עכברוש מודל של דלקות מדבקות. פגיעות של הכתף

Summary

פרוטוקול זה מציג מודל עכברוש ויוו של דלקות מדבקות. פגיעות. המודל כולל תיקון של glenohumeral משותפת עם קיבוע תפר מפרקיות במיוחד למשך זמן ממושך, וכתוצאה מכך מגוון המסתובבת ירידה של תנועה (ROM) וקשיחות מוגברת משותפת.

Abstract

הצעה זו שואפת ליצור מודל עכברוש ויוו של דלקות מדבקות. פגיעות עבור לחקור אפשרויות טיפול פוטנציאלי עבור תנאי זה, אחרים אטיולוגיה של arthrofibrosis דומות. המודל כולל קיבוע במיוחד במפרק הכתף של חולדות באמצעות הגלימה כדי תפירת המפרק, וכתוצאה הקופסית משני ללא פולשים לשטח תוך-מפרקיות, וכתוצאה מכך ירידה ROM סיבובי מפרק מוגברת נוקשות.

השתמשנו 10 חולדות ספראג-Dawley לצורך מחקר זה. למדידות ROM בסיסית צולמו לפני glenohumeral הנייח. העכברים עברו 8 שבועות של קיבעון לפני קיבוע התפרים הוסרו, שינויים ב ROM וקשיחות משותפת הוערכו. כדי להעריך אם הנייח הביא לירידה משמעותית ב- ROM, חושבו לשינויים קינמטיקה. ROM נמדד בכל נקודה בזמן תקופת המעקב, הושווה בסיסית פנימיים וחיצוניים ROM המדידות. על מנת להעריך את נוקשות, קינטיקה משותפת חושבו על-ידי קביעת ההבדלים מומנט (t_ext ו- t_int ) בכדי להגיע הסיבוב החיצוני הראשוני של 60 מעלות וסיבוב פנימי הראשונית של 80 מעלות.

לאחר הסרת הקיבעון תפר מפרקיות במיוחד ביום מעקב 0, מצאנו ירידה 63% סה כ ROM בהשוואה בסיסית. הבחנו שיפור מתמשך עד שבוע 5 של מעקב, עם התקדמות האטה סביב מגבלה 19%. בשבוע 8 של מעקב, עדיין היו 18% ההגבלה של ROM. בנוסף, על המשך יום 0, מצאנו את מומנט עלה ב- 13.3 Nmm בהשוואה בסיסית. בשבוע 8, מומנט הכולל נמדדה להיות 1.4 ± 0.2 Nmm גבוה יותר מדידות הראשונית. עבודה זו מציגה מודל עכברוש של הכתף דלקות מדבקות. פגיעות עם תוצאות ארוכות ROM מופחתת וקשיחות מוגברת.

Introduction

דלקות מדבקות. פגיעות של הכתף נקרא לעתים קרובות כמו כתף קפואה, או כתף הקופסית. הוא מאופיין על-ידי glenohumeral המוגבלים בתנועה וכאב, ככל הנראה כתוצאה פיברוזיס מתקדם של הקופסית משותפת^1,2,3. התנאי קשור גיוס תא פיברובלסט ו- myofibroblast עם מטריצה הנובעת קולגן צפוף (סוגי I ו- III) של קפסולה משותף^2,3. ישנם גורמי סיכון אפשריים רבים לפיתוח של הקופסית משותף, כולל מגדר, סוכרת, יתר של בלוטת התריס, פגיעה ממושכת הנייח-^4,-^5,-⁶.

אפשרויות טיפול יעיל חסרים וכוללים בעיקר פיזיותרפיה, עם התערבות בדמות בתחבושת במקרים קיצוניים, זה לא השתפר עם טיפול שמרני. שיטת הטיפול הטובה ביותר כינוי, היה נושא עניין רב שנים ב-^7,רפואי בתחום⁸. פיתוח של אפשרויות טיפוליות הרומן יחייב מודל בעלי חיים לשחזור למצב זה אין להסתמך על טראומה מושרה תוך-מפרקיות. המודל האופטימלי דלקות מדבקות. פגיעות כדאי לערב לשני המאפיינים העקריים של המחלה: הקופסית של הקפסולה הכתף, ירידה ממושכת טווח התנועה (ROM). . Schollmeier et al. ⁹ תיאר את אחד הדגמים הראשונים של הקופסית משותפת באמצעות גבס לפתח כתף הקופסית ב הולכי על ארבע. כמו כן דווח כי שינויים בלחץ ROM ותוך-מפרקיות חזרה לרמות נורמליות לאחר הפסקת הנייח⁹. עם זאת, מגבלה חשוב הזכיר במחקר הוא וריאציית במיקום האיבר בין בעלי חיים בגלל השימוש של טכניקה יצוקה. על מנת לקבל יותר לשחזור דוגמן, Kanno. et al. ¹⁰ לאחר מכן הציג מודל עכברוש דלקות מדבקות. פגיעות בעזרת קיבוע פנימי נוקשה של הכתף. עם זאת, למרות שהם מושגת הפחתה משמעותית ב- ROM עם המודל שלהם, הם לא מדינה אם שינויים אלה היו זמני או לאורך זמן. מטרת המחקר שלנו היתה ליצור מתאימים ויוו הכתף הקופסית עכברוש דוגמנית על ידי חקירת ההשפעה של קיבעון משותפת glenohumeral מפרקיות במיוחד ממושכת על ROM וקשיחות משותפת.

Protocol

המחקר אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה-המרכז הרפואי בית ישראל מסדר הדיאקוניסות. הוקדשה כדי להימנע הרדמה ממושך מיותר וגם כדי למנוע היפותרמיה. בעלי חיים היו משוקלל בישיבת לכל המדידות ROM, פיקוח עבור הרזיה.

1. נושאי הלימוד

1. השתמש 10 חולדות ספראג-Dawley כי הם 13 שבועות בזמנו של הניתוח, זה נע בין 250-300 גרם של משקל הגוף.

2. ניתוח

1. תחת הרדמה ולפני הנייח כירורגי, למדוד את מומנט בסיסית כפונקציה של זווית סיבוב בין 60 מעלות של סיבוב חיצוני 80 מעלות של סיבוב פנימי (ראה שלב 5).
2. לגרום הרדמה עם 5% איזופלוריין באמצעות אינהלציה בלשכת הגיוס ולאחר מכן לקיים עם 2% איזופלוריין דרך קונוס האף במהלך הניתוח.
   1. השתמש אלמנט חימום על בסיס מים מתחת החיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הרדמה.
   2. לצורך בקרת הכאב, לנהל שחרור-מתמשכת. הבופרנורפין subcutaneously במינון של 1.2 מ"ג/ק"ג בהתאם למשקל הגוף של החולדה.
3. Immobilize glenohumeral השמאלי תפרי בזווית של ° 60 של חטיפה (הזווית שבין ציר המפרק בעמוד השדרה השכמה)^{10 , 11}-
   1. להתחיל את הליך כירורגי עם חתך אורכי האחורי, במקביל הפיר המפרק. . לבצע את החתך בעור מתחת glenohumeral משותפת ולהרחיב על 3 ס מ.
   2. השתמש 2 תפרים (פוליאסטר קלוע) כדי לשתק את המקום glenohumeral, על ידי פירסינג דרך קצה לרוחב של הסקאפולה וליד דיסטלי לשני שליש הפיר המפרק, והדק לאחר מכן כמופיע ב איור 1A. קח מאמץ נוסף כדי למנוע חנק מבנים קריטיים כגון עורק הזרוע.
      הערה: בטכניקה כירורגית יש יתרון של היכולת להגביל את המקום glenohumeral על 60° החטיפה (Z) מבלי להשפיע על תוכניות אחרות (X & Y). על ידי הצבת התפרים סביב הזרוע, דרך הגבול הלטראלי של עצם השכם, הערכה של שני המבנים מושגת, ומתוחזק על המטוס להב השכמה. לאחר הידוק התפרים, הזרוע הוא קבוע במיקום מנוחתו כששוקלים את מטוסי X & Y, על 60° החטיפה כאשר המטוס Z נחשב. זה נחשב להגביל את השתנות בין החיות אשר עלול להיווצר מתוך הכישלון של משובח כוונון העמדה המשותפת משלוש התוכניות.

3. סוגרים את החתך

1. לאחר hemostasis נכונה, סגור את החתך בעור באמצעות קטעי עור.
2. להפסיק את ההרדמה ולאפשר את החיה להתאושש תחת פיקוח בסביבה חמה. אחרי החיה להכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות, להחזיר אותו בחזרה לכלוב שלו.
3. מיד לאחר הניתוח, לאפשר את החיות לחזור לפעילות רגילה. לאפשר את בעלי החיים ללא הגבלה, מסתמך בעיקר על תפרים פנימיים כדי לתקן את המקום glenohumeral.
4. כדי לפקח על חשד לזיהום, לבדוק את האתרים החתך מדי יום במהלך השבוע שלאחר הניתוח הראשון.
5. הסר את הפצע קליפים 10^בתאנון יום לאחר הניתוח.
   הערה: היה שם אין מניפולציה של השרירים במהלך ההליך, הטכניקה לא היה כרוך כל טראומה תוך-מפרקיות, ובכך שומר על המשכיות דרכים ו במפרק ותקינות אנטומיים. הגבלה חיצוניים גם לעצור וגם פעילות עקבו בפרוטוקול שלנו.
6. לספק שיכוך כאבים באמצעות שחרור-מתמשכת הבופרנורפין, מוזרק subcutaneously במינון של 1.2 מ"ג/ק"ג החל מ- הרדמה אינדוקציה וחזר כל 72 h במידת הצורך.

4-הסרת תפרים 8 שבועות לאחר הנייח

1. לגרום הרדמה עם 5% איזופלוריין דרך שאיפת בתא אינדוקציה, ולאחר מכן מתמשכת עם 2% איזופלוריין דרך קונוס האף במהלך הניתוח. לצורך בקרת הכאב, לנהל שחרור-מתמשכת. הבופרנורפין subcutaneously במינון של 1.2 מ"ג/ק"ג בהתאם למשקל הגוף של החולדה.
2. לעשות חתך מעל הצלקת מההליך הקודם.
3. התפרים לחתוך ולהסיר את הזרוע והשכם.
4. סגור את החתך עם קטעי הפצע.
5. לבחון את הוילונות מדי יום במהלך השבוע הראשון לזהות סימני דלקת. לפקח על כאב ומצוקה גם כן.
6. הסר את הפצע קליפים 10^בתאנון יום לאחר הניתוח.

5. טווח של תנועה ומדידות נוקשות מפרקים

1. למדוד את המכניקה הכתף ROM וסבילים לפני ואחרי הנייח באמצעות התקן מותאם אישית המורכב של קלאמפ הזרוע, אסיפה חיישן ו- הציר הציר של¹¹. זה מבוצע אולטרסאונד (קו בסיס) ' ולא ברציפות לאחר הסרת תפרים.
   1. מדד ROM מיד לאחר הסרת תפרים (המשך יום 0) ולאחר מכן פעמיים בשבוע.
   2. להפחית את המידות פעם אחת לשבוע, על הקלטה פחות מ 10% לשנות מן הנקודה בפעם הקודמת.
      הערה: לאחר בדיקה ROM במשך שבועות, ROM של כל בעל חיים לא השתנה באופן דרסטי בין בדיקות נקודות זמן (פחות מ 10% לשנות). ROM דומה מישור בשלב זה, לכן, הרגשנו כי הפחתת תדירות בדיקות של פעמיים בשבוע, פעם בשבוע היה מספיק.
2. לבצע את המדידות בהרדמה באמצעות מכשיר איזופלוריין באמצעות אידוי דיוק ב 5% עבור אינדוקציה ו- % 2 עבור תחזוקה באורך מלא של ההליך (בערך 5 דקות), כדי להקל על מדידות ביעילות. השתמש אלמנט חימום על בסיס מים מתחת החיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הרדמה.
3. מקם את החיה כראוי למדידה ROM בסיועם של מדריך לייזר. המיקום forelimb על זרוע המלקחיים ב- 90° כיפוף קדימה, עם הציר חישה מיושר עם הציר הארוך של עצם הזרוע. אבטח את forelimb על ידי מפרק המרפק כמופיע ב איור 1B.
4. לשלוט סיבוב forelimb פסיבית על ידי מנוע stepper להעריך מומנט של ROM באופן עקבי. בקרת המנוע stepper עם מיקרו-בקר. שימוש תשומות מן inclinometer, יחד עם אלה מחיישן מומנט כוח כדי לציין את ההתחלה והסוף של המדידות.
5. לחבר את מיקרו מחשב, שליטה באמצעות קוד MATLAB מפותחת ללא צורך במיקור חוץ.
6. לפי המדידות בסיסית בלבד, מחזור מכלול חיישן 3 פעמים בין 60 מעלות של סיבוב חיצוני 80 מעלות של סיבוב פנימי כדי לקבל מדידות מומנט הראשונית (חיצוני: t_ext פנימיים: t_int) להשוואה מאוחר יותר.
7. למדידות ROM, להשתמש הערכים מומנט של כל בעל חיים משלהם למדידות בסיסית (t_ext ו- t_int) כמשתנים קלט מראש בתכנית כדי לזהות שינויים ברוטציה ROM. להשתמש המדידות בסיסית כמו השוואתי עוצר הצבע למדידות ROM עוקבות. שינויים אותרו עם רזולוציה 0.2°.
8. עבור מדידות נוקשות, להשתמש הזוויות הסיבוב המקורי של 60 מעלות סיבוב חיצוני וסיבוב פנימי 80° כקלט מראש בתכנית כדי לזהות שינויים מומנט. שינויים אותרו עם רזולוציה של 0.01 Nmm.
9. שוקלים חיות באותו יום כמו כל הערכה ROM. במקום החיות על סולמות ולהקליט את ההמונים שלהם. נתונים אלה שימשו בתור אחד הכלים להערכת מצב בריאות בעלי חיים במהלך המחקר.
10. בעקבות התאוששות, עכברים לשוב הכלובים ונטר סימנים של כאב או מצוקה. במהלך הבדיקות, שום חיה לא נותר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
    הערה: מדידות רום ומומנט הושגו עם התקן מותאם אישית, דיווח בעבר על ידי הקבוצה שלנו {וילה-קמצ'ו 2015}. ההתקן הוא ג'יג בהזמנה אישית המורכבת מוט לפי stepper מנוע ונשלט על ידי סקריפט מותאם אישית MATLAB. מומנט חיישן עם יחידת המידה אינרציאלית משמשים כדי ללכוד את מומנט ומקם נתונים במהלך חיתוך של הדגימה.

6. ניתוח Immunohistologic פוסט-מורטם

1. בסוף תקופת מדידה ROM 8 שבועות, המתת חסד חולדות עם חשיפה₂ CO.
2. לנתח את שניהם שמאלה (ותשמרו) נכון הכתפיים (בקרת בריאה) על-ידי disarticulating עצם הזרוע של הגומד ולאחר חלוקתה השכם הבריח, חלל בית החזה.
3. לתקן לכתפיים נכרת בריכוז של 10% פורמלין במאגר נייטרלי במשך 3 ימים, ואחריו decalcification בפתרון של ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) 10% ב- pH 7.4 בעוד 2 חודשים.
4. במהלך תהליך זה, במקום דוגמאות על מטרף במחזור עצבנות עדין ולאחסן ב 4 º C. לפקח על decalcification של glenohumeral משותפת עם סריקות טומוגרפיה (uCT) microcomputed אחת לשבוע.
   הערה: EDTA הוא חומר מכלט המאגד יונים של סידן מן המשטח קריסטל אפטיט החיצוני, להפחית בהדרגה את קריסטל גודל^12,13,14. התהליך הזה הוא איטי מאוד עדין, הוא משמש כדי לזהות רכיבים ספציפיים ברקמות שחייבים להשמר טכניקות כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC). הקצב שבו EDTA decalcifies הדגימה תלויה pH וריכוז של הפתרון. במונחים של pH, זה יכול לנוע בין 7 עד 7.4, עם פתרונות יותר בסיסי האצת מהירות decalcification. עם זאת, פתרונות עם רמות ה-pH גבוה יותר עלולה לגרום נזק לרקמות מפתח אלמנטים. בנוסף, ריכוז EDTA הרגיל עבור ניסויים אלה נמצא בין 10% עד 14%, אך חשוב מאוד לזכור כי הסוכן הפעיל הופך להיות דלה ברגע זה אג ח כדי סידן, אז זה דורש החלפה של הנוזל decalcification לפחות פי 3 או 4 לכל שבוע¹⁵.
5. לאחר תהליך decalcification היה הסיקו, הר המפרקים glenohumeral בערימות פרפין על חלוקתה היסטולוגית. אוריינט הדגימות כדי לאפשר פרוסות הילתית. פרוסות שהושג בעומק 50% של הראש המפרק (במרכז, אמצע-coronally) מוצגים באיור1. לבצע נוגדן בשיטת peroxidase-נגד-peroxidase לציון הנוכחות של רקמת שהותירה בכלא. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. לבצע אחזור אנטיגן על ידי הקרנה במיקרוגל על-ידי השוקע השקופיות צנצנת Coplin פלסטיק בפתרון מאגר סודיום ציטרט (ציטראט נתרן 10 מ מ, 0.05% Tween 20, pH 6.0, טרופה למשך 5 דקות ב 95-100 ° C) והצבת בתנור מיקרוגל רגיל במשך 10 דקות בעוצמה בינונית. לאפשר את השקופיות כדי להתקרר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
7. לבצע חסימת עם סרום עז במשך 30 דקות, דגירה דגימות עם העכבר הראשי מונו-המשובטים נוגדנים (דילול 1:400) כדי fibronectin בן לילה ב 4 º C.
8. לאחר דגירה עם נוגדן ראשוני, לשטוף את דגימות פעמיים עם PBS (0.5 ug/mL) למשך 10 דקות; דגירה עם נוגדנים משניים, עז antimouse IgG-peroxidase המספר המשלים (דילול 1:400) במשך 30 דקות.
9. לשטוף את דגימות פעמיים עם PBS (2.5 µg/mL) על מטרף במשך 10 דקות, וחושפים את 3,30-diaminobenzidine tetrahydro-כלוריד ו-30% מימן על-חמצני בחושך במשך 10 דקות Counterstain עם Carazzi hematoxylin.

תוצאות

טווח התנועה

המשך יום 0, מצאנו ירידה 63% סה כ ROM בהשוואה בסיסית (P <.001 החמורות הבחנו ניכר שיפור הדרגתי של ROM עד שבוע 5 של מעקב, כאשר ההתקדמות נעצרת הגבלת 19% (P < 0.001). ההגבלה הנותרים, 18% מתוך סה כ ROM, היה ברור עדיין בגיל 8 שבועות של מעקב (P < 0.001).

Discussion

מחקר זה מציג מודל עכברוש של דלקות מדבקות. פגיעות של הכתף דרך קיבוע פנימי של מפרק glenohumeral. יתר על כן, זה מראה על הפחתת מורחבת של ROM הכולל לפחות 8 שבועות לאחר הסרת הקיבעון. על מנת לחשב את השינוי ב- ROM בנקודות זמן שונות, מדידות היו לעומת תוכניות בסיסיות ספציפיים בבעלי חיים. לעומת זאת, Kanno. et al.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus