapışkanlı Capsulitis omuz fare modeli

Özet

Bu iletişim kuralı bir yapıştırıcı capsulitis vivo içinde fare modeli sunar. Model glenohumeral eklem bir internal fiksasyon ile uzun bir süre için bir hareket (ROM) ve artan eklem sertliği azalan dönme aralığındaki kaynaklanan ekstra eklem dikiş fiksasyon içerir.

Özet

Bu öneriyi olası tedavi seçenekleri bu durumu ve karşılaştırılabilir arthrofibrosis diğer etiologies için araştırma için yapıştırıcı capsulitis bir vivo içinde fare modeli yaratmayı amaçlamaktadır. Model omuz ekstra eklem fiksasyon fareler ile scapular için humerus dikiş, intra artiküler boşluk istila ve sonuçlanan düşük dönme ROM ve artan ortak olmadan bir ikincil kontraktürü kaynaklanan dahil edilir. sertlik.

Biz 10 Sprague-Dawley rat bu çalışma amacıyla kullanılır. Temel ROM ölçü birimlerinin glenohumeral immobilizasyon önce çekildi. Fareler immobilizasyon için 8 hafta önce fiksasyon dikişler kaldırıldı ve ROM ve eklem sertliği değişiklikler değerlendirildi tabi tutuldu. ROM önemli bir azalma immobilizasyon sonuçlandı olup olmadığını değerlendirmek için kinematik değişimler hesaplanır. ROM her zaman noktada takip süresi içinde ölçüldü ve temel iç ve dış ROM ölçümleri karşılaştırıldı. Sertlik, ortak kinetik değerlendirmek için ilk dış rotasyon 60 ° ve ilk iç rotasyon 80 ° ulaşması için gerekli tork (t_ext ve t_int ) farklılıkları belirlenerek hesaplanır.

Ekstra eklem sütür fiksasyonu takip gün 0 kaldırıldıktan sonra satır taban çizgisine göre toplam ROM %63 azalma bulduk. % 19 kısıtlama yavaş aşağı ilerleme ile takip, 5 hafta sürekli iyileştirme görülmektedir. Haftasında 8 takip, takip gün 0 bir % 18 sınırlama-in ROM Ayrıca, hala vardı, satır taban çizgisine göre 13,3 Nmm artış tork bulduk. Hafta 8, toplam tork 1.4 ± 0.2 ölçüldü Nmm ilk ölçümler yüksek. Bu eser azaltılmış ROM ve artan sertliği kalıcı ile omuz yapışkanlı capsulitis bir fare modeli tanıttı.

Giriş

Yapışkanlı capsulitis omuz genellikle donmuş omuz veya omuz kontraktürü bilinir. Kısıtlı glenohumeral hareket ve muhtemelen bir sonucu olarak ileri fibrozis ve ortak kontraktürü^1,2,3ağrı ile karakterizedir. Koşul (türleri ı ve III) bir sonuç yoğun kollajen matris ortak kapsül^2,3ile fibroblast ve myofibroblast hücre alımı içerir. Cinsiyet, diyabet, hipertiroidi, travma olabilir ve uzun süreli immobilizasyon^4,5,6dahil olmak üzere bir ortak kontraktürü geliştirmek için birçok olası risk faktörleri vardır.

Etkili tedavi seçenekleri eksik olan ve çoğunlukla fizik tedavi, muhafazakar özenle düzeldi değil aşırı durumlarda cerrahi yayın şeklinde müdahale ile içerir. En iyi tedavi yöntemi belirsiz kalır ve tıp alanında^7,8yıldır büyük ilgi bir konu olmuştur. Roman tedavi olanakları gelişimi intra artiküler indüklenen travmada dayanmaz koşul için tekrarlanabilir bir hayvan modeli gerektirir. En iyi yapıştırıcı capsulitis modeli hastalık iki temel özellikleri içermelidir: kontraktürü omuz kapsül ve sıra-in devinim (ROM) uzun süreli bir azalma. Schollmeier vd. ⁹ ilk ortak kontraktürü modellerinden birini bir döküm köpek dişi omuz kontraktürü geliştirmek için kullanılmıştır. Aynı zamanda ROM ve intra artiküler basınç değişiklikleri immobilizasyon⁹kesilmesi sonra normal seviyelere döndü bildirilmiştir. Ancak, önemli bir sınırlama çalışmada bahsedilen bir döküm tekniği kullanımı nedeniyle hayvanlar arasında uzuv pozisyonda çeşididir. Elde etmek için bir daha tekrarlanabilir model, Kanno vd. ¹⁰ daha sonra omuz katı internal fiksasyon kullanarak bir yapıştırıcı capsulitis fare modeli sundu. Onlar kendi modeli ile ROM önemli bir azalma elde rağmen ancak, onlar bu değişiklikler geçici veya uzun süreli devlet değil. Bizim çalışmada uzun süreli ekstra eklem glenohumeral eklem immobilizasyon etkisini ROM ve eklem sertliği inceleyerek uygun vivo içinde omuz kontraktürü sıçan manken yaratmaktı.

Protokol

Çalışma kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi tarafından kabul edildi. Özen gereksiz uzun süreli anestezi önlemek ve hipotermi önlemek için. Hayvanlar her ROM ölçüm oturumunda ağırlıklı ve kilo kaybı için izlenir.

1. çalışma konuları

1. 13 haftalık zaman cerrahi ve bu aralıktaki arasında vücut ağırlığı 250-300 g 10 Sprague-Dawley rat kullanın.

2. cerrahi müdahale

1. Anestezi altında ve cerrahi immobilizasyon önce temel tork döndürme açısı 60 ° dış rotasyon ve iç rotasyon 80 ° arasında bir fonksiyonu olarak ölçmek (bkz. Adım 5).
2. Anestezi ile %5 isoflurane bir indüksiyon odasında inhalasyon yoluyla teşvik ve sonra % 2 isoflurane burun konisi ameliyat boyunca aracılığıyla ile sürdürmek.
   1. Anestezi sırasında vücut ısısını korumak için su bazlı ısıtma elemanı hayvan altında kullanın.
   2. Ağrı kontrolü amacıyla sürekli yayın buprenorfin subkutan, sıçan vücut ağırlığı 1.2 mg/kg doz yönetmek.
3. Bir kaçırma (humerus şaft ve skapular omurga arasındaki açı)¹⁰ 60 ° açıyla Immobilize sol glenohumeral eklemler ^{, 11}.
   1. Cerrahi işlem bir arka boyuna kesi ile paralel olarak humerus şaft başlatın. Cilt kesi hemen altında glenohumeral eklem yapmak ve yaklaşık 3 cm için genişletmek.
   2. 2 dikiş (örgülü polyester) aracılığıyla yanal kenar olarak skapula ve distal üçte humerus milinin çevresinde piercing glenohumeral eklem hareketsiz için kullanın ve daha sonra Şekil 1A' gösterildiği gibi sıkın. Brakiyal arter gibi önemli yapıların constricting önlemek için ekstra çaba atın.
      Not: Cerrahi tekniğin glenohumeral eklem kaçırma (Z) 60 ° ezelî derinden etkileyici diğer planları (X & Y) sınırlamak için güçlü olmak bir avantajdır. Dikiş kol kemiği çevresinde ve kürek yanal kenarlığını yoluyla yerleştirerek, iki yapının yaklaşık elde ve skapular bıçak uçakta saklanır. Z uçak olduğu düşünüldüğünde dikiş sıkma sonra kol X & Y uçakları göz önünde bulundurarak istirahat konumunda ve kaçırma 60 ° sabittir. Bu güzel üç planları ortak konumu ayarlama hatası üzerinden oluşturulan hayvanlar arasında değişkenlik sınırlamak için düşünülmektedir.

3. kapatmak belgili tanımlık kesme

1. Uygun hemostaz sonra cilt klipleri kullanarak cilt kesi kapatın.
2. Anestezi durdurma ve sıcak bir ortamda gözetiminde kurtarmak hayvan izin. Hayvan sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine sonra onun kafes için geri dönün.
3. İşlemden sonra hemen, hayvanlar için normal aktiviteye dönmek izin. Hayvanlar glenohumeral eklem düzeltmeye esas olarak iç dikişler üzerinde güvenerek kısıtlama olmadan taşımak izin verir.
4. Olası enfeksiyon için izlemek için ilk ameliyat sonrası hafta içi her gün kesi siteleri inceleyin.
5. 10^inci gün ameliyat sonrası yara klip kaldırın.
   Not: Kas hiçbir düzenleme yordamı sırasında vardı ve teknik intra artiküler herhangi bir travma, böylece kapsüler ve artiküler süreklilik ve anatomik bütünlüğünün korunması dahil değil. Ben de dış dizginlemek ne de faaliyet sınırlama bizim iletişim kuralında izledi.
6. Sürekli yayın buprenorfin, kullanarak analjezi subkutan, 1.2 mg/kg anestezi indüksiyon başlayan bir doz enjekte ve gerekirse her 72 h tekrarlanan sağlar.

4. dikiş kaldırma immobilizasyon sonra 8 hafta

1. Anestezi ile %5 isoflurane bir indüksiyon odasında inhalasyon yoluyla teşvik, sonra burun konisi ameliyat boyunca üzerinden % 2 isoflurane ile sürekli. Ağrı kontrolü amacıyla sürekli yayın buprenorfin subkutan, sıçan vücut ağırlığı 1.2 mg/kg doz yönetmek.
2. Bir kesik yara izi önceki yordamı üstüne olun.
3. Dikiş kesme ve pazı kemiği ve kürek kemiği kaldırmak.
4. Kesik yara kliplerle kapatın.
5. Kesi sitenin herhangi bir enfeksiyon belirtileri tespit için her gün ilk haftasında inceleyin. Acı ve sıkıntı de izleyin.
6. 10^inci gün ameliyat sonrası yara klip kaldırın.

5. Aralık hareket ve ortak sertlik ölçümleri

1. ROM ve pasif omuz mekaniği öncesi ve sonrası immobilizasyon bir kol kelepçe, bir sensör derleme ve bir döner aks¹¹içeren özelleştirilmiş bir aygıtı kullanarak ölçmek. Bu pre-operatively yapılır (temel) ve sürekli dikiş çıkarıldıktan sonra.
   1. Ölçü ROM hemen sonra dikiş kaldırma (takip gün 0) ve daha sonra iki kez bir hafta.
   2. Bir kez haftalık % 10'dan daha az kayıt üzerine önceki zaman noktasından dönüştürme ölçümleri azaltmak.
      Not: ROM hafta için test ettikten sonra her hayvan ROM büyük ölçüde zaman puan test arasında değişmedi (az % 10 değiştirmek). ROM bu noktada Plato gibi görünüyordu, bu nedenle, biz haftada iki kez bir hafta test frekansı azalan yeterli olduğunu hissettim.
2. Ölçüler ölçümleri verimli kolaylaştırmak için indüksiyon için % 5 ve %2 (yaklaşık 5 dakika), prosedürün tam uzunlukta için bakım için isoflurane üzerinden hassas Buharlaştırıcı kullanarak anestezi altında yerine getirir. Anestezi sırasında vücut ısısını korumak için su bazlı ısıtma elemanı hayvan altında kullanın.
3. Düzgün bir lazer kılavuzun yardımı ile ROM ölçüm için hayvan getirin. Algılama eksen ile 90° ileri fleksiyon forelimb kol kelepçe üzerinde bulunduğu humerus uzun ekseni ile uyumlu. Şekil 1Badımında gösterildiği gibi dirsek ve bilek tarafından forelimb güvenli.
4. Pasif forelimb döndürme ROM ve tork tutarlı bir şekilde değerlendirmek için bir step motor kontrol. Mikroişlemci ile Step motor kontrol. Bu başlangıç ve bitiş ölçümlerin belirtmek için bir tork sensörü ile birlikte İnklinometre kullanım girdileri.
5. Mikrodenetleyici bir bilgisayar ve kontrol bir şirket içinde geliştirilen MATLAB kodu kullanarak bağlayın.
6. Temel ölçü birimlerinin sadece, sensör derleme 3 kez dış rotasyon 60 ° ve iç rotasyon ilk tork ölçümler elde etmek için 80 ° arasında geçiş yapmak için (dış: t_ext ve iç: t_int) daha sonra karşılaştırma için.
7. ROM ölçümleri için tork değerleri her hayvan kendi temel ölçü birimlerinin (t_ext ve t_int) program içinde önceden ayarlanmış giriş değişkenler olarak değişiklikleri rotasyon ROM kullanmak temel ölçü birimlerinin durdurma bir karşılaştırmalı algılamak için kullanın sonraki ROM ölçümleri için noktası. Değişiklikleri 0.2 ° çözünürlük ile tespit edildi.
8. Sertlik ölçümleri için tork değişiklikleri algılamak için önceden ayarlanmış giriş olarak programın orijinal döndürme açıları 60 ° dış rotasyon ve 80 ° iç rotasyon kullanın. Değişiklikleri 0,01 Nmm çözünürlük ile tespit edildi.
9. Hayvanlar her ROM değerlendirmesi aynı günde tartın. Hayvanlar üzerinde ölçekler yerleştirin ve onların kitleler kaydetmek. Bu veriler bir araç çalışma sırasında hayvan sağlık durumu değerlendirmek için kullanılmıştır.
10. Kurtarma, fareler için onların kafes dönmek ve ağrı veya acı belirtileri için izlemek. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar bu test boyunca, hiçbir hayvan katılımsız bırakılır.
    Not: Daha önce grubumuza {Villa-Camacho 2015} tarafından rapor, özelleştirilmiş cihaz ROM ve tork ölçümler elde edildi. Step motor tarafından döndürülmüş ve özel MATLAB komut dosyası tarafından denetlenen bir şaft oluşur özel yapım bir jig cihazdır. Bir dönme anıları detektörler ve atalet ölçü birimi tork yakalamak ve veri örnek eklem konumlandırmak için kullanılır.

6. post-mortem Immunohistologic Analizi

1. 8 haftalık ROM ölçüm dönemin sonunda, CO₂ pozlama ile rats ötenazi.
2. Her ikisi de sol teşrih (hareketsiz) ve sağ (sağlıklı kontrol) omuz kol kemiği Dirsek kemiği üzerinden disarticulating ve kürek kemiği köprücük kemiği ve göğüs boşluğuna kesit.
3. Eksize omuz % 10 tarafsız tampon formalin bir çözümde başka bir 2 ay ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH %7,4 10 bir çözümde incelemelerine ardından 3 gün boyunca düzeltmek.
4. Bu işlem sırasında örnekleri üzerinde bir shaker nazik ajitasyon döngüsünde yer ve 4 ° C'de depolayın Haftalık microcomputed tomografi (uCT) inceden inceye gözden geçirmek ile ortak glenohumeral incelemelerine izlemek.
   Not: EDTA aşamalı olarak azaltılması kristal boyutu^12,13,14apatit kristal dış yüzeyinden kalsiyum iyonları bağlayan bir kenetleme ajandır. Bu süreç çok yavaş ve yumuşak ve immünhistokimya (IHC) gibi teknikleri için korunmalı belirli doku öğeleri algılamak için kullanılır. Hangi örnek EDTA decalcifies oranı pH ve konsantrasyon çözüm bağlıdır. PH açısından bu 7,4 için kalsiyumun hızı hızlandırılması daha alkali çözümleri ile 7 arasında olabilir. Ancak, daha yüksek pH seviyeleri ile çözümleri anahtar doku öğeleri zarar verebilir. Ayrıca, bu tür deneyler için her zamanki EDTA konsantrasyonu arasında % %10 14 yatıyor, ama bu en az 3-4 kez incelemelerine sıvı değişimi gerekir bu yüzden kalsiyum için tahvil bir kez aktif ajan tükenmiş olur hatırlamak çok önemlidir hafta-¹⁵.
5. Kalsiyumun işleminin sonucuna varılmıştır sonra histolojik kesit için parafin yığınları glenohumeral eklem bağlayın. Koronal dilimler için izin vermek için örnekleri gelecek şekilde yönlendirin. Dilimleri elde edilen % 50 hümeral kafa derinlikte (Merkezi, orta-coronally) Şekil 1' de gösterilmiştir. İmmunohistokimyasal eklemde fibrotik doku varlığı belirtmek için peroksidaz-anti-peroksidaz yöntemini kullanarak boyama gerçekleştirmek. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. Bir sodyum sitrat arabellek çözüm (10 mM sodyum sitrat, %0.05 Ara 20, pH 6.0, 95-100 ° C'de 5 min için ısıtılmış) plastik Coplin kavanoza ve düzenli bir mikrodalga fırında 10 dakika boyunca yerleştirerek slaytları batış tarafından mikrodalga ışınlama tarafından antijen alma gerçekleştirmek orta güçte. Slaytlar, oda sıcaklığında 30 dakika soğuması izin.
7. Keçi serum 30 dk ile engelleme gerçekleştirmek ve örnek bir birincil fare mono klonal antikor (1: 400 seyreltme) gecede 4 ° C'de fibronektin ile kuluçkaya
8. Birincil antikor ile kuluçka sonra PBS ile iki kez numuneler yıkayın (0.5 ug/mL) 10 dakikadır; ve ikincil bir antikor, keçi antimouse IgG-peroksidaz eşlenik (1: 400 seyreltme) 30 dakika ile kuluçkaya.
9. Numuneler PBS ile iki kez yıkayın (2,5 µg/mL) bir shaker 10 dakika ve 10 dk. Counterstain Carazzi hematoksilen ile karanlıkta 3,30-diaminobenzidine tetrahydro klorür ve %30 hidrojen peroksit açığa üzerinde.

Sonuçlar

Hareket aralığı

Takip gün 0, Toplam ROM satır taban çizgisine göre %63 azalma bulduk (P < *.001 gerektiğini İlerleme % 19 kısıtlama durduğunda biz takip, 5 hafta ROM kademeli bir iyileşme görülmektedir (P < 0.001). Kalan kısıtlama, Toplam ROM, % 18'i takip 8 haftalıkken hala belli oldu (P < 0.001).

Sertlik

Tartışmalar

Bu çalışmada glenohumeral eklem internal fiksasyon ile omuz yapışkanlı capsulitis bir fare modeli sunar. Ayrıca, Toplam ROM genişletilmiş bir azaltma fiksasyonun çıkarıldıktan sonra en az 8 hafta boyunca gösterir. ROM içinde değişiklikler farklı zaman noktalarda hesaplamak için ölçümler için hayvan belirli temel karşılaştırıldı. Tersine, Kanno vd. ¹⁰ standart bir tork ex vivo ROM değişiklikleri belirlemek için tüm hayvanlar için kullanılır.

...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus