رصد موسع لحجم الآفة في نموذج ماوس مغايرة لبطانة الرحم

Jessica Martinez; Viviana Bisbal; Nerea Marin; Antonio Cano; Raul Gómez

doi:10.3791/58358

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للعيش-التصوير المسمى فلوريسسينتلي شظايا بطانة الرحم البشرية المطعمة في الفئران. يسمح الأسلوب دراسة آثار المخدرات الاختيار على حجم الآفة اندوميتريوتيك من خلال الرصد والقياس الكمي للأسفار التي تنبعث من المراسل الفلورسنت في الوقت الحقيقي

Abstract

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتنفيذ نموذج مغايرة الماوس التي يمكن تقييم تطور بطانة الرحم في الوقت الحقيقي من خلال رصد موسع للأسفار التي تنبعث من مزروع الأنسجة بطانة الرحم البشرية خارج الرحم. ولهذا الغرض، يتم الحصول على خزعات من بطانة الرحم البشرية من المانحين التبرع البويضيه الجارية المرأة. شظايا بطانة الرحم البشرية تستزرع حضور غدية هندسيا لكدنا صريحة مشري بروتين فلوري مراسل. على التصور، ويسمى الأنسجة بمعدل أمثل للأسفار بعد الإصابة في وقت لاحق المختارة لغرس في الفئران المستفيدة. أسبوع واحد قبل جراحة زرع، هي أووفوريكتوميزيد الفئران المستفيدة، والكريات استراديول توضع تحت الجلد للحفاظ على بقاء ونمو الآفات. اليوم لعملية جراحية الفئران تجويف تخديره، والبريتوني الوصول إليها من خلال شق صغيرة (1.5 سم) لينيا-ألبا. يزرع المسمى فلوريسسينتلي تويزيد، بإيجاز غارقة في الغراء وتعلق على طبقة البريتوني. يتم خياطة الشقوق، وترك الحيوانات لاسترداد لبضعة أيام. ويرصد fluorescence المنبعثة من يزرع اندوميتريوتيك عادة غير-إينفاسيفيلي كل 3 أيام لمدة 4 أسابيع مع نظام تصوير في الحية. ويمكن تقدير الاختلافات في الحجم من يزرع اندوميتريوتيك في الوقت الحقيقي بالتحديد الكمي للإشارات مشري والتطبيع ضد الزمن-النقطة الأولى تبين كثافة fluorescence القصوى.

القوارض السريرية التقليدية لنماذج من بطانة الرحم عدم السماح برصد غير الغازية للآفة في الوقت الحقيقي ولكن بدلاً من ذلك السماح بتقييم لآثار المخدرات جزيئي عند نقطة النهاية. هذا البروتوكول يسمح أحد لتتبع الآفات في الوقت الحقيقي، وهو أكثر فائدة لاستكشاف إمكانات العلاج من المخدرات في نماذج السريري لالتهاب بطانة الرحم. القيد الرئيسي للنموذج وهكذا ولدت أن الرصد غير الغازية من غير الممكن على مدى فترات طويلة من الوقت بسبب التعبير ابيسومال من الفيروسات الإعلانية.

Introduction

بطانة الرحم اضطراب الجهاز التناسلي للمرأة مزمنة بدأت بغرس الوظيفية بطانة الرحم خارج تجويف الرحم. تنمو الآفات حمل خارج الرحم والحث على التهابات العمليات المؤدية إلى المزمنة الألم والعقم الحوض¹. ومن المقدر أن يصل إلى 10-15% نساء في سن الإنجاب تتأثر endometriosis2، وأنها موجودة في حوالي 40-50% من النساء المصابات بالعقم³. العلاجات الدوائية الحالية لبطانة الرحم غير قادر على القضاء التام على آفات ولا يخلو من الآثار الجانبية⁴^،⁵. يتطلب البحث عن علاجات أكثر فعالية لتحسين النماذج الحيوانية الموجودة في بطانة الرحم بطريقة يمكن أن تحاكي آفات البشرية على نحو ملائم، ويمكن تقييم آثار المركبات على حجم الآفة بين أمور أخرى عن كثب.

وقد استخدمت نماذج الرئيسيات لتقليد بطانة الرحم بترسيخ آفات حمل خارج الرحم الأشيع متطابقة وفي مواقع مماثلة كما هو الحال في البشر⁶^،^،من⁷⁸؛ ومع ذلك، الشواغل الأخلاقية وارتفاع التكاليف الاقتصادية المتصلة بالتجريب مع حد الرئيسات استخدام⁹. ونتيجة لذلك، لا يزال استخدام الحيوانات الصغيرة، ولا سيما من القوارض، لتنفيذ نماذج فيفو من بطانة الرحم تكون يفضل أنها تتيح دراسات مع عدد أكبر من الأفراد¹⁰^،¹¹. بطانة الرحم يمكن أن يتسبب في هذه الحيوانات بزرع قطعة من القوارض ابواق الرحم ("نماذج مثلى")^،من¹²¹³ أو أنسجة بطانة الرحم/اندوميتريوتيك البشرية إلى مواقع خارج الرحم (نماذج مغايرة)¹⁴. وعلى النقيض من البشر، القوارض لا تسلط على أنسجة بطانة الرحم ومما بطانة الرحم يمكن عدم وضع تلقائياً في هذه الأنواع. ولذلك، الماوس مثلى نماذج من بطانة الرحم قد تعرض للانتقاد يرجع ذلك إلى حقيقة أن زرع أنسجة الرحم الماوس حمل خارج الرحم لا تعكس خصائص الآفات اندوميتريوتيك البشرية¹⁵.

يمكن أن تحاكي المناسبة فسيولوجيا بطانة الرحم في نماذج مغايرة لبطانة الرحم حيث يتم زرع شظايا بطانة الرحم البشرية الطازجة في الحيوانات العوز. في نماذج مغايرة التقليدية، يتم عادة تقييم الآثار العلاجية من المركبات ذات الأهمية عند نقطة النهاية بتقييم حجم الآفة باستخدام الفرجار¹⁶. حد واضح، على هذا النحو، نماذج حيوانية نقطة النهاية لا تسمح دراسة ديناميات غرس أو تطور الآفة اندوميتريوتيك على مر الزمن. قيداً إضافيا أن لا تسمح باستخدام الفرجار القياسات الدقيقة لحجم الآفة. وفي الواقع، الخطأ القياسي تقدمها الفرجار في نفس النطاق (أي، ملليمتر) كحجم الآفات مزروع في الفئران، مما يحد من قدرة هذه الأدوات للكشف عن التغيرات الفعلية في الحجم.

وللتغلب على هذه القيود، هنا، يصف لنا توليد نموذج الماوس مغايرة لبطانة الرحم التي تم تصميم مزروع الأنسجة البشرية للتعبير عن كرز م مراسل بروتين فلوري. يمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت مع نظام صورة مناسبة غير الغازية رصد حالة الآفة مع الكمي المتزامن لحجمه في الوقت الحقيقي. وهكذا، لدينا نموذج يوفر مزايا واضحة عند مقارنة النماذج التقليدية نقطة النهاية كما أنه يجلب الفرصة للرصد في الوقت الحقيقي غير الغازية وإمكانية أداء أكثر موضوعية وتقدير دقيق للتغيرات في حجم الآفة.

Protocol

وأقر استخدام عينات الأنسجة البشرية المؤسسية استعراض المجلس ولجنة الأخلاقيات للمستشفى الجامعي La Fe. وقدمت جميع المرضى الموافقة الخطية. تمت الموافقة على الدراسة التي تنطوي على الحيوانات "لجنة رعاية الحيوان المؤسسية" في مركز بحوث وبرينسيبي فيليبي دي فالنسيا، وأجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية والاستخدام للثدييات من "المعاهد الوطنية" الصحة.

1-جمع الأنسجة بطانة الرحم ومعالجة مسبقة

الحصول على خزعة ذات نوعية جيدة للبشرية أسبيراتي بطانة الرحم باستخدام قنية المرفقة بجهاز شفط. صب الخزعة قارورة تحتوي على 10 مل من عقيمة المالحة ويغسل مع الانفعالات دليل لطيف.
ملاحظة: الإجراءات المتعلقة بكيفية الحصول على نوعية جيدة خزعات تم وصفه سابقا¹⁷.
أغسل الخزعة من أي دم أو مخاط المتبقية. كرر العملية بصب الأنسجة بقوارير تحتوي على المحلول الملحي الطازجة قواديس العديد من كما هو مطلوب حتى الأنسجة ويلاحظ نظيفة.
إتمام نقل خزعة شظايا مع مظهر صحي في محلول يحتوي على 10 مل من المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 1% محلول مضاد حيوي فطري.
من أجل المحتوى في 10 سم طبق بيتري والشروع في ختم الأنسجة إلى 5 – 10 مم³ قطع مع زوج من المشارط.

2-أدينوفيرال تعداء من شظايا بطانة الرحم

ملاحظة: وينبغي إدخال جميع المواد التي تنوي استخدامها في العملية في غطاء محرك السيارة مقدما. أن كل ما يجري لا لاستخدامها في العملية ومكان قارورة مع التبييض. يجب تطهير جميع المواد التي تأتي في اتصال مع ناقل أدينوفيرال مع المبيض قبل تجاهل ذلك في حاويات واقية.

بمجرد قد تم مقطعة الخزعة، تأخذ طبق بيتري جديد. "الماصة؛" متعددة 30-50 ميليلتر دميم قطرات من الانتشار في جميع أنحاء الطبق كله. ترك مساحة كافية بين قطرات حتى لا يأتون إلى جهة الاتصال.
ساعد بإبرة تعلق بحقنه، ضع قطعة واحدة من جزء داخل كل من قطرات المتوسطة.
ملاحظة: يجب أن تحتوي كل قطره على قطعة واحدة من بطانة الرحم.
إعداد الحل العامل مشري الإعلانية بتمييع 01:20 الحل الأسهم أدينوفيرال مشري [1 × 10¹⁰ بفو/مل]) إلى دميم المتوسط دون المضادات الحيوية (دميم + 10% تصفية FBS).
الاستغناء عن 100-200 ميكروليتر من الحل مشري الإعلانية الواحدة جيدا على لوحة 96، حسنا، شغل العديد من الآبار كالشظايا التي تتوفر في قطرات طبق بتري (الخطوة 2، 2). وباﻹضافة إلى ذلك، ملء الآبار على الأقل 3 مع إتش الحرة دميم المتوسطة كعنصر سلبي.
وساعد بإبرة تعلق المحاقن، ونقل كل من الشظايا في طبق بتري (الخطوة 2، 2) إلى كل من الآبار التي تحتوي على حل مشري الإعلانية في لوحة 96-جيدا.
مكان البئر 96-لوحة تحتوي على شظايا بطانة الرحم مع حل مشري الإعلانية في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ ح 16.
أغسل بها غدية المتبقية في الأجل المتوسط بنقل الأنسجة في لوحة 96-بئر جديدة مليئة بالكامل دميم المتوسطة (مع المضادات الحيوية-أنتيميكوتيكس، خالية من إتش) واحتضانها ل 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لح 24-48.
ملاحظة: تذكر لتغطية مع التبييض جميع لوحات جيدا والنصائح التي جاءت على اتصال بالفيروس الإعلانية قبل تجاهل في الحاوية واقية.
إخراج اللوحة من الحاضنة ووضعه تحت مجهر الأسفار في 568 نانومتر (القناة الحمراء) لاختبار لوسم الأمثل.
اختر الشظايا أبرع ووضعها في لوحة 96-بئر جديدة مع الطازجة المتوسطة دميم كاملة (مع المضادات الحيوية-أنتيميكوتيكس، خالية من إتش).
ختم اللوحة جيدا مع فيلم بارافين بلاستيك ونقله إلى إلى منطقة خالية من مسببات الأمراض خاصة بالحيوان لغرس شظايا بطانة الرحم في الحيوانات المتلقية.

3-توليد نموذج الماوس بطانة الرحم

ملاحظة: استخدم الأسبوع 6-8-القديمة athymic عارية (أو سلالات المناعة مماثلة) الفئران الإناث يسكنون في ظروف محددة الممرض – مجاناً، كالحيوانات المتلقية. لتجنب الهرمونية دورة تعتمد على الاختلافات، وفي نفس الوقت الوقود الآفة النمو مع استراديول، الحيوانات إطلاق سراح 60 يوما ovariectomized ويوضع مع كبسولات تحتوي على 18 ملغ من 17 βeta-استراديول (17β-E₂). الموضع أووفوريكتومي وبيليه قد يتعين القيام بها على الأقل أسبوع واحد قبل تطعيم شظايا بطانة الرحم في الحيوانات المتلقية.

أووفوريكتومي
ملاحظة: إعداد مواد التعقيم الجراحي في غطاء محرك السيارة. إعداد معدات التخدير ومنطقة إنعاش بعد جراحة جاهزة في نفس الغرفة.
1. القيام حقن تحت الجلد من مشتقات المورفين بجرعة 5 ملغ/كغ كل الماوس. واسمحوا الفئران بقية مدة 30 دقيقة بعد الحقن حيث كالمسكنات يمكن أن تتجلى آثار المخدرات.
2. قم بتوصيل استنشاق التخدير المعدات والسماح للأكسجين و isoflurane (2% مغ/كغ) تدفق لمدة دقائق قليلة في دائرة تخدير مختومة.
3. إدخال الحيوان في غرفة التخدير إيسوفلوراني. الانتظار لمدة 3-5 دقيقة والتحقق من أن الحيوانات هي تخديره تماما عن طريق الضغط على واحد من الكفوف. نقل الحيوانات إلى منطقة الجراحة والمحافظة على التخدير عن طريق وضع قناع مع استمرار تدفق الغاز isoflurane تغطي الخطوط الجوية الجهاز التنفسي.
4. بعد تطهير المنطقة مع تشلوروهيكسيديني، تنفيذ شق الساحلي عرضية 0.5 سم تقريبا في ذروة الفخذ مع مقص حاد.
5. فصل الجلد عن العضلات للحصول على الوصول إلى تجويف البطن وتحديد لوحة الدهون البيضاء التي تحيط بالمبيض وسحب المبيض مع ملقط تشريح.
6. قرانهما حول قناة مع خياطة قابلة للامتصاص وتشديد عليه لضمان الأرقاء المناسبة قبل استئصال المبيض.
7. طبقة العضلات مع خياطة الامتصاص 6-0، ثم أغلق والجلد بخياطة غير الامتصاص 6-0. تنظيف المنطقة مرة أخرى بمحلول مطهر.
8. كرر الإجراء إزالة المبيض الجانبي كونترا.
استراديول بيليه الزرع
ملاحظة: العناية بأن الحيوان يتم تخديره أثناء الجراحة oophorectomy مكان الكريات عند تلك النقطة.
1. فورا بعد انتهاء الإجراء أووفوريكتومي، تنظيف الجلد بمحلول مطهر المحيطة بالرقبة وجعل شق عرضية صغيرة تحت الجلد (0.5 سم) مع مقص حاد في مؤخر العنق.
2. استخدام المقص لتشريح الجلد من العضلات، مما يجعل جيب كبيرة بما يكفي للسماح بوضع الكريات.
3. إدراج بيليه الذي يحتوي على 18 ملغ 17β ه₂ وخياطة الجلد بخياطة غير امتصاص 6-0. تنظيف المنطقة مرة أخرى بمحلول مطهر.
4. وضع الحيوان في منطقة الإنعاش وإدارتها جرعة المثالية للتسكين طويلة الأمد لتخفيف فترة الاسترداد.
جراحة زرع بطانة الرحم
ملاحظة: السماح على الأقل فترة الحجر الصحي سبعة أيام للسماح باسترداد كامل للحيوانات بعد أووفوريكتومي قبل البدء في جراحة زرع جزء بطانة الرحم. للتزامن الأمثل مع وضع العلامات للأنسجة، جمع الخزعة قبل جراحة زرع تفاديا لثقافة طويلة الأجل من اكسبلانتس 2 – 3 أيام.
1. الاستعداد في غرفة العمليات الجراحية في المنطقة الحرة الممرض محددة مسبقاً. إعداد هود مع جميع المواد الجراحية المطلوبة، معدات التخدير ومنطقة الإنعاش بعد الجراحة أيضا.
2. جلب الحيوانات إلى الغرفة، والقيام حقن تحت الجلد مشتقات المورفين بجرعة 5 (مغ/كغ) في كل الماوس. واسمحوا الفئران بقية مدة 30 دقيقة بعد الحقن حيث يمكن أن تتجلى آثار المسكنات من المخدرات.
3. قم بتوصيل استنشاق التخدير المعدات والسماح للأكسجين و isoflurane (2% مغ/كغ) تدفق لمدة دقائق قليلة في دائرة تخدير مختومة.
4. قبل البدء بعملية جراحية، نقل اللوحة التي تحتوي على فلوريسسينتلي المسمى شظايا (من الخطوة 2، 10) في هود، فتح عليه وصب الشظايا في طبق بتري لتسهيل التعامل.
5. إدخال الحيوان في غرفة التخدير إيسوفلوراني. الانتظار لمدة 3-5 دقيقة والتحقق من أن الحيوانات هي تخديره تماما عن طريق الضغط على واحد من الكفوف. نقل الحيوانات إلى منطقة الجراحة والمحافظة على التخدير عن طريق وضع قناع مع استمرار تدفق الغاز isoflurane تغطي الخطوط الجوية الجهاز التنفسي.
6. مواجهة مكان الحيوان أنيسثيتيزيد. تطهير منطقة البطني. إجراء شق طولي 1.5 سم في البطن مع مقص حاد وفصل الجلد عن العضلات. ثم، تنفيذ شق طولي 1.5 سم في العضلات الوصول إلى التجويف الصفاقى.
7. اضغط الحافة اليسرى من جدار البطن العضلات مع ملقط صغير وإضعاف فإنه محاولة لكشف الوجه الداخلي للصفاق في الخارج.
8. تأخذ زرع بطانة الرحم مع ملاقط مصغرة ونقع عليه بإيجاز في مادة لاصقة cyanoacrylate ن-بوتيل-إستر ووضعه للصفاق حيث أنها سوف أتعلق. اتركها تجف لبضع ثوان. كرر الخطوتين 3.3.6 و 3.3.7 مكان زرع على الجانب كونترالاتيرال من الصفاق.
9. طبقة العضلات مع خياطة الامتصاص 6-0، ثم أغلق والجلد مع عدم الامتصاص خياطة 6-0. تنظيف المنطقة مرة أخرى بمحلول مطهر.
10. ضع الحيوان في منطقة الإنعاش وإدارتها جرعة مثلى من التسكين طويلة الأمد.

4-في مجال التصوير الفلورسنت فيفو مع فيفو في نظام التصوير

قم بتشغيل الجهاز نظام التصوير المجراة في تهيئة البرنامج وتسمح الكاميرا CCD لتبرد لبضع دقائق.
إعداد معدات التخدير استنشاق. فتح تدفق isoflurane % 2 لزوجين من دقيقة لملء قاعة مخدر. تعد منطقة الانتعاش بعد التخدير.
متى بدأ البرنامج ويكون تبريده الكاميرا CCD، انقر فوق الأداة معالج التصوير : يبدأ البرنامج تعليمي مع سلسلة من windows على التوالي عرض، كل واحدة تناظر معلمة للفائدة مع عدة خيارات متاحة لاختيار بواسطة النقر فوق في المربع المقابل. المضي قدما من خلال البرنامج التعليمي عن طريق تحديد المربعات المناسبة في كل نافذة وانقر فوق الزر موافق للانتقال إلى المجموعة التالية من المعلمات بالتسلسل التالي.
1. حدد خانة ابيلومينيسسينسي للمعلمة الأسفار، حدد مربع مشري المعلمة أزواج عامل التصفية. تصوير الوضع و التركيز تأكيد خانات الاختيار وحدد المربع التلقائي للمعلمة التعرض.
بمجرد إعداد الصك، نقل الحيوان واحدة داخل غرفة التخدير. عند تخديره تماما، نقل الحيوانات داخل في فيفو التصوير قفص النظام ووضعه الجانب حتى مع رئيسها داخل أنبوب متصل بجهاز التخدير. إغلاق الغطاء وانقر فوق الحصول على الرصد.
الحصول على الصور التي تظهر (ما مجموعة خمس صور، صورة واحدة لكل زوج من عوامل التصفية المحددة) وحفظ البيانات بالنقر فوق الزر حفظ باسم . حرك الماوس إلى المنطقة للانتعاش بعد التخدير. كرر هذه العملية مع الحيوانات المتبقية.
كرر رصد اثنين أو ثلاث مرات في أسبوع لمتابعة الإشارات على نحو مناسب أثناء الوقت.
المضي قدما للتضحية بالحيوان في نهاية الدورة الزمنية CO₂ خنقاً ب.

5-التقدير الكمي للصور Fluorescence في فيفو

الفصل بين الأسفار الفعلية عن طريق اتقانا الصورة:
1. فتح في فيفو التصوير التحليل إلى جانب البرنامج.
2. اختر الملف "سيكوينسينفو" لبدء التحليل. ستظهر windows اثنين: "عرض التسلسل" و "لوح ألوان أداة". اختر لوح ألوان أداة ومتى تم عرض القائمة، حدد الخيارات التالية.
3. حدد تصحيحات وانقر على مربع الطرح الخلفية فلوريدا التكيفية لإزالة الإشارات الفلورية غير مرغوب فيه من بيانات الصورة الإنارة. اختر عتبة أكبر قدر من الاهتمام، وانقر فوق تعيين.
4. انقر فوق الطيفية أونميكسينجوحدد الأطوال موجية الفائدة، الأسلوب الذي تم اختياره اتقانا (مكتبة، المصحوبة بمرشدين، التلقائي أو اليدوي) ثم انقر فوق بدء تشغيل أونميكس.
5. حدد الصورة أونميكسيد المقابلة لإشارة مشري، وانقر نقراً مزدوجاً فوق. سوف تظهر نافذة جديدة مع الصورة النهائية للإشارة الواردة من المصلحة.
6. كرر الخطوة 5.1.3.
7. اختياري: إذا كانت هناك حاجة إلى صورة تمثيلية (JPEG) بنتيجة أونميكس، اختر الإعدادات المطلوبة في "لوح ألوان أداة" | صورة ضبط (لون الجدول، binning، على النقيض، إلخ.)، ثم انقر فوق تصدير رسومات في إطار أونميكس تصدير طريقة عرض الصورة الحالية كصورة.
8. احفظ الملف غير مخلوط: الملف | حفظ باسم | اختر مجلد و موافق.
9. كرر هذه العملية مع بقية أيام الرصد ومع جميع الحيوانات.
إعداد رويس وإشارة التحديد الكمي
1. انقر فوق استعراض ، وحدد الملف غير مختلط (راجع الخطوة 5.1.8) من الفائدة يتم تحليلها. سوف تظهر نافذة جديدة.
2. انقر فوق إضافة إلى قائمة تشمل جميع الملفات غير مختلط من كل الحيوانات في نقاط زمنية مختلفة وثم انقر فوق تحميل كمجموعة. يجب أن تظهر كافة الصور كسلسلة واحدة.
3. اذهب إلى نافذة لوح ألوان أداة : انقر خارج المربع مقياسنديفيدوال للحصول على جميع الصور على نفس المقياس.
4. انقر نقراً مزدوجاً فوق في صورة واحدة في التسلسل وإنشاء عائد على منطقة الاهتمام باستخدام التسلسل التالي. انتقل إلى أدوات العائد على الاستثمار وحدد الخيار 1 السيارات و كونتر وانقر على شكل دائرة الظهور، ووضعه في المركز إشارة الفلورسنت وثم انقر فوق إنشاء في الإطار المعروض.
  ملاحظة: هذا تلقائياً يبرز بكسل مع كثافة الأسفار أعلاه القيم الأساسية (أي، الآفة) ويقوم بإنشاء شكل المنطقة التي تحتضن بكسل المبين.
5. نسخ الشكل عائد الاستثمار الذي تم إنشاؤه ولصق في منطقة خلفية حيث يوجد أي إشارة.
6. انقر فوق مقياس رويس | تحديد الكل لعرض قيم شدة الأسفار. الشروع في تحديد قيم البيانات باستخدام الماوس، انقر فوق الزر الأيمن، اضغط نسخ ولصق في جدول بيانات.

6-بيانات (إشارة الفلورسنت) تطبيع

حدد وقت الأولى النقطة التي إشارة الكثافة القصوى. للانتقال إلى تطبيع إشارة عند كل نقطة الوقت باستخدام الصيغة:
إشارة كثافة في كل نقطة في الوقت الذي لوحظ شدة الإشارة القصوى أثناء الوقت) x 100.

النتائج

هنا، يمكننا وصف عملية لإنشاء نموذج مغايرة لبطانة الرحم التي يتم الاحتفاظ ببنية الآفات بغرس قطع بطانة الرحم البشري المسمى فلوريسسينتلي في الفئران المناعة، مما يسمح لغير الغازية رصد تطور الآفة. وسم من شظايا بطانة الرحم يتحقق عن طريق العدوى مع إتش هندسيا للتعبير عن مشري، ب...

Discussion

ويصف البروتوكول هنا بالتفصيل تنفيذ نموذج الحيوان من بطانة الرحم التي يتم الاحتفاظ بنية غرس العمارة الآفات بينما يسمح في نفس الوقت تقييم الوقت الحقيقي للأسفار تنبعث حسب مشري المسمى أنسجة بطانة الرحم. في هذا البروتوكول، يصف لنا استخدام محددة المجراة في نظام التصوير والبرامج ذات الصلة لتقي...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان تدعمها وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية من خلال برنامج سيرفيت ميغيل [CP13/00077] تأسيسه قبل FEDER (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية) الإسبانية ومنحت للدكتور ر. غوميز إلى جانب المنح "معهد كارلوس الثالث للصحة" الدكتور R غوميز [PI14/00547 و PI17/02329] وزين ألف كانو [PI12/02582].

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	---	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g	B-BRAUN	---	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	---	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	---	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	---	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator

References

Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: