Monitorização não invasiva do tamanho da lesão em um modelo de Mouse heteróloga de endometriose

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo de fluorescente etiquetadas fragmentos endometriais humanas transplantada em ratos. O método permite estudar os efeitos das drogas de escolha no tamanho da lesão endometriotic através do acompanhamento e quantificação da fluorescência emitida pelo repórter fluorescente em tempo real

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para a implementação de um modelo de mouse heteróloga em que a progressão da endometriose pode ser avaliada em tempo real através de monitorização não-invasiva da fluorescência emitida pelo implante ectópico humano tecido endometrial. Para essa finalidade, biópsias do endométrio humano são obtidas a partir de doação de oócito em curso de mulheres de doador. Fragmentos de endométrio humanos são cultivados na presença de adenovírus projetados para cDNA expresso para o repórter mCherry de proteína fluorescente. Após a visualização, rotulado tecidos com uma taxa ideal de fluorescência após infecção posteriormente são escolhidos para a implantação em ratos do destinatários. Uma semana antes da cirurgia de implante, destinatários ratos são oophorectomized, e pelotas de estradiol são colocadas por via subcutânea para sustentar a sobrevivência e o crescimento das lesões. No dia da cirurgia, os ratos são cavidade peritoneal e anestesiada, acessada através de uma incisão de pequeno (1,5 cm) pelo linea-alba. Implantes fluorescente etiquetados são depilar, brevemente embebidos em cola e anexados à camada peritoneal. As incisões são suturadas e animais deixaram de recuperar por um par de dias. Fluorescência emitida por implantes endometriotic geralmente não invasiva é monitorada a cada 3 dias por 4 semanas com um sistema de imagens in vivo. Variações no tamanho dos implantes endometriotic podem ser estimadas em tempo real pela quantificação do sinal de mCherry e normalização contra o tempo-ponto inicial mostrando a intensidade da fluorescência máxima.

Roedores pré-clínicos tradicionais de modelos de endometriose não permitem monitoramento invasivo da lesão em tempo real, mas bastante permitam a avaliação dos efeitos das drogas na analisada no ponto final. Este protocolo permite rastrear lesões em tempo real e é mais útil para explorar o potencial terapêutico de drogas em modelos pré-clínicos de endometriose. A principal limitação do modelo gerado, portanto, é que o monitoramento não-invasivo não é possível durante longos períodos de tempo devido a expressão epissomal Ad-vírus.

Introdução

Endometriose é uma doença ginecológica crônica iniciada pela implantação do endométrio funcional fora da cavidade uterina. Gravidez ectópica lesões crescem e induzem processos inflamatórios, levando a crônica pélvica dor e infertilidade¹. Estima-se que acima de 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva são afetadas por endometriosis2, e está presente em aproximadamente 40-50% das mulheres inférteis³. Os tratamentos farmacológicos atuais para endometriose são incapazes de erradicar completamente as lesões e não é livre de efeitos colaterais^4,5. A pesquisa das terapias mais eficientes requer de refinamento de modelos animais existentes da endometriose, de tal forma que lesões humanas podem ser imitadas adequadamente, e os efeitos dos compostos no tamanho da lesão entre outros podem ser avaliados de perto.

Modelos de primatas têm sido utilizados para imitar a endometriose por responsável ectópica lesões histologicamente idênticas e em sites semelhantes como seres humanos^6,7,8; no entanto, as preocupações éticas e os elevados custos económicos relacionam à experimentação com primatas limite seu uso⁹. Consequentemente, a utilização de pequenos animais, especialmente roedores, para a implementação de modelos in vivo de endometriose continua a ser favorecida, pois permite estudos com maior número de indivíduos de^10,11. Endometriose pode ser induzida nestes animais transplantando ou pedaços de roedores cornos uterinos ("modelos homólogos")^12,13 ou tecido endometrial/endometriotic humano para sites de gravidez ectópica (modelos heterólogos)¹⁴ . Em contraste com os humanos, roedores não derramem seu tecido endometrial e, assim, endometriose não pode ser desenvolvida espontaneamente nestas espécies. Portanto, homólogo rato modelos da endometriose tem sido criticados, devido ao fato de que implantou o tecido uterino de gravidez ectópica do mouse não reflete as características de lesões endometriotic humana¹⁵.

Fisiologia adequada da endometriose pode ser imitada nos modelos heterólogos de endometriose, onde fragmentos de endométrio humanos frescos são implantados em animais imunodeficientes. Em modelos convencionais heterólogos, os efeitos terapêuticos de compostos de interesse são comumente avaliados no ponto final pela avaliação do tamanho da lesão com o uso de compassos de calibre¹⁶. Uma limitação óbvia é que, como tal, modelos animais de ponto de extremidade não permitem estudar a dinâmica de implantação ou desenvolvimento de lesão endometriotic ao longo do tempo. Uma limitação adicional é que o uso de compassos de calibre não permite medições precisas de tamanho da lesão. Na verdade, o erro-padrão fornecido por pinças é na mesma faixa (ou seja, milímetros) como o tamanho das lesões implantado em ratos, restringindo assim a capacidade dessas ferramentas para detectar variações reais em tamanho.

Neste documento, a fim de superar tais limitações, descrevemos a geração de um modelo de mouse heteróloga da endometriose, em que é engenharia de tecidos humanos implantado para expressar uma proteína fluorescente m-cereja de repórter. Deteção do sinal fluorescente com um sistema de imagem apropriado permite monitoramento invasivo do status de lesão com quantificação simultânea de seu tamanho em tempo real. Assim, nosso modelo fornece vantagens evidentes quando comparado aos modelos convencionais de ponto de extremidade, pois traz a oportunidade de monitoramento não-invasivo em tempo real e a possibilidade de realizar mais objectivo e estimativa exacta das variações no tamanho da lesão.

Protocolo

O uso de amostras de tecido humano foi aprovado pelo Comitê de ética do Hospital Universitario La Fe e Conselho de revisão institucional. Todos os pacientes fornecidos escrito consentimento informado. O estudo envolvendo animais foi aprovado pelo Comitê de cuidados institucionais Animal no Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, e todos os procedimentos foram realizados seguindo as orientações para o cuidado e o uso de mamíferos de institutos nacionais de de saúde.

1. pré-processamento e coleta de tecido endometrial

1. Obter uma biópsia de boa qualidade de aspirado endometrial humana usando uma cânula ligada a um dispositivo de sucção. Despeje a biópsia em um frasco contendo 10 mL de estéril, soro fisiológico e lave com leve agitação manual.
   Nota: Procedimentos sobre como obter biópsias de boa qualidade têm sido descritas anteriormente¹⁷.
2. Lave a biópsia de qualquer restante de sangue ou muco. Repita o processo derramando o tecido para frascos contendo soro fresco como muitos dentes conforme necessário até que se observa tecido limpo.
3. Transferência de fragmentos de biópsia com uma aparência saudável em uma solução contendo 10 mL de completam meio de médio (DMEM) modificado águia de Dulbecco com 10% de soro Fetal bovino (FBS) e 1% de solução antibiótico Antimicótico.
4. Despeje o conteúdo em uma placa de Petri de 10 cm e prossiga para cortar o tecido em pedaços de³ 5 – 10 mm com um par de bisturis.

2. adenovírus transfeccao de fragmentos endometriais

Nota: Todos os materiais que vão ser utilizadas no processo devem ser introduzidos no bairro antecipadamente. Retire tudo o que não vai ser usado no processo e colocar um balão com água sanitária. Todo o material que entra em contato com o vetor de adenovírus deve ser desinfectado com água sanitária antes de descartá-lo no recipiente de risco biológico.

1. Uma vez que a biópsia foi cortada, tome uma nova placa de Petri. Pipete várias gotas DMEM µ l de 30 – 50 de propagação ao longo de todo o prato. Deixe espaço suficiente entre gotas para que eles não entraram em contato.
2. Auxiliada com uma agulha de seringa, coloque um pedaço único de fragmento dentro de cada uma das gotas médias.
   Nota: Cada gota deve conter uma única peça de endométrio.
3. Preparar a solução de trabalho de Ad-mCherry diluindo 01:20 da mCherry adenovírus solução [1 x 10¹⁰ pfu/mL]) em DMEM médio sem antibióticos (DMEM + 10% filtrado FBS).
4. Dispense a 100 – 200 μL da solução Ad-mCherry por bem sobre uma placa de 96 poços, enchimento como muitos poços como fragmentos estão disponíveis no prato de Petri cai (passo 2.2). Além disso, preencha pelo menos 3 poços com meio DMEM livre de adenovírus como controlo negativo.
5. Auxiliada com uma agulha de seringa, cada um dos fragmentos na prato de Petri (passo 2.2) transferi para cada um dos poços contendo solução ad-mCherry da placa de 96 poços.
6. Coloque a 96-placa contendo os fragmentos endometriais com Ad-mCherry solução em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO₂ para 16 h.
7. Lavar os adenovírus restantes no meio pela transferência de tecidos para uma nova placa de 96 poços, preenchida com meio DMEM completo (com antibióticos-antimicóticos, livre de adenovírus) e incube por 37 ° C com 5% de CO₂ por 24 – 48 h.
   Nota: Lembre-se de cobrir com água sanitária todas as placas bem e dicas que entraram em contato com Ad-vírus antes de descartar o recipiente de risco biológico.
8. Retire a placa da incubadora e colocá-la sob um microscópio de fluorescência em 568 nm (canal vermelho) para testar a rotulagem ideal.
9. Escolha os fragmentos mais brilhantes e colocá-los em uma nova placa de 96 poços, com fresco meio DMEM completo (com antibióticos-antimicóticos, livre de adenovírus).
10. Selar a placa bem com um filme plástico da parafina e transportá-lo para a área de animais isentos de agentes patogénicos específicos para implantação dos fragmentos endometriais em animais destinatários.

3. a geração do modelo de Mouse de endometriose

Nota: Usar de 6-8 semanas-velho modelo nu (ou cepas imunocomprometidas semelhantes) ratos fêmeas alojados em condições específicas de patógeno – free, como animais de destinatário. Para evitar variações hormonais do ciclo-dependente e, simultaneamente, crescimento de lesão de combustível com estradiol, os animais são ovariectomizadas e colocado com 60 dias de lançamento cápsulas contendo 18 mg de 17 βeta-Estradiol (17 β-E₂). Ooforectomia e pelota colocação tem que ser realizada pelo menos uma semana antes da enxertia fragmentos endometriais em animais os destinatários.

1. Ooforectomia
   Nota: Prepare material esterilizado cirúrgico em um capuz. Prepare o equipamento de anestesia e uma zona de recuperação pós-cirúrgica pronta na mesma sala.
   1. Realize uma injeção subcutânea de derivado de morfina na dose de 5 mg/kg por rato. Deixe descansar por 30 min após a injeção, assim como analgésicos efeitos da droga podem manifestar-se-os ratos.
   2. Conecte a inalação anestesia equipamentos e deixar oxigênio e isoflurano (2% mg/kg) fluxo durante alguns minutos em uma câmara selada anestesia.
   3. Apresente o animal para a câmara de anestesia de isoflurano. Esperar por 3 – 5 min e verifique que os animais são totalmente anestesiados pressionando uma das suas patas. Transferir o animal para a área de cirurgia e manter a anestesia, colocando uma máscara com fluxo contínuo de gás de isoflurano cobrindo as vias aéreas respiratórias.
   4. Após a desinfecção da área com chlorohexidine, realizar uma incisão de costal transversa 0,5 cm aproximadamente na altura do quadril com uma tesoura afiada.
   5. Separe a pele do músculo para obter acesso à cavidade abdominal, identificar o branco do tecido que envolve o ovário e retrair o ovário com a pinça de dissecação.
   6. Um nó em torno do oviduto com sutura absorvível e apertá-la para garantir a hemostasia adequada antes de excisão do ovário.
   7. Fechar a camada muscular com sutura de 6-0 e em seguida, feche a pele com sutura não absorvível de 6-0. Limpe a área novamente com solução anti-séptica.
   8. Repita o procedimento para remover o ovário contra lateral.
2. Estradiol implante de pelotas
   Nota: Cuide-se que o animal é anestesiado durante a cirurgia de ooforectomia colocar pelotas nesse ponto.
   1. Imediatamente após a conclusão do procedimento de ooforectomia, limpe a pele com solução anti-séptica, em torno do pescoço e fazer uma incisão transversal subcutâneo pequeno (0,5 cm) com uma tesoura afiada na nuca.
   2. Use a tesoura para dissecar a pele do músculo, fazendo um bolso grande o suficiente para permitir a colocação de Pelotas.
   3. Inserir a pelota contendo 18 mg de 17ß-E₂ e sutura da pele com uma sutura não absorvível de 6-0. Limpe a área novamente com solução anti-séptica.
   4. Coloque o animal na zona de recuperação e administrar uma dose ideal de analgesia de longa duração para aliviar o período de recuperação.
3. Cirurgia de implante endometrial
   Nota: Permitir que pelo menos um período de sete dias de quarentena para permitir a recuperação total dos animais após ooforectomia antes de iniciar a cirurgia de implante endometrial fragmento. Para sincronização ideal com rotulagem do tecido, recolha a biópsia 2 – 3 dias antes da cirurgia de implante, a fim de evitar a cultura a longo prazo de explantes.
   1. Prepare a sala cirúrgica na zona livre de patógeno específico antecipadamente. Prepare o capô com todo o material cirúrgico necessário, o equipamento de anestesia e a zona de recuperação pós-cirúrgica também.
   2. Trazer os animais para a sala, realizar uma injeção subcutânea de um derivado de morfina na dose de 5 (mg/kg) em cada rato. Deixe descansar por 30 min após a injeção, então efeitos analgésicos da droga podem manifestar-se-os ratos.
   3. Conecte a inalação anestesia equipamentos e deixar oxigênio e isoflurano (2% mg/kg) fluxo durante alguns minutos em uma câmara selada anestesia.
   4. Antes de iniciar a cirurgia, mova a placa contendo fluorescente etiquetado fragmentos (da etapa 2.10) ao subúrbio, abrir e despeje os fragmentos de uma placa de Petri para um manuseamento mais fácil.
   5. Apresente o animal para a câmara de anestesia de isoflurano. Esperar por 3 – 5 min e verifique que os animais são totalmente anestesiados pressionando uma das suas patas. Transferir o animal para a área de cirurgia e manter a anestesia, colocando uma máscara com fluxo contínuo de gás de isoflurano cobrindo as vias aéreas respiratórias.
   6. Lugar o animal anestesiado face para cima. Desinfete a área ventral. Realizar uma incisão longitudinal de 1,5 cm no abdômen com tesoura afiada e separar a pele do músculo. Em seguida, execute uma incisão longitudinal de 1,5 cm no músculo para acessar a cavidade peritoneal.
   7. Segure a borda esquerda da parede muscular abdominal com mini pinça e dobrá-lo tentando expor a face interna do peritônio do lado de fora.
   8. Leve um implante endometrial com mini pinça, embebê-lo brevemente em um adesivo de cianoacrilato de n-butil-éster e colocá-lo no peritônio, onde irá obter anexado. Deixe secar por alguns segundos. Repita as etapas 3.3.6 e 3.3.7 para colocar um implante no lado contralateral do peritônio.
   9. Fechar a camada muscular com uma sutura absorvível 6-0 e em seguida, feche a pele com um não-absorvíveis sutura de 6-0. Limpe a área novamente com solução anti-séptica.
   10. Coloque o animal na zona de recuperação e administrar uma dose ideal de analgesia de longa duração.

4. na imagem fluorescente de Vivo com um Vivo em sistema de imagem

1. O dispositivo de sistema de imagens in vivo, inicializar o programa e deixe a câmera CCD para esfriar por alguns minutos.
2. Prepare o equipamento de anestesia por inalação. Abra o fluxo de isoflurano em 2% por um par de min para encher a câmara de anestesia. Prepare a zona de recuperação pós-anestesia.
3. Uma vez que o programa começou e a câmera CCD arrefecidas, clique na ferramenta Assistente de imagem : um tutorial começa com uma série de janelas consecutivas exibido, cada uma correspondendo a um parâmetro de interesse, com várias opções disponíveis para ser escolhido clicando na caixa correspondente. Avançar com o tutorial, selecionando as caixas apropriadas em cada janela e clique no botão mover para o próximo conjunto de parâmetros com a seguinte sequência Okey .
   1. Marque a caixa de Epiluminescence para o parâmetro de fluorescência, marque a caixa de mCherry para o parâmetro de pares de filtro. Marque as caixas de modo de fotografar e Confirmar o foco e selecione a caixa automática para o parâmetro de exposição.
4. Uma vez que o instrumento foi criado, mova um animal dentro da câmara de anestesia. Quando totalmente anestesiados, transferir o animal dentro do na vivo gaiola de sistema de imagem e colocá-lo de lado até com sua cabeça dentro de um túbulo conectado à máquina de anestesia. Feche a tampa e clique em adquirir para monitoramento.
5. Adquirir as imagens que aparecem (um total de cinco imagens, uma imagem para cada par de filtros selecionados) e salvar os dados clicando no botão Salvar como . Mova o mouse para a área de recuperação pós-anestesia. Repita o processo com os restantes animais.
6. Repita monitoramento duas ou três vezes por semana para acompanhar o sinal adequadamente durante o decorrer do tempo.
7. Prossiga para sacrificar o animal ao final do curso tempo por asfixia de CO₂ .

5. quantificação das imagens de fluorescência In Vivo

1. Segregação de fluorescência real através da desagregação de imagem:
   1. Abra o In Vivo de análise de imagem acoplado programa de Software.
   2. Escolha o arquivo "Sequenceinfo" para iniciar a análise. Aparecerão duas janelas: "Sequência view" e "Paleta de ferramentas". Escolher a Paleta de ferramentas e uma vez que foi exibido no menu, selecione as seguintes opções.
   3. Selecione correções e clique na caixa de Subtração de fundo FL adaptável para remover os indesejáveis sinais fluorescentes a partir dos dados de imagem luminescentes. Escolha o limiar de maior interesse e clique em definir.
   4. Clique Spectral Unmixing, selecione os comprimentos de onda de interesse, o método escolhido para misturar (biblioteca, guiada, automática ou manual) e, em seguida, clique Iniciar Unmix.
   5. Selecione a imagem de Unmixed correspondente ao sinal de mCherry e dê um duplo clique. Uma nova janela aparecerá com a imagem final do sinal de interesse.
   6. Repita a etapa 5.1.3.
   7. OPCIONAL: Se uma imagem representativa (JPEG) do resultado unmix é necessário, escolher as configurações desejadas no paleta de ferramentas | Ajuste de imagem (cor tabela binning, contraste, etc.) e, em seguida, clique em Exportar gráficos na janela unmix para exportar o atual modo de exibição de imagem como uma imagem.
   8. Salve o arquivo misturado: arquivo | Salve como | Escolha a pasta e Okey.
   9. Repita o processo com o resto dos dias monitoramento e com todos os animais.
2. ROIs configurar e quantificação do sinal
   1. Clique em procurar e selecione o arquivo Unmixed (consulte a etapa 5.1.8) de interesse para ser analisado. Uma nova janela aparecerá.
   2. Clique em Adicionar à lista para incluir todos os arquivos misturados de cada animal em pontos diferentes de tempo e, em seguida, clique em Load como um grupo. Todas as imagens devem aparecer como uma única sequência.
   3. Vá para a Paleta de ferramentas janela: clique na caixa eusubjugado escala para obter todas as imagens na mesma escala.
   4. Clique duas vezes em uma imagem da sequência e criar um ROI na zona de interesse usando a seguinte sequência. Vá em Ferramentas de ROI e selecione Countour e Auto 1 opção, clique na forma de círculo aparecendo, coloque-o sobre o centro do sinal fluorescente e clique em criar na janela exibida.
      Nota: Isto destaca pixels com uma intensidade de fluorescência acima dos valores de fundo (ou seja, lesão) e automaticamente gera uma forma cuja área abrange os pixels delineados.
   5. A forma ROI criada de copiar e colar em uma zona de fundo onde não há nenhum sinal.
   6. Clique na medida ROIs | Selecione todos para exibir valores de intensidade de fluorescência. Proceda para selecionar os valores de dados com o mouse, clique com botão direito, pressione copiar e colar em uma folha de cálculo.

6. dados (sinal fluorescente) normalização

1. Selecione o ponto inicial de tempo com um sinal de que a intensidade é máxima. Proceda para normalizar o sinal em cada ponto de tempo, usando a fórmula:
   Sinal de intensidade em cada ponto de tempo / intensidade de sinal máxima observada no decurso do tempo) x 100.

Resultados

Aqui, descrevemos o processo para criar um modelo heterólogo da endometriose, em que a arquitetura das lesões é preservada pela implantação fluorescente etiquetados pedaços de endométrio humano em ratos imunodeprimidos, permitindo que não-invasiva monitoramento da progressão da lesão. Rotulagem de fragmentos endometriais é alcançado por infecção com adenovírus projetado para mCherry express, uma proteína que emitem fluorescência na região do infravermelho próxima. Na

Discussão

O protocolo detalhado neste documento descreve a implementação de um modelo animal de endometriose, em que a arquitetura de implantação de arquitetura de lesões é preservada enquanto simultaneamente, permitir avaliação em tempo real da fluorescência emitida pelo mCherry rotulado de tecido endometrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um sistema de imagens in vivo específico e software relacionado de forma não-invasiva avaliar fluorescência emitida pela lesão rotulada. Cada usuário deve adaptar...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	---	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g	B-BRAUN	---	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	---	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	---	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	---	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator