子宫内膜异位症异种小鼠病变大小的无创监测

摘要

在这里, 我们提出了一个方案的现场成像荧光标记的人子宫内膜片段移植到小鼠。该方法通过实时监测和定量荧光记者发出的荧光, 研究选择的药物对子宫内膜异位细胞病变大小的影响

摘要

在这里, 我们描述了一个协议, 实现了一个异源小鼠模型, 其中子宫内膜异位症的进展可以通过无创监测所植入的异位人类子宫内膜组织发出的荧光实时评估。为此, 从正在进行的卵母细胞捐献的供体妇女身上获得人体子宫内膜活检。人类子宫内膜片段是在腺病毒存在的情况下培养的, 这些腺病毒的设计是为了表达 cdna, 为报告荧光蛋白 mcherry。在可视化之后, 在接受者小鼠的植入中选择感染后荧光率最佳的标记组织。植入手术前一周, 受者小鼠被进行卵巢切除, 雌二醇颗粒被皮下放置, 以维持病变的存活和生长。手术当天, 小鼠被麻醉, 腹膜腔通过一个小 (1.5 厘米) 的切口通过线-阿尔巴进入.荧光标记的植入物被推状, 短暂浸泡在胶水中, 并附着在腹膜层。对氯感进行缝合, 动物离开后恢复几天。子宫内膜异位植入物发出的荧光通常每3天通过体内成像系统进行为期4周的非侵入性监测。通过对 mcherry 信号进行定量和对显示最大荧光强度的初始时间点的归一化, 可以实时估计子宫内膜植入物大小的变化。

子宫内膜异位症模型的传统临床前啮齿类动物不允许对病变进行实时非侵入性监测, 而是允许评估在终点检测的药物的效果。该方案允许一个人实时跟踪病变, 更有助于探索药物在子宫内膜异位症临床前模型中的治疗潜力。由此产生的模型的主要局限性是, 由于 Ad-virus 的会代表达, 非侵入性监测不可能长期进行。

引言

子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病, 由子宫腔外功能性子宫内膜的植入引起。异位病变生长和诱发炎症过程, 导致慢性盆腔疼痛和不孕¹。据估计, 多达10-15% 的育龄妇女受到子宫内膜异位症2的影响, 大约40-50% 的不孕妇女^存在。目前子宫内膜异位症的药物治疗不能完全根除病变, 不具有副作用^4,5。更有效的治疗方法的研究要求完善现有的子宫内膜异位症动物模型, 使人类病变可以被适当地模仿, 化合物对病变大小的影响等可以仔细评估。

灵长类动物模型已被用来模仿子宫内膜异位症植入异位病变组织学上相同, 并在类似的地点, 在人类^6,7,8;然而, 与灵长类动物试验有关的伦理问题和高昂的经济成本限制了它们的使用。因此, 使用小动物, 特别是啮齿类动物, 实施子宫内膜异位症的体内模型继续受到青睐, 因为它允许对更多的人^进行研究 10^,11。子宫内膜异位症可以诱导这些动物通过移植到异位点 (异质模型)^12, 13 或人类子宫内膜子宫内膜异位体组织 (异质模型) 12, 或人类子宫内膜子宫内膜异位体组织 14.与人类不同的是, 啮齿类动物不会脱落其子宫内膜组织, 因此子宫内膜异位症不能在这些物种中自发发展。因此, 同种异体子宫内膜异位症模型因植入异位小鼠子宫肌组织的事实而受到批评, 不能反映人类子宫内膜异位症病变的特点15。

子宫内膜异位症的适当生理可在异种子宫内膜异位症模型中进行模拟, 在这些模型中, 新鲜的人子宫内膜片段被植入免疫缺陷的动物体内。在传统的异源模型中, 通常通过使用卡钳¹⁶评估病变大小来评估感兴趣的化合物的治疗效果。一个明显的局限性是, 因此, 端点动物模型不允许研究植入动力学或子宫内膜异位症病变的发展随着时间的推移。另一个限制是, 使用卡钳不允许准确测量病变大小。事实上, 卡钳提供的标准误差与小鼠植入病变的大小在相同的范围 (即毫米), 从而限制了这些工具检测大小实际变化的能力。

为了克服这些限制, 本文描述了子宫内膜异位症的异源小鼠模型的产生, 在该模型中植入人体组织的工程来表达记者 m-cherry 荧光蛋白。通过适当的图像系统检测荧光信号, 可以对病变状态进行非侵入性监测, 同时实时量化其大小。因此, 与传统端点模型相比, 我们的模型提供了明显的优势, 因为它带来了实时非侵入性监测的机会, 并有可能对病变大小的变化进行更客观、更准确的估计。

研究方案

la fe 大学机构审查委员会和道德委员会批准使用人体组织标本。所有患者均提供书面知情同意。这项涉及动物的研究得到了瓦伦西亚国家调查中心动物机构护理委员会的批准, 所有程序都是按照国家研究所的哺乳动物护理和使用准则进行的的健康。

1. 子宫内膜组织收集和预处理

1. 通过使用连接在吸力装置上的插管, 获得高质量的人子宫内膜吸气活检。将活检物倒进含有10毫升无菌盐水的烧瓶中, 用温和的手动搅拌清洗。
   请注意:关于如何获得高质量活检的程序先前已描述^{过 17}。
2. 清洗任何剩余血液或粘液的活检。重复这个过程, 将组织倒入含有新鲜盐水的烧瓶, 根据需要尽可能多地刺, 直到观察到组织被清洁。
3. 将具有健康外观的活检片段转移到含有10毫升的溶液中, 该溶液含有10毫升的完整的 dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 培养基, 含有10% 的胎儿牛血清 (fbs) 和1% 的抗生素抗真菌溶液。
4. 将含量倒入10厘米的培养皿中, 然后用一对头皮将组织切割成5-10 毫米³块。

2. 子宫内膜碎片腺病毒转染

请注意:在这个过程中将要使用的所有材料都应提前在引擎盖中引入。取出所有在这个过程中不会使用的东西, 并放置一个带漂白剂的烧瓶。所有与腺病毒载体接触的材料在将漂白剂丢弃在生物危害容器中之前, 必须用漂白剂进行消毒。

1. 一旦活检被切碎, 就吃一个新的培养皿。移液器多个 30–50μl dmem 滴在整个盘中扩散。在掉落之间留出足够的空间, 这样它们就不会接触到。
2. 用针头连接到注射器上, 在每个介质滴内放置一块片段。
   请注意:每滴应包含一块子宫内膜。
3. 准备 ad-mcherry 工作溶液, 稀释1:20 的 mcherry 腺病毒库存溶液 [1 x¹⁰ 10 pfu/ml]) 到 dmem 介质, 没有抗生素 (dmem + 10% 过滤 fbs)。
4. 在96孔板上每口井分配100–200μl 的 ad-200 微米的 ad-mcherry 溶液, 在 petri 盘液中填充尽可能多的井, 如碎片 (步骤 2.2)。此外, 用腺病毒游离 dmem 培养基填充至少3口井作为阴性对照。
5. 用针头连接到注射器上, 将 petri 盘中的每个碎片 (步骤 2.2) 转移到96孔板中含有 ad-mchery 溶液的每口井。
6. 将96片含有子宫内膜碎片的子宫内膜碎片与 ad-mcherry 溶液放入37°c 的孵化器中, 5% co 2 为 16小时。
7. 将培养基中剩余的腺病毒放入一个新的96孔板, 其中充满了完整的 dmem 培养基 (抗生素抗药, 不含腺病毒), 并以5% 的 co2 孵育 37°c, 以 24–48 h 的速度孵育。
   请注意:记得在丢弃到生物危害容器中之前, 要用漂白剂覆盖所有接触阿氏病毒的井板和小贴。
8. 从孵化器中取出板, 并将其置于568纳米 (红色通道) 的荧光显微镜下, 以测试最佳标记。
9. 选择最辉煌的碎片, 并把它们放入一个新的96孔板与新鲜完整的 dmem 介质 (与抗生素-抗药, 没有腺病毒)。
10. 用塑料石蜡膜很好地密封盘子, 并将其输送到无特定病原体的动物区域, 以便将子宫内膜碎片植入接受者的动物体内。

3. 子宫内膜异位症小鼠模型的生成

请注意:使用6-8周的裸鼠 (或类似的免疫功能菌株) 雌性小鼠居住在特定的病原体-无病原体的情况下, 作为接受动物。为了避免激素与环合相关的变化, 同时燃料病变生长与雌二醇, 动物被卵巢切除, 并放置60天释放胶囊含有18毫克的17β-雌二醇 (17β-e₂)。卵主动切除术和颗粒置入必须在将子宫内膜碎片移植到受者动物之前至少一周进行。

1. 卵巢切除术
   请注意:准备在引擎盖中使用手术消毒材料。准备麻醉设备和手术后恢复区准备在同一个房间。
   1. 以每只小鼠 5 mg kg 的剂量进行皮下注射吗啡衍生物。注射后让小鼠休息 30分钟, 使药物的镇痛作用得以体现。
   2. 连接吸入麻醉设备, 让氧气和异氟醚 (2% mg/kg) 流动几分分钟进入密封麻醉室。
   3. 将动物引入异氟烷麻醉室。等待 3-5分钟, 并检查动物是完全麻醉通过按它的爪子之一。将动物转移到手术区域, 并通过放置一个面膜, 使呼吸道上的异氟醚气体持续流动, 从而维持麻醉。
   4. 用氯己定消毒区域后, 用锋利的剪刀大约在臀部的高度进行一个约0.5 厘米的横向海岸切口。
   5. 将皮肤与肌肉分开, 进入腹腔, 识别卵巢周围的白色脂肪垫, 并用解剖钳收回卵巢。
   6. 用可吸收的缝线在输卵管周围系上一个结, 并将其拧紧, 以确保在切除卵巢之前保持适当的止血。
   7. 用6-0 可吸收缝合线关闭肌层, 然后用6-0 不可吸收的缝合线关闭皮肤。再次用防腐剂溶液清洁该区域。
   8. 重复该过程, 以删除对侧卵巢。
2. 雌二醇颗粒植入物
   请注意:注意动物在卵巢切除术中被麻醉, 以便在这一点上放置颗粒。
   1. 卵巢切除术完成后, 立即用颈部周围的防腐溶液清洁皮肤, 并在颈部用锋利的剪刀做一个横向皮下小 (0.5 厘米) 切口。
   2. 使用剪刀解剖皮肤从肌肉, 使口袋足够大, 以便放置颗粒。
   3. 插入含有18毫克 17β-e₂的颗粒, 用6-0 不可吸收的缝合线缝合皮肤。再次用防腐剂溶液清洁该区域。
   4. 将动物放入恢复区, 并给予最佳剂量的长效镇痛, 以缓解恢复期。
3. 子宫内膜植入物手术
   请注意:在开始子宫内膜碎片植入手术之前, 至少允许7天的隔离时间, 以便在卵巢切除术后完全恢复动物。为了与组织标记的最佳同步, 在植入手术前2-3天收集活检, 以避免外植体的长期培养。
   1. 提前准备好特定无病原体区的手术室。准备引擎盖与所有需要的手术材料, 麻醉设备和术后恢复区也。
   2. 将动物带到房间, 在每只小鼠身上以 5 (mg/kg) 的剂量进行吗啡衍生物的皮下注射。注射后让小鼠休息 30分钟, 这样药物的镇痛作用就可以体现出来。
   3. 连接吸入麻醉设备, 让氧气和异氟醚 (2% mg/kg) 流动几分分钟进入密封麻醉室。
   4. 在开始手术之前, 将含有荧光标记碎片 (从步骤 2.10) 的盘子移入引擎盖, 解开它的密封, 并将碎片倒入 petri 培养皿中, 以便于处理。
   5. 将动物引入异氟烷麻醉室。等待 3-5分钟, 并检查动物是完全麻醉通过按它的爪子之一。将动物转移到手术区域, 并通过放置一个面膜, 使呼吸道上的异氟醚气体持续流动, 从而维持麻醉。
   6. 将麻醉后的动物脸朝上。对腹侧区域进行消毒。用锋利的剪刀在腹部进行1.5 厘米的纵向切口, 并将皮肤与肌肉分开。然后, 在肌肉上进行一个1.5 厘米的纵向切口, 以进入腹腔。
   7. 用微型钳子握住腹部肌肉壁的左边缘, 并将其折叠起来, 试图暴露腹膜的内侧表面。
   8. 服用子宫内膜植入物与迷你推拿器, 将其短暂浸泡在正丁酯氰基丙烯酸酯胶粘剂中, 并将其放置在腹膜, 在那里它将得到连接。让它干几秒钟。重复步骤3.3.6 和3.3.7 将植入物放置在腹膜的对侧。
   9. 用可吸收的6-0 缝合线关闭肌肉层, 然后用不可吸收的6-0 缝合线关闭皮肤。再次用防腐剂溶液清洁该区域。
   10. 将动物放入恢复区, 并给予最佳剂量的长效镇痛。

4. 活体荧光成像系统

1. 打开体内成像系统设备, 初始化程序, 并允许 ccd 摄像机冷却几分时间。
2. 准备吸入麻醉设备。以2% 的速度打开异氟烷流动, 用几分钟的时间填充麻醉室。准备麻醉后恢复区。
3. 程序启动并冷却 ccd 摄像机后, 单击 "成像向导" 工具: 教程从显示一系列连续窗口开始, 每个窗口对应于感兴趣的参数, 并有多个可供选择的选项通过点击在相应的框中。通过在每个窗口中选择相应的框向前移动, 然后单击"确定"按钮移动到下一组参数, 其顺序如下。
   1. 选择荧光参数的"发光" 框, 为筛选器对参数选择 mcherry 框。选中 "照片" 模式和 "确认焦点" 框, 然后选择曝光参数的 "自动" 框。
4. 一旦仪器已设置好, 移动一个动物在麻醉室内。当完全麻醉时, 将动物转移到体内成像系统的笼子内, 并将其侧向, 头部放置在连接到麻醉机的小管内。合上盖子, 然后单击 "获取"进行监视。
5. 获取显示的图像 (共五个图像, 每个选择的筛选器一个图像), 并通过单击 "另存为" 按钮保存数据。将鼠标移动到麻醉后恢复区域。与剩余的动物重复此过程。
6. 每周重复监测两三次, 在时间过程中适当跟踪信号。
7. 在时间结束时, 通过_co2窒息进行祭祀动物。

5.活体荧光图像的定量

1. 通过图像解混来分离实际荧光:
   1. 打开活体成像分析耦合软件程序。
   2. 选择 "序列信息" 文件以开始分析。将出现两个窗口: "序列视图" 和 "工具调色板"。选择"工具调色板" , 一旦显示菜单, 请选择以下选项。
   3. 选择 "更正",然后单击 "自适应 fl 背景减法" 框, 从发光图像数据中删除不需要的荧光信号。选择最大兴趣的阈值, 然后单击 "设置"。
   4. 单击"光谱不混合", 选择感兴趣的波长、为取消混合而选择的方法 (库、引导、自动或手动), 然后单击 "开始不混合"。
   5. 选择与 mcherry 信号相对应的"未混合图像", 然后双击。将出现一个新窗口, 其中包含感兴趣信号的最终图像。
   6. 重复步骤5.1.3。
   7. 可选: 如果需要非混合结果的代表性图像 (jpeg), 请在工具面板中选择所需的设置图像调整(颜色表、分组、对比度等), 然后单击 "取消混合" 窗口中的"导出图形" 将当前图像视图导出为图像。
   8. 保存未混合的文件:文件另存为选择 "文件夹"和"确定"。
   9. 在监测日的其余部分和所有动物中重复这一过程。
2. rois 设置和信号量化
   1. 单击 "浏览" , 然后选择要分析的"未混合文件" (请参阅步骤 5.1.8)。将出现一个新窗口。
   2. 单击 "添加到列表" 以包括每个动物在不同时间点的所有未混合文件, 然后单击 "加载为组".所有图像必须以单个序列显示。
   3. 转到工具调色板窗口: 单击框 "我个人缩放" 以获取相同比例的所有图像。
   4. 在序列的一个图像中双击, 并使用以下序列在感兴趣的区域上创建 roi。转到 roi 工具并选择 "计数和自动 1 " 选项, 单击显示的圆形形状, 将其放置在显示的荧光信号的中心, 然后单击显示窗口上的"创建" 。
      注意: 这将自动突出显示背景值上方荧光强度的像素 (即病变), 并生成一个面积包含所述像素的形状。
   5. 复制创建的 roi 形状并粘贴到没有信号的背景区域上。
   6. 点击测量 roi选择 "全部"可显示荧光强度值。继续使用鼠标选择数据值, 单击右键, 按复制并粘贴到电子表格上。

6. 数据 (荧光信号) 正常化

1. 选择信号强度最大的初始时间点。使用公式继续在每个时间点对信号进行规范化:
   每个时间点的信号强度/在时间过程中观察到的最大信号强度) x 100。

结果

在这里, 我们描述了创建子宫内膜异位症异源模型的过程, 在这个模型中, 通过将荧光标记的人类子宫内膜植入免疫功能受损的小鼠来保存病变的结构, 从而允许非侵入性病灶进展的监测。子宫内膜碎片的标记是通过感染腺病毒设计来表达 mcherry, 一种在近红外区域的蛋白质发出荧光。在图 1中, 我们显示了在荧光显微镜下观察到的人类子宫内膜碎片感染...

讨论

本文详细介绍了子宫内膜异位症动物模型的实施情况, 在该模型中, 植入病变结构的结构得以保存, 同时允许实时评估 mcherry 发出的荧光标记的子宫内膜组织。在这个协议中, 我们描述了使用一个特定的体内成像系统和相关软件, 以非侵入性评估荧光发射的标记病变。每个用户都应根据其机构提供的特定成像设备和相关软件调整协议。通过将异氟烷气体麻醉机与体内成像系统结合, 在麻醉动物身上进?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	---	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g	B-BRAUN	---	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	---	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	---	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	---	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator