Modello del ratto di capsulite adesiva della spalla

Riepilogo

Questo protocollo rappresenta un modello di ratto in vivo del capsulitis adesivo. Il modello include una fissazione interna del giunto glenohumeral con fissazione del suturare extra-articolari per un tempo prolungato, risultante in una gamma di rotazione in diminuzione di movimento (ROM) e una maggiore rigidità articolare.

Abstract

Questa proposta mira a creare un modello di ratto in vivo del capsulitis adesivo per la ricerca di possibili opzioni di trattamento per questa circostanza ed altre eziologie di artrofibrosi comparabili. Il modello include fissaggio extra-articolare della spalla in ratti via scapolare a sutura omerale, risultante in una contrattura secondaria senza invadere lo spazio intra-articolare e conseguente diminuzione ROM rotazionale e maggiore articolazione rigidezza.

Abbiamo usato 10 ratti Sprague-Dawley allo scopo di questo studio. Misurazioni di ROM di base sono state prese prima immobilizzazione gleno-omerale. I ratti sono stati sottoposti a 8 settimane di immobilizzazione prima sono state rimosse le suture di fissazione e cambiamenti in ROM e rigidità articolare sono stati valutati. Per valutare se l'immobilizzazione ha provocato una riduzione significativa nella ROM, cambiamenti nella cinematica sono stati calcolati. ROM è stato misurato in ogni momento nel periodo di follow-up ed è stato confrontato con le misurazioni ROM di base, interni ed esterni. Al fine di valutare la rigidità, la cinetica congiunta sono state calcolate determinando le differenze nella coppia (t_ext e t_int ) necessarie per raggiungere la rotazione esterna iniziale di 60 ° e rotazione interna iniziale di 80 °.

Dopo la rimozione del fissaggio del suturare extra-articolari, il follow-up giorno 0, abbiamo trovato una riduzione del 63% in totale ROM rispetto al basale. Abbiamo osservato il miglioramento continuo fino alla settimana 5 del follow-up, con il progresso rallentando intorno una restrizione del 19%. Settimana 8 di follow-up, c'era ancora una limitazione di 18% di ROM. Inoltre, il follow-up giorno 0, abbiamo trovato la coppia aumentata di 13,3 Nmm quando rispetto al basale. Settimana 8, la coppia totale è stata misurata per essere 1,4 ± 0,2 Nmm superiore misure iniziali. Questo lavoro presenta un modello del ratto di spalla capsulitis adesivo con durata ridotta ROM e una maggiore rigidità.

Introduzione

Capsulite adesiva della spalla si riferisce spesso come spalla congelata o contrattura spalla. Essa è caratterizzata da movimento gleno-omerale con restrizioni e dolore, presumibilmente come conseguenza di fibrosi avanzata e contrattura^1,2,3. La circostanza coinvolge il reclutamento delle cellule dei fibroblasti e dei miofibroblasti con una matrice di collageno denso risultante (tipo I e III) nel comune capsula^2,3. Ci sono molti possibili fattori di rischio per lo sviluppo di una contrattura, tra cui sesso, diabete mellito, ipertiroidismo, lesioni traumatiche e immobilizzazione prolungata^4,5,6.

Opzioni di trattamento efficaci sono carenti e principalmente includono la terapia fisica, con intervento sotto forma di rilascio chirurgico nei casi estremi che non sono migliorate con cura conservatrice. Il miglior metodo di trattamento rimane indeterminato ed è stato un argomento di grande interesse per anni nel campo medico^7,8. Sviluppo di nuove opzioni terapeutiche richiedono un modello animale riproducibile per la condizione che non si basa sul trauma indotto intra-articolare. Il modello ottimale capsulitis adesivo dovrebbe coinvolgere le due caratteristiche principali della malattia: contrattura della capsula spalla ed una prolungata riduzione nella gamma di movimento (ROM). Schollmeier et al. ⁹ uno dei primi modelli di contrattura descritto utilizzando un cast per sviluppare contrattura della spalla in canini. Essi hanno inoltre riferito che i cambiamenti nella pressione intra-articolare e ROM rinviato ai livelli normali dopo cessazione di immobilizzazione⁹. Tuttavia, una limitazione importante menzionata nello studio è la variazione nella posizione del membro tra animali a causa dell'uso di una tecnica di fusione. Al fine di ottenere un modello più riproducibile, Kanno et al. ¹⁰ successivamente presentato un modello di ratto capsulitis adesivo mediante fissazione interna rigida della spalla. Tuttavia, anche se hanno ottenuto una riduzione significativa nella ROM con il loro modello, essi non ha indicato se questi cambiamenti sono stati temporanei o di lunga durata. Lo scopo del nostro studio era per creare un modello adatto in vivo spalla contrattura del ratto studiando l'effetto di immobilizzazione giunto glenohumeral extra-articolari prolungato su ROM e rigidità articolare.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal comitato di uso al Beth Israel Deaconess Medical Center e istituzionali Animal Care. Cura è stata presa per evitare inutile anestesia prolungata e anche per evitare l'ipotermia. Gli animali erano ponderati ad ogni sessione di misurazione ROM e monitorati per la perdita di peso.

1. gli oggetti di studio

1. Utilizzare 10 ratti Sprague-Dawley che sono 13 settimane di età al momento della chirurgia e comprese tra 250 – 300 g di peso corporeo.

2. intervento chirurgico

1. Nell'ambito dell'anestesia e prima immobilizzazione chirurgica, misurare la coppia di base in funzione dell'angolo di rotazione tra i 60° di rotazione esterna e 80° di rotazione interna (vedi passo 5).
2. Inducono anestesia con isoflurano 5% per inalazione in un'aula di induzione e quindi sostenere con isoflurano 2% attraverso un cono di naso durante l'intervento chirurgico.
   1. Utilizzare un elemento di riscaldamento base d'acqua sotto l'animale per mantenere la temperatura corporea durante l'anestesia.
   2. Ai fini del controllo del dolore, amministrare rilascio prolungato buprenorfina per via sottocutanea alla dose di 1,2 mg/kg a seconda del peso corporeo del ratto.
3. Immobilizzare il gleno-omerale sinistra giunti ad un angolo di 60 ° di abduzione (l'angolo tra il pozzo humeral e spina dorsale scapular)^{10 , 11}.
   1. Avviare la procedura chirurgica con un'incisione longitudinale posteriore, parallelo al pozzo humeral. Fare l'incisione cutanea appena sotto il gleno-omerale comune e si estendono per circa 3 cm.
   2. Utilizzare 2 suture (poliestere) per immobilizzare l'articolazione gleno-omerale, forando attraverso il bordo laterale della scapola e dintorni i due terzi distali del pozzo humeral e successivamente stringere come illustrato in Figura 1A. Prendere sforzo supplementare per evitare di comprimere le strutture critiche come l'arteria brachiale.
      Nota: La tecnica chirurgica ha un vantaggio di essere in grado di limitare l'articolazione gleno-omerale a 60° di abduzione (Z) senza influenzare altri piani (X & Y). Inserendo le suture attraverso il bordo laterale della scapola e dell'omero, un'approssimazione delle due strutture è raggiunto e mantenuta sul piano della lama scapolare. Dopo aver serrato i punti di sutura, il braccio è fissato in posizione di riposo quando si considera gli aerei X & Y e a 60° di abduzione quando è considerato piano Z. Questo è pensato per limitare la variabilità tra gli animali che potrebbero essere generati da errori di messa a punto la posizione congiunta nei tre piani.

3. chiudere l'incisione

1. Dopo adeguata emostasi, chiudere l'incisione cutanea utilizzando pelle clip.
2. Interrompere l'anestesia e permettere all'animale di recuperare sotto controllo in un ambiente caldo. Dopo che l'animale riprenda coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale, restituirlo torna alla sua gabbia.
3. Immediatamente dopo la procedura, è necessario consentire agli animali tornare alla normale attività. Consentire agli animali di spostarsi senza restrizione, basandosi principalmente su suture interne per fissare l'articolazione gleno-omerale.
4. Per monitorare l'infezione possibile, ispezionare i siti di incisione al giorno durante la prima settimana postoperatoria.
5. Rimuovere le graffe di ferita al 10^° giorno dopo l'intervento chirurgico.
   Nota: Non c'era nessuna manipolazione dei muscoli durante la procedura e la tecnica non ha comportato alcun trauma intra-articolare, preservando in tal modo continuità capsulare e articolare e l'integrità anatomica. Né limitazione trattenga nè l'attività esterna è stata seguita nel nostro protocollo.
6. Fornire analgesia mediante rilascio prolungato buprenorfina, iniettato per via sottocutanea alla dose di 1,2 mg/kg a partire da induzione di anestesia e ripetuto ogni 72 ore se necessario.

4. sutura rimozione 8 settimane dopo immobilizzazione

1. Inducono anestesia con isoflurano 5% per inalazione in un'aula di induzione, quindi sostenuta con isoflurano 2% attraverso un cono di naso durante l'intervento chirurgico. Ai fini del controllo del dolore, amministrare rilascio prolungato buprenorfina per via sottocutanea alla dose di 1,2 mg/kg a seconda del peso corporeo del ratto.
2. Fare un'incisione sopra la cicatrice dalla procedura precedente.
3. Tagliare le suture e rimuovere da Omero e scapola.
4. Chiudere l'incisione con clip di ferita.
5. Esaminare il sito di incisione al giorno durante la prima settimana per rilevare eventuali segni di infezione. Monitorare il dolore e l'angoscia pure.
6. Rimuovere le graffe di ferita al 10^° giorno dopo l'intervento chirurgico.

5. gamma di movimento e rigidità articolare misure

1. Misurare la meccanica ROM e passiva spalla prima e dopo immobilizzazione utilizzando un dispositivo su misura costituito da una pinza, un gruppo sensore e un asse girevole¹¹. Questa operazione viene eseguita pre-operatively (baseline) e continuamente dopo la rimozione della sutura.
   1. Misura ROM immediatamente dopo la rimozione della sutura (follow-up giorno 0) e successivamente due volte a settimana.
   2. Ridurre le misure di una volta alla settimana, al momento di registrazione inferiore al 10% cambiare dal punto precedente tempo.
      Nota: Dopo aver testato ROM per settimane, la ROM di ogni animale non ha cambiato drasticamente tra punti di tempo di prova (meno del 10% cambiare). La ROM sembrava al plateau a questo punto, di conseguenza, ci siamo sentiti che diminuendo la frequenza test da due volte a settimana a una volta a settimana era sufficiente.
2. Effettuare misurazioni in anestesia usando isoflurano via precisione vaporizzatore al 5% per induzione e 2% per la manutenzione per tutta la lunghezza della procedura (circa 5 minuti), al fine di agevolare misure in modo efficiente. Utilizzare un elemento di riscaldamento base d'acqua sotto l'animale per mantenere la temperatura corporea durante l'anestesia.
3. Posizionare l'animale correttamente per misura ROM con l'aiuto di una guida laser. Posizione la zampa anteriore sul morsetto del braccio a 90° di flessione in avanti, con l'asse di rilevamento allineato con l'asse longitudinale dell'omero. Fissare l'arto anteriore di polso e del gomito come illustrato in Figura 1B.
4. Controllare la rotazione passiva degli arti anteriori da un motore passo-passo per valutare la ROM e la coppia in modo coerente. Controllo del motore passo-passo con un microcontrollore. Utilizzare gli ingressi dall'inclinometro, in combinazione con quelli provenienti da un sensore di coppia per indicare l'inizio e la fine delle misurazioni.
5. Collegare il microcontrollore a un computer e controllo mediante un codice MATLAB sviluppato in-House.
6. Per le misurazioni di base ciclo solo, il gruppo sensore 3 volte tra il 60° di rotazione esterna e 80° di rotazione interna per ottenere misure di coppia iniziale (esterno: t_ext e interno: t_int) per un confronto successivo.
7. Per misure di ROM, utilizzare i valori di coppia di ogni animale alle proprie misurazioni di base (t_ext e t_int) come variabili di input preimpostate nel programma per rilevare le modifiche in rotazione ROM. utilizzare le misurazioni di base come una comparativa arresto punto per misure successive ROM. Sono state rilevate modifiche con una risoluzione di 0,2 °.
8. Per misure di rigidezza, è possibile utilizzare l'originale angoli di rotazione di 60° rotazione esterna e rotazione interna 80° come input preimpostato nel programma al fine di rilevare le modifiche in coppia. Con una risoluzione di 0,01 Nmm sono state rilevate modifiche.
9. Pesare gli animali sullo stesso giorno di ogni valutazione di ROM. Sistemare gli animali sulle scale e registrare le loro messe. Questi dati sono stati utilizzati come uno degli strumenti per valutare lo stato di salute degli animali durante lo studio.
10. A seguito del recupero, tornare ratti loro gabbie e controllare per i segni di dolore o angoscia. Durante questo test, nessun animale viene lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.
    Nota: Misure ROM e la coppia sono stati raggiunti con un dispositivo personalizzato, precedentemente segnalato dal nostro gruppo {Villa-Camacho 2015}. Il dispositivo è un jig su misura che consiste di un albero ruotato per motore passo-passo e controllato da uno script personalizzato di MATLAB. Un sensore di coppia e l'unità di misura inerziale sono utilizzati per catturare la coppia e dati di posizione durante l'articolazione dell'esemplare.

6. post-mortem Immunohistologic analisi

1. Alla fine del periodo di misurazione ROM 8 settimane, eutanasia ratti con esposizione di CO₂ .
2. Sezionare entrambi sinistra (immobilizzato) e spalle (controllo sano) a destra di scomposizione dell'omero da ulna e sezionando la scapola dalla clavicola e la cavità toracica.
3. Difficoltà le spalle asportate in una soluzione di formalina neutra tamponata 10% per 3 giorni, seguita da decalcificazione in una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) l'acido 10% a pH 7.4 per altri 2 mesi.
4. Durante questo processo, i campioni su un agitatore in un ciclo di movimentazione delicata e conservare a 4 ° C. Monitorare la decalcificazione del giunto con esplorazioni di tomografia (uCT) settimanale microtomografia glenohumeral.
   Nota: L'EDTA è un agente chelante che lega gli ioni del calcio dalla superficie esterna del cristallo di apatite, riducendo progressivamente il cristallo formato^12,13,14. Questo processo è molto lento e delicato, e permette di rilevare gli elementi specifici del tessuto che devono essere conservati per tecniche quali immunohistochemistry (IHC). Il tasso al quale l'EDTA decalcifica l'esemplare è dipenda il pH e la concentrazione della soluzione. In termini di pH, può variare da 7 a 7.4, con soluzioni più alcalini, accelerando la velocità di decalcificazione. Tuttavia, soluzioni con più elevati livelli di pH possono danneggiare gli elementi chiave del tessuto. Inoltre, la concentrazione di EDTA usuale per tali esperimenti si trova tra il 10% al 14%, ma è molto importante ricordare che l'agente attivo si esaurisce una volta che si lega al calcio, quindi questo richiede la sostituzione del fluido Decalcificazione almeno 3 o 4 volte ogni settimana¹⁵.
5. Una volta concluso il processo di decalcificazione, montare le articolazioni gleno-omerale in pile di paraffina per il sezionamento istologico. Orientare i campioni per consentire fette coronali. Fette ottenute alla profondità di 50% della testa omerale (al centro, metà-coronalmente) sono mostrati nella Figura 1. Eseguire la macchiatura di immunohistochemical che usando il metodo della perossidasi-anti-perossidasi per indicare la presenza di tessuto fibrotico nel giunto. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. Eseguire il ricupero dell'antigene di irradiazione a microonde immergendo i vetrini in una vaschetta di Coplin in plastica in una soluzione tampone citrato di sodio (citrato di sodio di 10 mM, 0,05% di Tween 20, pH 6.0, preriscaldato per 5 minuti a 95 – 100 ° C) e l'immissione in un normale forno a microonde per 10 minuti a potenza media. Lasciare raffreddare per 30 min a temperatura ambiente vetrini.
7. Eseguire il blocco con il siero di capra per 30 min e incubare i campioni con un anticorpo mono-clonale del mouse primario (diluizione 1: 400) al fibronectin durante la notte a 4 ° C.
8. Dopo incubazione con anticorpo primario, lavare gli esemplari due volte con PBS (0,5 ug/mL) per 10 minuti; e incubare con un anticorpo secondario, coniugato IgG-perossidasi anticalprotectina (diluizione 1: 400) di capra per 30 minuti.
9. Lavare gli esemplari due volte con PBS (2,5 µ g/mL) su un agitatore per 10 minuti ed esporre a 3,30-diaminobenzidina tetrahydro-cloruro e 30% perossido di idrogeno al buio per 10 min. colorazione di contrasto con ematossilina Carazzi.

Risultati

Gamma di movimento

Il follow-up giorno 0, abbiamo trovato una riduzione del 63% in totale ROM rispetto al basale (P <.001. Abbiamo osservato un miglioramento graduale della ROM fino alla settimana 5 del follow-up, quando progressione fermato a 19% restrizione (P < 0,001). La restrizione rimanente, il 18% del totale ROM, era ancora evidente a 8 settimane di follow-up (P < 0,001).

Discussione

Questo studio presenta un modello del ratto del capsulitis adesivo della spalla attraverso la fissazione interna del giunto glenohumeral. Inoltre, Mostra un'estesa riduzione del totale ROM per almeno 8 settimane dopo la rimozione della fissazione. Al fine di calcolare le alterazioni nella ROM in diversi momenti, misurazioni sono stati confrontati alle linee di base degli animali specifici. Al contrario, Kanno et al. ¹⁰ usato una coppia standardizzata per tutti gli animali al fine di deter...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus