Rattenmodell des anhaftenden Capsulitis der Schulter

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine in Vivo Rattenmodell des anhaftenden Capsulitis. Das Modell enthält eine interne Fixation des gemeinsamen Glenohumeral mit extra artikuläre Nahtmaterial Fixierung über einen längeren Zeitraum, was zu einer verminderten Rotations Reihe Bewegungsumfang (ROM) und erhöhte Gelenksteife.

Zusammenfassung

Dieser Vorschlag soll eine in Vivo Rattenmodell des anhaftenden Capsulitis für die Erforschung der möglichen Behandlungsmöglichkeiten für diese Bedingung und andere Ätiologie der vergleichbaren arthrofibrose zu erstellen. Das Modell enthält extra artikuläre Fixierung der Schulter in Ratten über Skapulier, humerale Nähen, was zu einer sekundären Kontraktur ohne Invasion des intraartikulären Raumes und daraus resultierende verminderte Rotations ROM und erhöhten Gelenk Steifigkeit.

Wir haben 10 Sprague-Dawley Ratten für die Zwecke dieser Studie. Grundlinie wurden ROM Messungen vor Glenohumeral Immobilisierung. Die Ratten wurden bis 8 Wochen der Ruhigstellung unterzogen, bevor die Fixierung Fäden gezogen wurden und Veränderungen in ROM und Gelenksteife wurden ausgewertet. Um festzustellen, ob Immobilisierung führte zu einem deutlichen Rückgang der ROM, wurden Veränderungen der Kinematik berechnet. ROM wurde in der Folgezeit zu jedem Zeitpunkt gemessen und war im Vergleich zu den internen und externen ROM Basisberechnungen. Für die Beurteilung der Steifigkeit, gemeinsame Kinetik wurden berechnet, indem die Unterschiede im Drehmoment (t_Ext und t_Int ) benötigt, um die anfängliche externe Rotation von 60° und erste Innenrotation der 80 ° erreichen.

Nach dem Entfernen der extra artikuläre Nahtmaterial Fixierung auf Follow-up-Tag 0 fanden wir einen Rückgang um 63 % im gesamten ROM im Vergleich zum Ausgangswert. Wir beobachteten kontinuierlichen Verbesserung bis 5. Woche des Follow-up, mit dem Fortschritt verlangsamt sich um eine 19 %-Beschränkung. In Woche 8 des Follow-up gab es noch eine 18 % Einschränkung von Rom darüber hinaus Follow-up-Tag 0, fanden wir das Drehmoment erhöhte sich um 13,3 Nmm im Vergleich zum Ausgangswert. In Woche 8, wurde das gesamte Drehmoment gemessen, um sein 1,4 ± 0,2 Nmm höher als erste Messungen. Diese Arbeit stellt einem Rattenmodell der Schulter anhaftenden Capsulitis dauerhaft eingeschränkter ROM und höhere Steifigkeit.

Einleitung

Anhaftenden Capsulitis der Schulter wird häufig als Schultersteife oder Schulter Kontraktur bezeichnet. Es zeichnet sich durch eingeschränkte glenohumerale Bewegung und Schmerzen, vermutlich als Folge der fortgeschrittene Fibrose und gemeinsamen Kontraktur^1,2,3. Die Bedingung betrifft Fibroblasten und Myofibroblast Zelle Rekrutierung mit eine resultierende Dichte Kollagenmatrix (Typ I und III) in der gemeinsamen Kapsel^2,3. Es gibt viele mögliche Risikofaktoren für die Entwicklung einer gemeinsamen Kontraktur, einschließlich Geschlecht, Diabetes Mellitus, Hyperthyreose, traumatischen Verletzungen und längerer Immobilisierung^4,5,6.

Wirksame Behandlungsmöglichkeiten fehlen und vor allem beinhalten Physiotherapie, mit Eingriff in Form von chirurgischen Version in extremen Fällen, die nicht mit konservativen Behandlung verbessert haben. Die beste Behandlungsmethode bleibt unbestimmt und ist seit Jahren im medizinischen Bereich^7,8ein Thema von großem Interesse. Entwicklung neuartiger therapeutischer Möglichkeiten erfordert eine reproduzierbare Tiermodell für die Bedingung, die nicht auf intraartikuläre induzierte Trauma angewiesen ist. Das optimale anhaftenden Capsulitis Modell sollten die zwei wichtigsten Merkmale der Krankheit einbeziehen: Verspannung der Schulter-Kapsel und einem anhaltenden Rückgang der Bewegungsumfang (ROM). Schollmeier Et al. ⁹ beschrieben eines der ersten gemeinsamen Kontraktur Modelle mithilfe einer Besetzung Schulter Kontraktur in Eckzähne zu entwickeln. Sie berichteten auch, dass Änderungen in ROM und intraartikulären Druck nach Beendigung der Ruhigstellung⁹normalisiert. Allerdings ist eine wichtige Einschränkung, die in der Studie erwähnt die Variation der Extremität Position zwischen den Tieren durch die Verwendung einer Cast-Technik. Erlangung einer mehr reproduzierbares Modell, Kanno Et al. ¹⁰ stellte später einen anhaftenden Capsulitis Rattenmodell mit starren interne Fixierung der Schulter. Jedoch obwohl sie eine signifikante Reduktion in ROM mit ihrem Modell erreicht, sie nicht angeben, ob diese Veränderungen vorübergehende oder dauerhafte waren. Das Ziel unserer Studie war die Schaffung einer Rattenmodell geeignet in Vivo Schulter Kontraktur durch Untersuchung der Wirkung von längeren extra artikuläre Glenohumeral gemeinsame Immobilisierung auf ROM und Gelenksteife.

Protokoll

Die Studie wurde von der institutionellen Animal Care und Einsatz-Ausschuss am Beth Israel Deaconess Medical Center genehmigt. Darauf wurde geachtet, um unnötige längere Narkose zu vermeiden und auch um Unterkühlung zu vermeiden. Tiere waren bei jeder Sitzung ROM Messung gewichtet und überwacht für die Gewichtsabnahme.

1. die Studienteilnehmer

1. Verwenden Sie 10 Sprague-Dawley Ratten, die sind 13 Wochen alt zu der Zeit der Chirurgie und diesen Bereich zwischen 250 – 300 g Körpergewicht.

2. chirurgische Verfahren

1. Narkose und vor chirurgischen Immobilisierung, messen die Grundlinie Drehmoment als Funktion der Drehwinkel zwischen 60° der Außenrotation und 80° Innenrotation (siehe Schritt 5).
2. Anästhesie mit 5 % Isofluran durch Inhalation in einer Induktion Kammer zu induzieren, und dann mit 2 % Isofluran durch eine Nase Kegel während der Operation aufrecht zu erhalten.
   1. Verwenden Sie eine wässrige Heizelement unter das Tier, um Körpertemperatur während der Narkose.
   2. Zum Zwecke der Schmerzkontrolle retard-Buprenorphin subkutan in einer Dosis von 1,2 mg/kg je nach Körpergewicht die Ratte zu verwalten.
3. Bewegungsunfähigkeit des linken Schultergelenk Gelenke in einem Winkel von 60° Abduktion (der Winkel zwischen der humerale Welle und das Skapulier Wirbelsäule)^{10 , 11}.
   1. Starten Sie den chirurgischen Eingriff mit einem hinteren längs-Schnitt parallel zu der humerale Welle. Der Hautschnitt unterhalb der Glenohumeral gemeinsame zu machen und um ca. 3 cm zu verlängern.
   2. Verwenden Sie 2 Fäden (geflochtene Polyester), um das glenohumerale Gelenk zu immobilisieren, durch piercing durch den seitlichen Rand des Schulterblattes und um die distale zwei Drittel der humerale Welle und anschließend ziehen Sie an, wie in Figur 1Adargestellt. Nehmen Sie zusätzliche Anstrengungen, um zu vermeiden, einengenden kritischen Strukturen wie die brachial Arterie.
      Hinweis: Die chirurgische Technik hat einen Vorteil davon, das glenohumerale Gelenk bei 60 ° Abduktion (Z) zu begrenzen, ohne Auswirkungen auf andere Pläne (X & Y). Durch die Platzierung Nähte um den Humerus und durch den seitlichen Rand des Schulterblattes, ist eine Annäherung der beiden Strukturen erreicht und auf das Skapulier Klinge Flugzeug gehalten. Nach dem Festziehen der Nähte, ist der Arm fixiert in der Ruheposition bei X & Y Flugzeuge und bei 60° Abduktion, Z-Ebene gilt. Dies ist gedacht, um Variabilität zwischen den Tieren zu beschränken, die durch Ausfall des fine-tuning des gemeinsamen Standpunkts in den drei Plänen generiert werden kann.

3. schließen die Inzision

1. Schließen Sie nach richtigen Blutstillung der Hautschnitt mit Haut-Clips.
2. Einstellen der Narkose und lassen Sie das Tier unter Aufsicht in einer warmen Umgebung zu erholen. Nachdem das Tier ausreichend zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wieder zu sich kommt, bringen Sie es zurück in seinen Käfig.
3. Unmittelbar nach dem Eingriff können Sie die Tiere zur normalen Aktivität zurückkehren. Lassen Sie die Tiere zu bewegen, ohne Einschränkung, vor allem auf interne Nahtmaterial, das glenohumerale Gelenk zu beheben.
4. Um mögliche Infektionen zu überwachen, überprüfen Sie die Schnitt-Sites täglich während der ersten postoperativen Woche.
5. Wunde Clips auf^{dem 10 Tag nach der Operation} zu entfernen.
   Hinweis: Es gab keine Manipulation der Muskeln während des Verfahrens und die Technik beinhaltete keine intraartikuläre Trauma, so Kapsel und artikuläre Kontinuität und anatomische Integrität bewahren. Unser Protokoll folgte weder externe Restrain noch Aktivität Einschränkung.
6. Bieten Sie Analgesie mit retard-Buprenorphin, subkutan injiziert, bei einer Dosis von 1,2 mg/kg ab Induktion der Anästhesie und wiederholt alle 72 Std. bei Bedarf.

4. Die Nahtentfernung 8 Wochen nach Immobilisierung

1. Anästhesie mit 5 % Isofluran durch Inhalation in einer Induktion Kammer zu induzieren, dann mit 2 % Isofluran durch eine Nase Kegel während der Operation erlitt. Zum Zwecke der Schmerzkontrolle retard-Buprenorphin subkutan in einer Dosis von 1,2 mg/kg je nach Körpergewicht die Ratte zu verwalten.
2. Machen Sie einen Schnitt auf die Narbe von der vorherigen Prozedur.
3. Schneiden Sie die Fäden und entfernen Sie aus der Oberarmknochen und Schulterblatt.
4. Schließen Sie den Schnitt mit Wunde Clips.
5. Prüfen Sie die Schnitt-Website täglich während der ersten Woche, Anzeichen einer Infektion zu erkennen. Schmerz und Leid sowie zu überwachen.
6. Wunde Clips auf^{dem 10 Tag nach der Operation} zu entfernen.

(5) Bewegungsradius und Gelenksteife Messungen

1. Messen Sie die ROM und passive Schulter-Mechanik, vor und nach Immobilisierung mit einem maßgeschneiderten Gerät, bestehend aus einem Arm Klemme, eine Sensoranordnung und eine schwenkbare Achse¹¹. Dies erfolgt präoperativ (Baseline) und kontinuierlich nach der Nahtentfernung.
   1. Maßnahme ROM unmittelbar nach Nahtentfernung (Follow-up-Tag 0) und anschließend zweimal in der Woche.
   2. Reduzieren Sie Messungen einmal wöchentlich bei der Aufnahme von weniger als 10 % von der früheren Zeitpunkt ändern.
      Hinweis: Nach dem Test ROM für Wochen, die ROM jedes Tieres änderte sich nicht drastisch zwischen Zeitpunkten testen (weniger als 10 % ändern). Das ROM schien zu diesem Zeitpunkt plateau, daher, wir fühlten, dass sinkende Prüffrequenz von zweimal in der Woche, einmal pro Woche ausreichend.
2. Führen Sie Messungen unter Narkose mit Isofluran über Präzision Vaporizer für Induktion 5 % und 2 % für die Wartung für die gesamte Länge des Verfahrens (ca. 5 Minuten), um Messungen effizient zu erleichtern. Verwenden Sie eine wässrige Heizelement unter das Tier, um Körpertemperatur während der Narkose.
3. Positionieren Sie das Tier richtig für ROM Messung mit Hilfe eines Laser-Guide. Position der vordergliedmaße auf den Arm Klemme in 90° vorwärts Beugung, mit der Fernerkundung Achse ausgerichtet mit der Längsachse des Humerus. Sichern Sie die vordergliedmaße durch das Handgelenk und Ellenbogen, wie in Abbildung 1 bdargestellt.
4. Steuern Sie passive vordergliedmaße Drehung von einem Schrittmotor, ROM und Drehmoment in konsistenter Weise zu beurteilen. Kontrolle der Schrittmotor mit einem Mikrocontroller. Verwendung Inputs Neigungsmesser, in Verbindung mit den von einem Drehmomentsensor an den Start und das Ende der Messungen.
5. Verbinden Sie den Mikrocontroller zu einem Computer und Steuerung über eine Inhouse entwickelten MATLAB-Code.
6. Für die Baseline-Messungen nur, der Sensoranordnung 3 mal zwischen 60 ° der Außenrotation und 80 ° Innenrotation anfangsdrehmoment Messungen Zyklus (externe: t_Ext und interne: t_Int) für einen späteren Vergleich.
7. Verwenden Sie für ROM Messungen die Drehmomente der einzelnen Tiere am eigenen Baseline-Messungen (t_Ext und t_Int) als voreingestellte Eingabe-Variablen im Programm, Änderungen im Drehung Rom verwenden die Baseline-Messungen als eine vergleichende stoppen erkennen Punkt für ROM Messungen. Mit einer Auflösung von 0,2 ° wurden Änderungen festgestellt.
8. Verwenden Sie für Steifigkeit Messungen original Drehwinkel von 60° Außenrotation und Innenrotation 80° als voreingestellte Eingabe in das Programm um Veränderungen in Drehmoment zu erkennen. Mit einer Auflösung von 0,01 Nmm wurden Änderungen festgestellt.
9. Wiegen Sie Tiere am selben Tag als jedes ROM Bewertung. Legen Sie die Tiere auf Waage und notieren Sie ihre Massen. Diese Daten wurden als eines der Instrumente zur Tiergesundheitsstatus während der Studie zu beurteilen.
10. Nach Genesung wieder ihren Käfigen Ratten und auf Anzeichen von Schmerzen oder Ängste zu überwachen. Während dieses Tests, ist kein Tier unbeaufsichtigt gelassen, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.
    Hinweis: ROM und Drehmoment-Messungen wurden mit einem maßgeschneiderten Gerät zuvor berichtet von unserer Fraktion {Villa Camacho 2015} erreicht. Das Gerät ist eine maßgeschneiderte Jig, die besteht aus einer Welle von Schrittmotor gedreht und durch ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript gesteuert. Ein Drehmomentsensor und inertialsensors dienen zur Erfassung von Drehmoment und Positionsdaten während der Artikulation der Probe.

6. Post-Mortem Immunohistologic Analyse

1. Am Ende der 8-Wochen-ROM Messzeitraum einschläfern Sie Ratten mit CO₂ Exposition.
2. Beide Links zu sezieren (immobilisiert) und rechts (gesunde Kontrolle) Schultern, indem disarticulating der Oberarmknochen aus der Ulna und schneiden das Schulterblatt vom Schlüsselbein und Brusthöhle.
3. Befestigen Sie die ausgeschnittenen Schultern in einer Lösung aus 10 % neutral gepuffertem Formalin für 3 Tage, gefolgt von Entkalkung in einer Lösung von Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) 10 % bei pH 7.4 für weitere 2 Monate.
4. Während dieses Prozesses Proben auf einen Shaker in eine sanfte Erregung Zyklus und bei 4 ° c Lagern Entkalkung der Glenohumeral Verbindung mit wöchentlich Microcomputed Tomographie (uCT) Scans zu überwachen.
   Anmerkung: EDTA ist ein Chelatbildner, der bindet Calcium-Ionen von der Außenfläche des Apatit Kristall, Kristall Größe^12,13,14schrittweise zu reduzieren. Dieser Prozess ist sehr langsam und sanft, und es wird verwendet, um spezifische Gewebe Elemente erkennen, die für Techniken wie Immunhistochemie (IHC) beibehalten werden müssen. Die Rate, an der die EDTA Probe entkalkt, ist der pH-Wert und die Konzentration der Lösung abhängig. In Bezug auf die pH kann es von 7 bis 7,4, mit alkalischer Lösungen beschleunigen die Entkalkung Geschwindigkeit reichen. Lösungen mit höheren pH-Werten können jedoch wichtige Gewebe Elemente beschädigt werden. Darüber hinaus die üblichen EDTA Konzentration für solche Experimente liegt zwischen 10 % bis 14 %, aber es ist sehr wichtig zu bedenken, dass der Wirkstoff aufgebraucht wird, sobald es an Kalzium, Anleihen, so dass hierfür Ersatz der Entkalkung Flüssigkeit mindestens 3 bis 4 mal pro Woche¹⁵.
5. Nach der Entkalkung-Prozess abgeschlossen wurde, montieren Sie die Glenohumeral Gelenke in Paraffin-Stacks für histologischen Schnitt. Richten Sie die Proben an koronalen Scheiben ermöglichen. Scheiben auf 50 % Tiefe des Humeruskopfes gewonnen (in der Mitte, Mitte-koronal) sind in Abbildung 1dargestellt. Führen Sie immunhistochemische Färbung mit der Peroxidase-Anti-Peroxidase-Methode um zu bezeichnen, das Vorhandensein von fibrotische Gewebe im Gelenk. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. Durchführen Sie Antigen-Retrieval durch Mikrowellenstrahlung durch Eintauchen der Folien in ein plastikglas Coplin in einer Pufferlösung Natriumcitrat (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Tween 20, pH 6.0, für 5 min bei 95-100 ° C vorgewärmt) und Unterbringung in eine normale Mikrowelle für 10 Minuten bei mittlerer Leistung. Lassen Sie Folien für 30 min bei Raumtemperatur abkühlen.
7. Führen Sie blockieren mit ziegenserum für 30 min, und inkubieren die Exemplare mit einem primären Maus Mono-klonale Antikörper (1: 400 Verdünnung), Fibronektin über Nacht bei 4 ° c
8. Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper Proben zweimal mit PBS waschen (0,5 Ug/mL) für 10 Minuten; und inkubieren Sie mit einem sekundären Antikörper, Ziege antimouse IgG-Peroxidase-Konjugat (1: 400 Verdünnung) für 30 Minuten.
9. Die Exemplare zweimal mit PBS waschen (2,5 µg/mL) auf einen Shaker für 10 Minuten und Expose zu 3,30-Diaminobenzidine Tetrahydro-Chlorid und 30 % Wasserstoffperoxid in der Dunkelheit für 10 min. Gegenfärbung mit Hämatoxylin Carazzi.

Ergebnisse

Bewegungsbereich

Auf Follow-up-Tag 0, fanden wir einen Rückgang um 63 % im gesamten ROM im Vergleich zum Ausgangswert (P <.001. Wir beobachteten eine schrittweise Verbesserung der ROM bis 5. Woche des Follow-up, beim Fortschreiten auf 19 % Einschränkung gestoppt (P < 0,001). Die restlichen Einschränkung, 18 % der gesamten ROM zeigte sich noch 8 Wochen Follow-up (P < 0,001).

Diskussion

Diese Studie bietet einem Rattenmodell des anhaftenden Capsulitis der Schulter durch interne Fixation der Glenohumeral Verbindung. Darüber hinaus zeigt es einen erweiterten Reduktion des gesamten ROM für mindestens 8 Wochen nach der Entfernung der Fixierung. Um die Veränderungen in ROM zu verschiedenen Zeitpunkten zu berechnen, wurden Messungen im Vergleich zu tierischen spezifische Basislinien. Im Gegensatz dazu Kanno Et al. ¹⁰ verwendet eine standardisierte Drehmoment für alle Tiere...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus