Modelo do rato de capsulite adesiva do ombro

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo de rato in vivo de capsulite adesiva. O modelo inclui uma fixação interna da glenoumeral conjunta com a fixação da sutura extra-articulares por um tempo prolongado, resultando em uma diminuição da gama rotacional de movimento (ROM) e aumento de rigidez articular.

Resumo

Esta proposta visa criar um modelo do rato na vivo de capsulite adesiva para pesquisar potenciais opções de tratamento para esta condição e outras etiologias de arthrofibrosis comparáveis. O modelo inclui fixação extra articular do ombro em ratos através do escapulário a sutura do úmero, resultando em uma contratura secundária sem invadir o espaço intra-articular e resultando em diminuição da ROM rotacional e maior articulação rigidez.

Nós usamos 10 ratos Sprague-Dawley, para efeitos deste estudo. Linha de base ROM medidas foram feitas antes de imobilização glenoumeral. Os ratos foram submetidos a 8 semanas de imobilização antes que as suturas de fixação foram removidas e avaliaram-se as alterações na ROM e rigidez articular. Para avaliar se a imobilização resultou em uma redução significativa na ROM, calcularam-se mudanças na cinemática. ROM foi medido em cada ponto de tempo no período de seguimento e foi comparado com as medições de ROM de linha de base interna e externa. Para avaliar a rigidez, cinética conjunta foram calculados determinando as diferenças no torque (t_ext e t_int ) necessárias para alcançar a rotação externa inicial de 60 ° e rotação interna inicial de 80 °.

Após a remoção da fixação extra-articulares sutura no acompanhamento dia 0, encontramos uma diminuição de 63% no total ROM em comparação com a linha de base. Observamos melhoria contínua até a semana 5 de acompanhamento, com o progresso a abrandar em torno de uma restrição de 19%. Na semana 8 de follow-up, ainda havia uma restrição de 18% de ROM. Além disso, no seguimento dia 0, encontramos o torque aumentou 13,3 Nmm quando comparado à linha de base. Na semana 8, o torque total foi medido como sendo de 1,4 ± 0.2 Nmm superior medidas iniciais. Este trabalho apresenta um modelo do rato de capsulite adesiva de ombro com duração reduzida ROM e maior rigidez.

Introdução

Capsulite adesiva do ombro é frequentemente referido como ombro congelado ou contratura do ombro. É caracterizada por movimento restrito glenoumeral e dor, presumivelmente como resultado de fibrose avançada e contractura articular^1,2,3. A condição envolve o recrutamento de células de fibroblastos e Miofibroblasto com uma matriz de colagénio denso resultante (tipos I e III) no conjunto da cápsula^2,3. Existem muitos possíveis fatores de risco para o desenvolvimento de uma contractura articular, incluindo sexo, diabetes mellitus, hipertireoidismo, lesão traumática e imobilização prolongada^4,5,6.

Opções de tratamento eficazes são escassos e principalmente incluem a terapia física, com intervenção na forma de liberação cirúrgica em casos extremos que não melhoraram com o tratamento conservador. O melhor método de tratamento permanece indeterminado e tem sido um assunto de grande interesse para a área médica^7,8anos. Desenvolvimento de novas opções terapêuticas exigirá um modelo animal podem ser reproduzido para a condição de que não dependem de trauma induzido intra-articulares. O modelo ideal de capsulite adesiva deve envolver as duas características principais da doença: contratura da cápsula do ombro e uma redução prolongada na amplitude de movimento (ROM). Schollmeier et al ⁹ o primeiro modelo de contractura articular descrita usando um cast para desenvolver ombro contratura em caninos. Eles também relataram que as mudanças na pressão ROM e intra-articulares retornado aos níveis normais após a cessação da imobilização⁹. No entanto, uma limitação importante, mencionada no estudo é a variação na posição de membro entre os animais devido ao uso de uma técnica de elenco. A fim de obter um modelo mais reprodutível, et al . Kanno ¹⁰ mais tarde apresentou um modelo do rato de capsulite adesiva usando a fixação interna rígida do ombro. No entanto, embora eles alcançaram uma redução significativa na ROM com seu modelo, eles não indicou se essas mudanças foram temporário ou duradouro. O objetivo do nosso estudo era criar um adequado na vivo ombro contratura modelo do rato por investigar o efeito de imobilização de articulação glenoumeral extra-articulares prolongada na ROM e rigidez articular.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de uso no Beth Israel Deaconess Medical Center e institucional Cuidado Animal. Cuidado foi tomado para evitar anestesia prolongada desnecessária e também para evitar a hipotermia. Animais foram ponderados em cada sessão de medição ROM e monitorados para perda de peso.

1. sujeitos do estudo

1. Use 10 ratos Sprague-Dawley que são 13 semanas de idade no momento da cirurgia e que variam entre 250 e 300 g de peso corporal.

2. ato cirúrgico

1. Sob anestesia e antes da imobilização cirúrgica, medir o torque de base em função do ângulo de rotação entre 60° de rotação externa e 80° de rotação interna (Veja passo 5).
2. Induzir a anestesia com isoflurano 5% através da inalação em uma câmara de indução e então sustentar com 2% de isoflurano através de um cone de nariz durante a cirurgia.
   1. Use um elemento de aquecimento à base de água sob o animal para manter a temperatura corporal durante a anestesia.
   2. Para fins de controle da dor, administre buprenorfina liberação sustentada por via subcutânea na dose de 1,2 mg/kg, dependendo do peso do corpo do rato.
3. Imobilizar a esquerda glenoumeral juntas em um ângulo de 60 graus de abdução (o ângulo entre o eixo do úmero e escápula espinha)^{10 , 11}.
   1. Inicie o procedimento cirúrgico com uma incisão longitudinal posterior, paralelo à diáfise do úmero. Fazer a incisão de pele logo abaixo da glenoumeral conjunta e estender-se por cerca de 3 cm.
   2. Use 2 suturas (poliéster trançado) para imobilizar a articulação glenoumeral, perfurando através da borda lateral da escápula e próximo a distal de dois terços do eixo umeral e posteriormente apertar conforme ilustrado na figura 1A. Leve o esforço extra para evitar constrição estruturas críticas como a artéria braquial.
      Nota: A técnica cirúrgica tem uma vantagem de ser capaz de limitar a articulação glenoumeral a 60° de abdução (Z) sem afetar outros planos (X & Y). Colocando-se suturas em torno do úmero e pela borda lateral da escápula, uma aproximação das duas estruturas é alcançada e mantida no plano escapular lâmina. Depois de apertar as suturas, o braço é fixo na posição de repouso quando considerando X & Y aviões e 60 ° de abdução quando Z plane é considerado. Isto é pensado para limitar a variabilidade entre os animais que podem ser gerados de falha de afinar a posição conjunta nos três planos.

3. fechamento da incisão

1. Após a hemostasia adequada, feche a incisão de pele usando clipes de pele.
2. Descontinuar a anestesia e permitir que o animal recuperar sob supervisão num ambiente quente. Depois que o animal recupere a consciência suficiente para manter a prostração esternal, devolvê-lo de volta para sua gaiola.
3. Imediatamente após o procedimento, permitir que os animais voltar à atividade normal. Permitir que os animais possam se mover sem restrição, baseando-se principalmente em suturas internas para fixar a articulação glenoumeral.
4. Para monitorar para possível infecção, inspecione os locais de incisão diariamente durante a primeira semana pós-operatória.
5. Remova os clipes de ferida sobre o 10^º dia após a cirurgia.
   Nota: Não houve nenhuma manipulação dos músculos durante o procedimento, e a técnica não envolvia qualquer trauma intra-articulares, preservando assim capsular e articular a continuidade e integridade anatômica. Nenhuma limitação de conter nem atividade externa foi seguida em nosso protocolo.
6. Proporcionar analgesia usando liberação sustentada buprenorfina, injetado por via subcutânea na dose de 1,2 mg/kg, começando na indução da anestesia e repetido a cada 72 h, se necessário.

4. sutura remoção 8 semanas após a imobilização

1. Induzir a anestesia com isoflurano 5% através da inalação em uma câmara de indução e, em seguida, sustentado com 2% de isoflurano através de um cone de nariz durante a cirurgia. Para fins de controle da dor, administre buprenorfina liberação sustentada por via subcutânea na dose de 1,2 mg/kg, dependendo do peso do corpo do rato.
2. Fazer uma incisão na parte superior a cicatriz do procedimento anterior.
3. Cortar as suturas e remover do úmero e escápula.
4. Feche a incisão com clipes de ferida.
5. Examine o local da incisão diariamente durante a primeira semana para detectar sinais de infecção. Monitorar a dor e o sofrimento também.
6. Remova os clipes de ferida sobre o 10^º dia após a cirurgia.

5. amplitude de movimento e rigidez articular medições

1. Medir a mecânica ROM e passiva do ombro, antes e depois da imobilização usando um dispositivo personalizado que consiste de uma braçadeira de braço, um conjunto de sensor e um giro do eixo¹¹. Isto é realizado pré-operatório (linha de base) e continuamente após a remoção da sutura.
   1. ROM de medida imediatamente após a remoção da sutura (acompanhamento dia 0) e posteriormente, duas vezes por semana.
   2. Reduza as medidas para uma vez por semana, com menos de 10% de gravação mudar de ponto de tempo anterior.
      Nota: Depois de testar a ROM por semanas, a ROM de cada animal não mudaram drasticamente entre pontos de tempo de teste (menos de 10% mudam). O ROM parecia planalto neste ponto, portanto, nós sentimos que, diminuindo a frequência de teste de duas vezes por semana a vez por semana era suficiente.
2. Efectue medições sob anestesia utilizando isoflurano através de vaporizador de precisão em 5% para a indução e 2% para manutenção para o comprimento total do procedimento (aproximadamente 5 minutos), para facilitar as medições com eficiência. Use um elemento de aquecimento à base de água sob o animal para manter a temperatura corporal durante a anestesia.
3. Posição do animal corretamente para medição ROM com o auxílio de um guia de laser. Posição do membro anterior sobre a braçadeira de braço em flexão de 90° para a frente, com o sensoriamento eixo alinhado com o eixo longitudinal do úmero. Segura o membro anterior pelo pulso e cotovelo conforme ilustrado na figura 1B.
4. Controlar a rotação passiva membro anterior por um motor de passo para avaliar a ROM e torque de forma consistente. O motor de passo com um microcontrolador de controle. Uso de insumos do inclinômetro, em conjunto com os de um sensor de torque para indicar o início e término das medições.
5. Conecte o microcontrolador a um computador e controle usando um código MATLAB desenvolvido in-house.
6. Para as medições de base apenas, ciclo o conjunto sensor 3 vezes entre 60° de rotação externa e 80° de rotação interna para obter medições de torque inicial (externo: t_ext e interno: t_int) para posterior comparação.
7. Para medições de ROM, usar os valores de torque de cada animal em suas próprias medições de linha de base (t_ext e t_int) como variáveis de entrada predefinidas no programa para detectar alterações na rotação ROM. Use as medidas da linha de base como um comparativo parando ponto para medições posteriores de ROM. Com uma resolução de 0,2 °, foram detectadas alterações.
8. Para medições de rigidez, use os ângulos de rotação original de rotação externa de 60° e 80° de rotação interna como entrada predefinida no programa a fim de detectar alterações no torque. Foram detectadas alterações com uma resolução de 0,01 Nmm.
9. Pese os animais no mesmo dia como cada ROM avaliação. Coloque os animais em escalas e gravar suas massas. Estes dados foram utilizados como uma das ferramentas para avaliar o estado sanitário durante o estudo.
10. Após a recuperação, retorno ratos de suas gaiolas e monitorar sinais de dor ou aflição. Durante este teste, nenhum animal é abandonado até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
    Nota: As medições de ROM e torque foram alcançadas com um dispositivo personalizado, anteriormente relatado pelo nosso grupo {Villa-Camacho 2015}. O dispositivo é um gabarito feito sob medido que consiste em um eixo girado pelo motor de passo e controlado por um script personalizado do MATLAB. Uma unidade de medida inercial e sensor de torque são usados para capturar o torque e posição de dados durante a articulação da amostra.

6. post-mortem Immunohistologic análise

1. No final do período de medição ROM 8 semanas, eutanásia em ratos com exposição de CO₂ .
2. Dissecar os dois à esquerda (imobilizado) e direito de ombros (controle saudável) por próativas úmero da ulna e secionando a escápula da clavícula e da cavidade torácica.
3. Corrigi os ombros extirpados em uma solução de formol tamponado a 10% neutro por 3 dias, seguido de descalcificação em uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido 10% em pH 7,4 por mais 2 meses.
4. Durante esse processo, colocar as amostras em um shaker em um ciclo de agitação suave e armazenar a 4 ° C. Monitorar a descalcificação da glenoumeral conjunta com exames de tomografia computadorizada (uCT) semanal microcomputed.
   Nota: O EDTA é um agente quelante que se liga a íons cálcio da superfície exterior de cristal de apatita, progressivamente, reduzindo o tamanho de cristal^12,13,14. Este processo é muito lento e suave, e é usado para detectar elementos de tecido específico que devem ser preservados para técnicas como a imuno-histoquímica (IHC). A taxa na qual o EDTA decalcifies a amostra é dependente do pH e a concentração da solução. Em termos de pH, ela pode variar de 7 a 7,4, com soluções mais alcalinas, acelerando a velocidade de descalcificação. No entanto, soluções com níveis mais elevados de pH podem danificar elementos chave do tecido. Além disso, a concentração de EDTA usual para tais experiências situa-se entre 10% a 14%, mas é muito importante lembrar que o agente ativo torna-se esgotado, uma vez que títulos de cálcio, por isso requer a substituição do fluido descalcificação pelo menos 3 a 4 vezes por semana¹⁵.
5. Foi concluído o processo de descalcificação, monte as articulações glenoumeral em pilhas de parafina para corte histológico. Oriente as amostras para permitir fatias coronais. As fatias obtidas a profundidade de 50% da cabeça do úmero (no centro, meados-no) são mostrados na Figura 1. Execute usando o método da peroxidase-anti-peroxidase para denotar a presença de tecido fibrótico na articulação de coloração imuno-histoquímica. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. Executar a recuperação do antígeno por irradiação de microondas submergindo os slides em uma jarra de Coplin plástica em uma solução tampão de citrato de sódio (citrato de sódio de 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6.0, pré-aquecido por 5 min a 95 – 100 ° C) e coloc em um forno de microonda regular por 10 minutos na potência média. Permita slides esfriar por 30 min à temperatura ambiente.
7. Realizar bloqueio com soro de cabra por 30 min e incube-os espécimes com um anticorpo mono-clonal mouse principal (diluição de 1: 400) para fibronectina durante a noite a 4 ° C.
8. Após a incubação com o anticorpo primário, lavar as amostras duas vezes com PBS (0,5 µ g/mL) por 10 minutos; e incubar com um anticorpo secundário, conjugado de IgG-peroxidase antimouse cabra (diluição de 1: 400) por 30 minutos.
9. Lavar as amostras duas vezes com PBS (2,5 µ g/mL) num agitador por 10 minutos e expor a 3,30-diaminobenzidina tetrahidro-cloreto e 30% peróxido de hidrogênio no escuro por 10 min. corante de contraste com hematoxilina de Carazzi.

Resultados

Amplitude de movimento

No acompanhamento dia 0, encontramos uma diminuição de 63% no total ROM em comparação com a linha de base (P <.001. Observamos uma melhoria gradual da ROM até a semana 5 de follow-up, quando parou de progressão na restrição de 19% (P < 0,001). A restrição restante, 18% do total ROM, era ainda aparente em 8 semanas de acompanhamento (P < 0,001).

Discussão

Este estudo apresenta um modelo do rato de capsulite adesiva do ombro através da fixação interna da articulação glenoumeral. Além disso, ele mostra uma redução prolongada da ROM total pelo menos 8 semanas após a remoção da fixação. Para calcular as alterações na ROM em pontos diferentes do tempo, as medições foram comparadas com animais específicas das linhas de base. Por outro lado, Kanno et al ¹⁰ usado um torque padronizado para todos os animais a fim de determinar as ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus