Modelo de la rata de Capsulitis adhesiva del hombro

Resumen

Este protocolo presenta un modelo de rata en vivo de capsulitis adhesiva. El modelo incluye una fijación interna de la articulación glenohumeral con fijación articular sutura durante un tiempo prolongado, lo que resulta en un rotación disminuido, rango de movimiento (ROM) y rigidez articular creciente.

Resumen

Esta propuesta pretende crear un modelo de rata en vivo de capsulitis adhesiva para investigar posibles opciones de tratamiento para esta afección y otras etiologías de artrofibrosis comparable. El modelo incluye la fijación articular del hombro en ratas vía escapulario a sutura humeral, dando lugar a una contractura secundaria sin invadir el espacio intra-articular y resultando en ROM rotación disminuida y mayor articulación rigidez.

Se utilizaron 10 ratas Sprague-Dawley, con el propósito de este estudio. Se tomaron medidas ROM base antes de la inmovilización de la glenohumeral. Las ratas fueron sometidas a 8 semanas de inmovilización antes de que se retiraron las suturas de fijación y se evaluaron los cambios en la ROM y rigidez articular. Para evaluar si la inmovilización resultó en una reducción significativa en la ROM, se calcularon los cambios en la cinemática. ROM se midió en cada momento en el período de seguimiento y se comparó con las base interna y externa ROM las mediciones. Para evaluar la rigidez, la cinética de la articulación se calcularon mediante la determinación de las diferencias en el esfuerzo de torsión (t_ext y t_int ) necesarias para llegar a la rotación externa inicial de 60 º y rotación interna inicial de 80 °.

Después de la eliminación de la fijación articular sutura en el seguimiento día 0, se encontró una disminución de 63% en ROM total comparado con el basal. Observamos la mejora continua hasta la semana 5 de seguimiento, con el progreso desaceleración alrededor de una restricción de 19%. En la semana 8 de la carta recordativa, todavía había una restricción de 18% de la ROM. Además, en el seguimiento día 0, encontramos el par aumentó en 13,3 Nmm en comparación a los valores basales. En la semana 8, el par total fue medido para ser 1,4 ± 0,2 Nmm mayor que las mediciones iniciales. Este trabajo presenta un modelo de rata de capsulitis adhesiva de hombro con duración reducida de la ROM y aumento de la rigidez.

Introducción

Capsulitis adhesiva del hombro con frecuencia se conoce como hombro congelado o contractura de hombro. Se caracteriza por movimiento glenohumeral restringida y dolor, probablemente como resultado de fibrosis avanzada y contractura articular^1,2,3. La condición implica el reclutamiento de células de fibroblastos y miofibroblastos con una matriz de colágeno denso resultante (tipos I y III) en la cápsula común^2,3. Hay muchos posibles factores de riesgo para el desarrollo de una contractura articular, incluyendo género, diabetes mellitus, hipertiroidismo, lesión traumática e inmovilización prolongada^4,5,6.

Opciones de tratamiento eficaz faltan y sobre todo incluyen terapia física, con la intervención en la forma de liberación quirúrgica en casos extremos que no han mejorado con cuidado conservador. El mejor método de tratamiento sigue siendo indeterminado y ha sido un tema de gran interés desde hace años en el campo de la medicina^7,8. Desarrollo de nuevas opciones terapéuticas requieren un modelo reproducible para la condición de que no se basa en trauma inducido intra-articular. El modelo de capsulitis adhesiva óptima debe incluir las dos principales características de la enfermedad: contractura de la cápsula del hombro y una prolongada reducción de rango de movimiento (ROM). Schollmeier et al. ⁹ se describe uno de los primeros modelos de contractura articular utilizando un molde para desarrollar contractura de hombro en caninos. También informaron que cambios en la presión intra-articular y ROM volvieron a niveles normales después de la cesación de inmovilización⁹. Sin embargo, una limitación importante en el estudio es la variación en la posición de extremidades entre animales debido al uso de una técnica de fundición. Para obtener un modelo más reproducible, Kanno et al. ¹⁰ más tarde presentó un modelo de rata de capsulitis adhesiva utilizando fijación rígida interna del hombro. Sin embargo, aunque lograron una reducción significativa de la ROM con su modelo, no dicen si estos cambios son temporales o de larga duración. El objetivo de nuestro estudio era crear un modelo de rata conveniente en vivo hombro contractura por investigar el efecto de inmovilización articulación glenohumeral articular prolongada en ROM y rigidez articular.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y uso en el Beth Israel Deaconess Medical Center. Se tuvo cuidado para evitar la anestesia prolongada innecesaria y también para evitar hipotermia. Animales fueron ponderados en cada sesión de medición ROM y supervisados para bajar de peso.

1. sujetos del estudio

1. Uso 10 ratas Sprague-Dawley que son 13 semanas de edad en el momento de la cirugía y que van entre 250 – 300 g de peso corporal.

2. quirúrgico

1. Bajo anestesia y antes de inmovilización quirúrgica, medir la torsión de la línea de base en función del ángulo de rotación entre los 60° de rotación externa y 80° de rotación interna (ver paso 5).
2. Inducir la anestesia con isoflurano de 5% a través de la inhalación en una cámara de inducción y luego mantener con isoflurano 2% a través de un cono de nariz durante la cirugía.
   1. Utilice un elemento de calefacción a base de agua por debajo del animal para mantener la temperatura corporal durante la anestesia.
   2. Con el fin de controlar el dolor, administrar liberación sostenida buprenorfina por vía subcutánea en una dosis de 1.2 mg/kg dependiendo del peso del cuerpo de la rata.
3. Inmovilizar la Gleno-humeral izquierda juntas en un ángulo de 60 ° de abducción (el ángulo entre el eje del húmero y la espina escapular)^{10 , 11}.
   1. Iniciar el procedimiento quirúrgico con una incisión longitudinal posterior, paralela al eje del húmero. Hacer la incisión en la piel justo debajo de la glenohumeral articulación y extender por unos 3 cm.
   2. Utilizar 2 suturas (poliéster trenzado) para inmovilizar la articulación por la perforación a través del borde lateral de la escápula y en los dos tercios distales del eje humeral y posteriormente apriete como se ilustra en la figura 1A. Tomar el esfuerzo adicional para evitar constricción importantes estructuras como la arteria braquial.
      Nota: La técnica quirúrgica tiene la ventaja de ser capaces de limitar la articulación en los 60° de abducción (Z) sin afectar a otros planes (X e Y). Colocando suturas alrededor del húmero y borde lateral de la escápula, una aproximación de las dos estructuras es alcanzada y mantenida en el plano de la lámina escapular. Después de apretar las suturas, el brazo se fija en la posición de reposo cuando se consideran los planos X e Y y a 60° de abducción cuando se considera el plano Z. Esto se cree para limitar la variabilidad entre los animales que se pueden generar de falta de afinando la posición conjunta de los tres planes.

3. cierre de la incisión

1. Después de adecuada hemostasia, cierre la incisión en la piel usando los clips de la piel.
2. Descontinuar la anestesia y permitir que el animal a recuperarse bajo supervisión en un ambiente cálido. Después de que el animal recupera la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal, regrese a su jaula.
3. Inmediatamente después del procedimiento, permite volver a la actividad normal de los animales. Permitir a los animales para moverse sin restricciones, basándose principalmente en suturas internas para fijar la articulación glenohumeral.
4. Para vigilar por posible infección, inspeccionar los sitios de incisión todos los días durante la primera semana postoperatoria.
5. Eliminar clips de la herida^{el día 10 después de la cirugía} .
   Nota: No hubo ninguna manipulación de los músculos durante el procedimiento y la técnica no implicó ningún trauma intra-articular, preservando así el capsular y articular la continuidad y la integridad anatómica. Ni limitación externa refrene ni actividad siguió en nuestro protocolo.
6. Proporcionar analgesia con buprenorfina de liberación sostenida, inyecta por vía subcutánea en una dosis de 1.2 mg/kg a partir de la inducción de la anestesia y repetir cada 72 h si es necesario.

4. sutura retiro 8 semanas después de la inmovilización

1. Inducir la anestesia con isoflurano de 5% a través de la inhalación en una cámara de inducción, entonces sostenido con isoflurano 2% a través de un cono de nariz durante la cirugía. Con el fin de controlar el dolor, administrar liberación sostenida buprenorfina por vía subcutánea en una dosis de 1.2 mg/kg dependiendo del peso del cuerpo de la rata.
2. Hacer una incisión sobre la cicatriz del procedimiento anterior.
3. Cortar las suturas y retire del húmero y la escápula.
4. Cerrar la incisión con los clips de la herida.
5. Examinar el sitio de la incisión todos los días durante la primera semana para detectar cualquier signo de infección. Controlar el dolor y el malestar, así.
6. Eliminar clips de la herida^{el día 10 después de la cirugía} .

5. rango de movimiento y rigidez articular medidas

1. Medir la mecánica ROM y pasiva del hombro antes y después de la inmovilización mediante un dispositivo modificado para requisitos particulares consisten en una pinza del brazo, un conjunto del sensor y un basculante de eje¹¹. Esto se realiza pre-operatively (línea base) y continuamente después de retirar la sutura.
   1. Medida ROM inmediatamente después de retirar la sutura (seguimiento día 0) y posteriormente dos veces a la semana.
   2. Reducir medidas una vez semanal, al registrar menos del 10% cambiar desde el momento anterior.
      Nota: Después de probar la ROM durante semanas, la ROM de cada animal no cambió drásticamente entre pruebas puntos de tiempo (menos del 10% del cambio). La ROM parece en este punto de la meseta, por lo tanto, pensamos que la disminución de prueba frecuencia de dos veces a la semana a una vez por semana era suficiente.
2. Efectuar mediciones bajo anestesia con vaporizador de isoflurano través de precisión en el 5% para la inducción y 2% para mantenimiento para toda la duración del procedimiento (aproximadamente 5 minutos), para facilitar las mediciones de eficiencia. Utilice un elemento de calefacción a base de agua por debajo del animal para mantener la temperatura corporal durante la anestesia.
3. Coloque el animal correctamente para medición ROM con la ayuda de una guía láser. Posición del miembro anterior en la pinza del brazo en flexión hacia delante 90 º, con el sensor eje alineado con el eje longitudinal del húmero. Fije el miembro anterior de la muñeca y el codo tal como se ilustra en la figura 1B.
4. Control de rotación del miembro anterior pasiva por un motor paso a paso para evaluar ROM y par de manera consistente. Control del motor paso a paso con un microcontrolador. Uso de insumos de inclinómetro, junto con los de un sensor de par para indicar el inicio y final de las mediciones.
5. Conectar el microcontrolador a un ordenador y control mediante un código MATLAB desarrollado in-House.
6. Para las mediciones de línea base, el montaje del sensor 3 veces entre 60° de rotación externa y 80° de rotación interna para obtener mediciones de par inicial (externo: t_ext e interior: t_int) para comparación posterior.
7. Para medidas de ROM, usar los valores de par de cada animal en sus propias mediciones iniciales (t_ext y t_int) como variables de entrada predefinidas en el programa para detectar cambios en rotación ROM utilizar las mediciones de línea base como un comparativo detener punto medidas ROM. Cambios fueron detectados con una resolución de 0.2°.
8. Para la medición de la rigidez, utilizar los ángulos de rotación original de 60° rotación externa y rotación interna de 80° como entrada preestablecida en el programa para detectar cambios en el esfuerzo de torsión. Cambios fueron detectados con una resolución de 0.01 Nmm.
9. Pesar los animales el mismo día como la evaluación de cada ROM. Colocar los animales en escalas y registrar sus masas. Estos datos fueron utilizados como una de las herramientas para evaluar el estado de salud animal durante el estudio.
10. Después de recuperación, volver ratas a sus jaulas y monitorear signos de dolor o angustia. A lo largo de esta prueba, ningún animal es desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
    Nota: ROM y un par de mediciones se lograron con un dispositivo modificado para requisitos particulares, divulgado previamente por nuestro grupo {Villa Camacho 2015}. El dispositivo es una plantilla a medida que consiste en un eje girado por el motor paso a paso y controlada por una secuencia de comandos personalizada de MATLAB. Captura de par y posición datos durante la articulación de la muestra se utilizan un sensor de par y unidad de medición inercial.

6. Análisis de Immunohistologic post-mortem

1. Al final del período de medición ROM 8 semanas, eutanasia ratas con exposición a CO₂ .
2. Disecar ambos izquierda (inmovilizado) y hombros (control sano) a la derecha por desarticular el húmero desde el cúbito y seccionando la escápula de la clavícula y la cavidad torácica.
3. Fijar los hombros suprimidos en una solución de formalina tamponada neutra 10% durante 3 días, seguido de descalcificación en una solución de etilendiaminotetracético (EDTA) el ácido 10% a pH 7.4 durante 2 meses.
4. Durante este proceso, colocar las muestras en un agitador en un ciclo de agitación suave y almacenar a 4 ° C. Descalcificación de la glenohumeral con semanal microcomputed (uCT) tomografía de control.
   Nota: El EDTA es un agente quelante que une a los iones del calcio de la superficie exterior de cristal de apatita, reduciendo progresivamente el tamaño de cristal^12,13,14. Este proceso es muy lento y suave, y se utiliza para detectar elementos de tejido específico que deben preservarse para técnicas de inmunohistoquímica (IHQ). La tasa a la que el EDTA descalcifica al espécimen es dependiente en el pH y la concentración de la solución. En términos de pH, puede variar de 7 a 7.4, con soluciones más alcalinas, acelerando la velocidad de descalcificación. Sin embargo, soluciones con niveles de pH más altos pueden dañar los elementos clave del tejido. Además, la concentración de EDTA generalmente para tales experimentos se encuentra entre 10% y 14%, pero es muy importante recordar que el agente activo se convierte en agotados una vez que se adhiere al calcio, por lo que esto requiere el reemplazo del fluido de descalcificación por lo menos 3 a 4 veces por semana¹⁵.
5. Una vez que concluyó el proceso de descalcificación, Monte las articulaciones glenohumeral en pilas parafina para secciones histológicas. Oriente las muestras para permitir cortes coronales. Rebanadas obtienen en el 50% de profundidad de la cabeza humeral (en el centro, medio-coronal) se muestran en la figura 1. Realizar la coloración de immunohistochemical usando el método de peroxidasa anti-peroxidasa para denotar la presencia de tejido fibrótico en la articulación. ^{4 , 9 , 10 , 16}
6. Realizar recuperación de antígeno por irradiación de microondas sumergiendo los portaobjetos en un frasco de Coplin plástico en una solución tampón de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% Tween 20, pH 6.0, precalentado por 5 min a 95-100 ° C) y colocar en un horno de microondas convencional durante 10 minutos a media potencia. Permita que el portaobjetos se enfríen durante 30 min a temperatura ambiente.
7. Realizar el bloqueo con suero de cabra por 30 min e incubar a las muestras con un anticuerpo mono clonal primario de ratón (dilución 1: 400) a fibronectina durante la noche a 4 ° C.
8. Tras la incubación con el anticuerpo primario, lavar las muestras dos veces con PBS (0,5 ug/mL) durante 10 minutos; y se incuba con un anticuerpo secundario de cabra antimouse IgG-peroxidasa conjugado (dilución 1: 400) 30 minutos.
9. Lavar las muestras dos veces con PBS (2,5 μg/mL) en un agitador durante 10 minutos y exponer a 3,30-diaminobenzidina tetrahidro-cloruro y el 30% peróxido de hidrógeno en la oscuridad durante 10 minutos contratinción con hematoxilina de Carazzi.

Resultados

Rango de movimiento

En el seguimiento día 0, se encontró una disminución de 63% en ROM total comparado con el basal (P <.001. Observamos una mejora gradual de la ROM hasta la semana 5 de seguimiento, cuando la progresión en restricción de 19% (P < 0,001). La restricción restante, 18% de ROM total, era todavía evidente en 8 semanas de seguimiento (P < 0,001).

Rigidez

Discusión

Este estudio presenta un modelo de rata de capsulitis adhesiva del hombro a través de la fijación interna de la articulación glenohumeral. Además, muestra una reducción prolongada de ROM total durante al menos 8 semanas después de la eliminación de la fijación. Para calcular las alteraciones en la ROM en diferentes puntos temporales, las mediciones fueron comparados con animales bases específicas. Por el contrario, Kanno et al. ¹⁰ utiliza un torque estandarizado para todos los an...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		250-300 g
Surgical tool:
Injection needle			BD 1' 30 guage
Needle holder
5% isoflurane
2% isoflurane
Nose cone
Skalpel and skalpel holder			No. 11 scalpel
Curved hemostat forceps
Staright hemostat forceps
Tissue retractor
Toothed tissue forceps
Plain tissue forceps
Dissecting scissors
Suture scissors
Skin clip applicator			Any standard staples for wound closure
Immobilization material	Ethicon		No. 2-0 braided polyester ethibond suture was used for immobilization
Other materials:
Costumized device for ROM: 1)Sensor assembly, 2)pivoting axle, 3)arm clamp			Assembly that is described in relaxin paper and adhesive capsulitis paper
Orientation sensor (part of sensor assembly)	MicroStrain Inc., Williston, VT, USA		3DM-GX3-15
Reaction torque sensor (part of sensor assembly)	Futek Inc., Irvine, CA, USA		TFF400
Stepper Motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503		https://www.sparkfun.com/products/13656
Microcontroller	Torino, Italy).		Arduino UNO, R3
MATLAB code	MATLAB 7.13.0.564, Natick, Ma, USA
Weight Scale			Ohaus