Крысы модель клей капсулит плеча

Резюме

Этот протокол представляет в vivo крысы модель клей капсулит. Модель включает в себя внутренней фиксации плечевого совместного с креплением экстра суставной шов на длительное время, что приводит к снижению вращения диапазон движения (ROM) и увеличение тугоподвижность.

Аннотация

Это предложение направлено для создания в vivo крысы модель клей капсулит для изучения возможных вариантов лечения этого состояния и других этиологий сопоставимых arthrofibrosis. Модель включает в себя экстра суставной фиксации плеча в крыс через наплечник для плечевых швов, обусловило вторичных контрактуры без вторжения внутрисуставных пространства и приводит к снижению вращения ROM и расширение совместных жесткость.

Мы использовали 10 крысах Sprague-Dawley, для целей настоящего исследования. Базовые ROM измерения были взяты перед иммобилизации плечевого. Крысы были подвергнуты 8 недель иммобилизации до фиксации швы были удалены, и были оценены изменения в ПЗУ и тугоподвижность. Чтобы оценить ли иммобилизации привели к значительному сокращению в ПЗУ, были рассчитаны изменения в кинематике. ROM был измерен в каждый момент времени в последующий период и был по сравнению с базовой внутренней и внешней ROM измерений. Для того чтобы оценить жесткость, совместные кинетики были рассчитаны путем определения различий в крутящий момент (t_доб и t_int ), необходимых для достижения первоначальных наружного поворота 60 ° и первоначальный внутреннее вращение 80 °.

После удаления экстра суставной шовные фиксации на последующий день 0 мы нашли 63% снижение в целом ROM, по сравнению с базовой. Мы наблюдали непрерывное улучшение до недели 5 последующей деятельности, с прогрессом, замедление вокруг 19% ограничение. На неделе 8 последующей деятельности по-прежнему существует 18% ограничение ROM. Дополнительно, на последующий день 0, мы нашли крутящий момент вырос на 13,3 НММ по сравнению с базовой. На неделе 8, Общая крутящий момент был измерен 1.4 ± 0,2 Nmm выше чем первоначальные измерения. Эта работа представляет крысы модель клей капсулит плеча с lasting уменьшение ROM и увеличенная жесткость.

Введение

Адгезивные капсулит плеча часто называют замороженное плечо или плечо контрактуры. Он характеризуется ограниченным плечелопаточного движения и боль, предположительно в результате передовые фиброз и совместных контрактуры^1,2,3. Условие предполагает набора клеток фибробластов и Миофибробласт с результирующей плотной коллагеновой матрицы (типов I и III) в совместное капсулы^2,3. Существует множество возможных факторов риска для разработки совместного контрактуры, включая пол, сахарный диабет, гипертиреоз, травмы и длительной иммобилизации^4,5,6.

Эффективные методы лечения хватает и главным образом включают физической терапии, с вмешательством в виде хирургического релиза в крайних случаях, которые не улучшились с консервативной ухода. Лучший метод лечения остается неопределенным и является предметом большой интерес для лет в медицинской области^7,,⁸. Развитие новых терапевтических возможностей потребует воспроизводимые модели на животных для условия, которые не полагаются на внутрисуставных индуцированные травма. Оптимальное клей капсулит модель должна включать две основные характеристики заболевания: Контрактура капсулы плеча и длительное сокращение диапазон движения (ROM). Schollmeier и др. ⁹ описал один из первых моделей совместного контрактуры, используя приведение разрабатывать контрактуры плечевого в клыки. Они сообщили также, что изменения в ПЗУ и внутрисуставных давления вернулся к нормальному после прекращения иммобилизации⁹. Однако важным ограничением, упомянутых в исследовании это различия в положении конечности между животных из-за использования метода cast. Для получения более воспроизводимые модели, Канно и др. ¹⁰ позднее представил модель крыса клей капсулит, с помощью жесткой внутренней фиксации плеча. Однако хотя они добились значительного сокращения в ПЗУ с их моделью, они не указывали ли эти изменения были временными или надолго. Целью нашего исследования было создание подходящей в vivo плечо контрактуры мышиной модели исследуя влияние продолжительной экстра суставной плечелопаточного совместных иммобилизации на ROM и тугоподвижность.

протокол

Исследование было одобрено институциональный уход животных и использования Комитетом на Beth Израиля Deaconess медицинский центр. Чтобы избежать ненужных длительной анестезии, а также избегать переохлаждения были приняты меры. Животных были взвешены на каждой сессии ROM измерения и мониторинг для потери веса.

1. изучение предметов

1. Использование 10 крысах Sprague-Dawley, которые 13 недель во время хирургии и что диапазон между 250-300 г веса тела.

2. хирургическая процедура

1. Под наркозом и до хирургической иммобилизации, измерить крутящий момент базовой в зависимости от угла поворота между 60° внешнего вращения и 80° внутреннего вращения (см. шаг 5).
2. Побудить анестезии с 5% изофлюрановая через вдыхание в камеру индукции и затем поддерживать с 2% изофлюрановая через носовой конус всей операции.
   1. Использование водной основе нагревательный элемент под животное для поддержания температуры тела во время анестезии.
   2. Для целей контроля боли управлять устойчивым релиз бупренорфин подкожно в дозе 1,2 мг/кг в зависимости от веса тела крыс.
3. Обездвиживания левого плечевого суставов под углом 60 ° похищения (угол между плечевой вал и верхней частью лопаточного позвоночника)^{10 , 11}.
   1. Начало хирургической процедуры с задний продольный разрез, параллельно плечевой вала. Сделать разрез чуть ниже плечелопаточного совместных и продлить на около 3 см.
   2. Использовать 2 швы (Плетеный полиэстер) для иммобилизации плечевого сустава, пирсинг через боковые края лопатки и вокруг дистальной две трети плечевых вала и затем затяните как показано на рисунке 1A. Предпринять дополнительные усилия, чтобы избежать сжимает критические структуры, такие как плечевой артерии.
      Примечание: Хирургическая техника имеет преимущество возможность ограничить плечевого сустава в 60° похищения (Z), не затрагивая другие планы (X и Y). Размещая швов вокруг плеча и через боковые границы лопатки, приближение двух структур достигается и поддерживается на плоскости лопаточный лезвия. После ужесточения швы, руки фиксируется в положении покоя при рассмотрении X и Y плоскости и на 60° похищения когда Z плоскости рассматривается. Это считается ограничить изменчивость между животными, которые могут быть получены от провала тонкой настройки совместной позиции в трех планов.

3. закрытие разрез

1. После надлежащего гемостаз закройте разрез кожи с помощью кожи клипов.
2. Прекратите анестезии и позволяют животное, чтобы восстановить под наблюдением в теплой среде. После животное приходит в сознание достаточно для поддержания грудной recumbency, вернуть его обратно в своей клетке.
3. Сразу же после процедуры позволяют животных, чтобы вернуться к нормальной деятельности. Разрешить животных для перемещения без ограничений, полагаясь преимущественно на внутренние швы исправить плечевого сустава.
4. Следить за возможной инфекции, осмотрите разрез сайтов ежедневно в течение первой недели послеоперационные.
5. Удалите клипы рану на 10-^е сутки после операции.
   Примечание: Существует не манипулирования мышц во время процедуры, и техника не связаны с любой внутрисуставных травмы, таким образом, сохраняя капсульные и суставной преемственность и анатомической целостности. Ни внешних удержать ни деятельность ограничение последовал в наш протокол.
6. Предоставить обезболивание с помощью устойчивой релиз бупренорфина, вводят подкожно в дозе 1,2 мг/кг, начиная индукции анестезии и повторяются каждые 72 ч при необходимости.

4. шов удаления 8 недель после иммобилизации

1. Побудить анестезии с 5% изофлюрановая через вдыхание в камеру индукции, а затем с изофлюрановая 2% через носовой конус всей операции. Для целей контроля боли управлять устойчивым релиз бупренорфин подкожно в дозе 1,2 мг/кг в зависимости от веса тела крыс.
2. Сделайте надрез на вершине шрам от предыдущей процедуры.
3. Вырезать швы и удалить из плеча и лопатки.
4. Закройте разрез с раной клипов.
5. Изучить сайт разрез ежедневно в течение первой недели для выявления каких-либо признаков инфекции. Контролировать боль и страдания как хорошо.
6. Удалите клипы рану на 10-^е сутки после операции.

5. диапазон движения и тугоподвижность измерения

1. Измерьте механики ROM и пассивной плеча до и после иммобилизации, с помощью заказной устройство, состоящее из руки зажим, датчик Ассамблеи и поворотная ось¹¹. Это проводится предоперационная (базовой) и непрерывно после удаления швов.
   1. Мера ROM сразу же после удаления швов (последующие день 0) и впоследствии дважды в неделю.
   2. Уменьшите размеры менять раз в неделю, после записи менее 10% от предыдущей точки время.
      Примечание: После тестирования ROM для недели, ROM каждого животного не изменился кардинально между тестирования моменты времени (менее 10% изменить). ROM, как представляется, на данный момент плато, таким образом, мы чувствовали, что снижение тестирования частоты от дважды в неделю раз в неделю вполне достаточно.
2. Проводить измерения под наркозом с использованием изофлюрановая через испаритель точности в 5% для индукции и 2% для обслуживания по всей длине процедуры (примерно 5 минут), для того, чтобы эффективно содействовать измерений. Использование водной основе нагревательный элемент под животное для поддержания температуры тела во время анестезии.
3. Позиция животное правильно для ПЗУ измерения с помощью лазера руководства. Положение передних конечностей на зажим рукой вперед сгибание 90°, с осью зондирования в соответствие с длинной оси плеча. Закрепите передних конечностей, запястья и локоть, как показано на рисунке 1B.
4. Контроль вращения пассивной передних конечностей шаговый мотор для оценки ROM и крутящий момент последовательным образом. Управление шаговым двигателем с микроконтроллером. Использование материалов от инклинометра, в сочетании с теми из датчик крутящего момента для обозначения начала и конца измерений.
5. Подключите к компьютеру и управления с помощью собственных развитых MATLAB код микроконтроллера.
6. Для исходных измерений только, цикла Ассамблеи датчик 3 раза между 60° внешнего вращения и 80° внутреннего вращения для получения начальный крутящий момент измерений (внешние: t_доб и внутренние: t_int) для последующего сравнения.
7. Для ПЗУ измерений используйте значения крутящего момента каждого животного на свои собственные базовые измерения (t_доб и t_int) как заданных входных переменных в программе для обнаружения изменений в ротации, Римлянам использовать базовые измерения как сравнительный остановки точка для последующих измерений ПЗУ. Изменения были обнаружены с разрешением 0,2 °.
8. Для измерения жесткости используйте оригинальные углы поворота наружного поворота 60° и 80° внутреннее вращение как пресет ввода в программе с целью обнаружения изменения крутящего момента. Изменения были обнаружены с разрешением 0,01 Nmm.
9. Вес животных в тот же день, как каждый ROM оценки. Поместите животных на весы и записывать их массы. Эти данные были использованы как один из инструментов для оценки состояния здоровья животных во время исследования.
10. После восстановления вернуть их клетках крыс и контролировать на наличие признаков боли или страданий. На протяжении тестирования, не животное присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
    Примечание: ROM и крутящий момент измерения были достигнуты с заказной устройством, ранее сообщили нашей группой {Вилла-Камачо 2015}. Устройство является заказное кондуктор, который состоит из вала повернут на шаговый двигатель и контролируется с помощью пользовательского сценария, MATLAB. Датчик крутящего момента и Блок инерционных измерения используются для захвата крутящий момент и позиции данных во время разработки образца.

6. Посмертные Immunohistologic анализ

1. В конце 8-недельного ROM измерения периода усыпить крыс с CO₂ экспозиции.
2. Вскрыть оба слева (прикол) и правый (здорового управления) плечи disarticulating плечевой кости из локтевой кости, а также секционирование лопатки от ключицы и грудной полости.
3. Исправить подакцизным плечи в растворе нейтрального буферизации формалина 10% в течение 3 дней, следуют декальцинации в растворе Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 10% при рН 7,4 еще 2 месяца.
4. В ходе этого процесса Поместите образцы на шейкер в цикле нежный агитации и хранить при 4 ° C. Следить за декальцинации плечелопаточного совместного с неделю microcomputed томография (uCT) сканирует.
   Примечание: EDTA — хелатирующий агент, который связывает ионы кальция от внешней поверхности кристалл апатита, постепенно сократить кристалл размер^12,,1314. Этот процесс является очень медленным и нежные, и она используется для выявления конкретных тканевых элементов, которые должны быть сохранены для методов, таких как иммуногистохимия (IHC). Скорость, с которой ЭДТА decalcifies образца зависит от pH и концентрации раствора. С точки зрения рН она может варьироваться от 7 до 7,4, с более щелочных растворов, ускоряя скорость декальцинации. Однако решения с более высоким уровнем рН может повредить ткани ключевые элементы. Кроме того обычной концентрации ЭДТА для таких экспериментов лежит от 10% до 14%, но это очень важно помнить, что активный агент становится исчерпаны после его облигаций кальция, поэтому для этого требуется замена жидкости декальцинации по крайней мере 3-4 раза за неделю¹⁵.
5. После того, как был завершен процесс декальцинации, смонтируйте плечевого суставов в парафин стеки для гистологической секционирование. Ориент образцы для корональные срезы. Ломтики полученные на глубине 50% плечевой головки (в центре, середина coronally) показано на рисунке 1. Выполните иммуногистохимическое окрашивание с помощью метода пероксидаза анти пероксидаза для обозначения присутствие фиброзных тканей в суставе. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. Выполнения извлечения антигена в микроволновом, погрузив слайды в пластиковых опарник Coplin в буферный раствор цитрата натрия (цитрат натрия 10 мм, 0,05% 20 анимации, pH 6.0, прогревается в течение 5 мин при температуре 95-100 ° C) и размещение в очередной Микроволновая печь 10 минут на средней мощности. Разрешить слайды остыть в течение 30 мин при комнатной температуре.
7. Выполнять блокирование с козу сыворотка для 30 минут и Проинкубируйте образцы с первичной мыши моно клоновых антитела (разбавления 1: 400) фибронектин на ночь при 4 ° C.
8. После инкубации с основного антитела, стирать образцы дважды с PBS (0,5 мкг/мл) на 10 минут; и проинкубируйте с вторичное антитело, коза antimouse IgG пероксидаза конъюгата (разбавления 1: 400) для 30 минут.
9. Стирать образцы дважды с PBS (2,5 мкг/мл) на шейкер для 10 минут и подвергать 3,30-Диаминобензидин тетрагидро хлорида и 30% перекиси водорода в темноте за 10 мин изображение с Carazzi гематоксилином.

Результаты

Диапазон движения

На последующий день 0, мы нашли 63% снижение в целом ROM, по сравнению с базовой (P <.001). Мы наблюдали постепенное улучшение ПЗУ до недели 5 последующих мер, когда прогрессии остановился на 19% ограничение (P < 0,001). Остальные огра?...

Обсуждение

Это исследование представляет модель крыса клей капсулит плеча через внутренней фиксации плечевого сустава. Кроме того он показывает расширенный сокращения общего ПЗУ для по крайней мере в 8 недель после удаления фиксации. Для того чтобы рассчитать изменения в ПЗУ в разное время точка...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus