Monitoreo no invasivo del tamaño de la lesión en un modelo de ratón heterólogos de la Endometriosis

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes en vivo de fluorescencia etiquetadas fragmentos de endometrio humanos injertado en ratones. El método permite estudiar los efectos de los fármacos de elección en el tamaño de la lesión endometriotic a través del monitoreo y cuantificación de la fluorescencia emitida por el reportero fluorescente en tiempo real

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para la implementación de un modelo de ratón heteróloga en la que la progresión de la endometriosis puede evaluarse en tiempo real a través de monitoreo no invasivo de la fluorescencia emitida por tejido endometrial humano ectópico implantado. Para ello, se obtienen biopsias de endometrio humano de donación de ovocitos curso de mujeres donantes. Fragmentos de endometrio humanos son cultivadas en presencia de adenovirus diseñados para expresar cDNA para el reportero proteína fluorescente mCherry. Sobre visualización, etiquetados como los tejidos con una tasa óptima de fluorescencia después de infección son posteriormente seleccionados para la implantación en ratones receptores. Una semana antes de la cirugía de implantación, ratones receptores son ooforectomizadas, y pastillas de estradiol se colocan subcutáneamente para mantener la supervivencia y el crecimiento de las lesiones. En el día de la cirugía los ratones son anestesia y peritoneal cavidad accedida a través de una incisión pequeña (1,5 cm) por la linea-alba. Fluorescencia de etiquetado implantes son tweezed, brevemente empapados en pegamento y Unidos a la capa peritoneal. Incisiones se suturan, y animales a la izquierda para recuperar un par de días. Fluorescencia emitida por implantes endometriotic generalmente no invasiva se controla cada 3 días durante 4 semanas con un sistema de proyección de imagen in vivo. Variaciones en el tamaño de los implantes endometriósicos se pueden estimar en tiempo real por la cuantificación de la señal mCherry y normalización contra el momento inicial que muestra la intensidad de la fluorescencia máxima.

Tradicionales roedores preclínicas de los modelos de la endometriosis no permiten monitoreo no invasivo de la lesión en tiempo real pero que permiten la evaluación de los efectos de las drogas analizadas en el punto final. Este protocolo permite un seguimiento de las lesiones en tiempo real y es más útil para explorar el potencial terapéutico de los fármacos en modelos preclínicos de la endometriosis. La principal limitación del modelo así generado es que el monitoreo no invasivo no es posible durante largos períodos de tiempo debido a la expresión episomal del Ad virus.

Introducción

La endometriosis es un trastorno ginecológico crónico por la implantación del endometrio funcional fuera de la cavidad uterina. Lesiones ectópicas crecen y provocar procesos inflamatorios conduce a crónico pélvico dolor e infertilidad¹. Se estima que hasta a 10 – 15% de las mujeres en edad reproductiva sufren de endometriosis2, y está presente en aproximadamente el 40-50% de las mujeres estériles³. Los tratamientos farmacológicos para la endometriosis son incapaces de erradicar completamente las lesiones y no están libres de efectos secundarios^4,5. La investigación de terapias más eficientes requiere del refinamiento de los modelos existentes de animal de endometriosis de tal manera que las lesiones humanas pueden mímico apropiadamente y evaluar de cerca los efectos de compuestos en el tamaño de la lesión entre otros.

Modelos de primates se han utilizado para imitar la endometriosis implantación ectópicas lesiones histológicamente idénticas y en sitios similares como en los seres humanos^6,7,8; sin embargo, preocupaciones éticas y los altos costos económicos relacionados con la experimentación con primates límite su uso⁹. En consecuencia, el uso de pequeños animales, especialmente roedores, para la implementación de modelos in vivo de la endometriosis sigue ser favorecido ya que estudios con un mayor número de individuos^10,11. La endometriosis puede ser inducida en estos animales mediante el trasplante de pedazos de cuernos uterinos roedores "(modelos de homólogos")^12,13 o tejido endometrial/endometriotic humano a sitios ectópicos (modelos heterólogos)¹⁴ . A diferencia de los seres humanos, roedores no arrojar su tejido endometrial y así endometriosis puede no desarrollarse espontáneamente en estas especies. Por lo tanto, ratón homólogo modelos de la endometriosis han sido criticados debido a que implanta tejido uterino ratón ectópico no refleja las características de las lesiones endometriotic humana¹⁵.

Fisiología adecuado de la endometriosis se puede mímico en los modelos heterólogos de la endometriosis donde fragmentos de endometrio humanos frescos implantados en animales inmunodeficientes. En modelos convencionales heterólogos, los efectos terapéuticos de compuestos de interés se evalúan comúnmente en el punto final de la evaluación del tamaño de la lesión con el uso de pinzas¹⁶. Una limitación obvia es que, como tal, modelos animales extremo no permiten estudiar la dinámica de implantación o desarrollo de la lesión endometriotic con el tiempo. Una limitación adicional es que el uso de calibradores no permite mediciones precisas del tamaño de la lesión. De hecho, el error estándar proporcionado por pinzas es en el mismo rango (es decir, milímetros) como el tamaño de las lesiones en ratones, así limitar la capacidad de estas herramientas para detectar las variaciones reales en el tamaño.

Para superar tales limitaciones, adjunto, describimos a la generación de un modelo de ratón heterólogos de la endometriosis en la cual implantado tejido humano está diseñado para expresar una proteína fluorescente reportera m-Cherry. Detección de la señal fluorescente con un sistema apropiado de la imagen permite la monitorización no invasiva del estado de la lesión con cuantificación simultánea de su tamaño en tiempo real. Por lo tanto, nuestro modelo ofrece claras ventajas en comparación con los modelos convencionales de punto final que trae la oportunidad de en tiempo real monitoreo no invasivo y la posibilidad de hacer más objetiva y exacta estimación de las variaciones en el tamaño de la lesión.

Protocolo

El uso de muestras de tejido humano fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética del Hospital Universitario La Fe. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El estudio con animales fue aprobado por el Comité institucional de cuidado de animales en el Centro de Investigación Príncipe Felipe de Valencia, y todos los procedimientos fueron realizados siguiendo los lineamientos para el cuidado y uso de los mamíferos de los institutos nacionales de de la salud.

1. endometrio tejido recopilación y el pre-procesamiento

1. Obtener una biopsia de la buena calidad de humano aspirado endometrial mediante una cánula conectada a un dispositivo de succión. Vierta la biopsia en un frasco que contenga 10 mL de estéril salina y lavado con agitación manual suave.
   Nota: Procedimientos para obtener biopsias de buena calidad han sido previamente descrito¹⁷.
2. Lave la biopsia de cualquier resto sangre o moco. Repita el proceso vertiendo el tejido para matraces que contienen solución salina fresca tantos dientes como sea necesario hasta que el tejido se observa limpio.
3. Transferencia de fragmentos de biopsia con un aspecto saludable en una solución que contiene 10 mL de completan medio modificado Eagle de Dulbecco medium (DMEM) 10% suero bovino Fetal (FBS) y 1% solución antibiótico-antimicótico.
4. Verter el contenido en una caja de Petri de 10 cm y proceda a cortar el tejido en trozos de³ de 5-10 mm con un par de escalpelos.

2. adenoviral transfección de fragmentos de endometrio

Nota: Todos los materiales que van a ser empleadas en el proceso deben introducirse en la campana de antemano. Sacar todo lo que no va a ser utilizado en el proceso y colocar un frasco con cloro. Todo el material que entra en contacto con el vector adenoviral se debe desinfectar con lejía antes de desecharlo en el recipiente de riesgo biológico.

1. Una vez que la biopsia ha sido picada, tomar una nueva caja Petri. Pipetee múltiples gotas de 30-50 μl DMEM de propagación en todo el plato entero. Deje suficiente espacio entre gotas para que no entren en contacto.
2. Ayudado con una aguja conectada a la jeringa, colocar una sola pieza del fragmento dentro de cada una de las gotas medianas.
   Nota: Cada gota debe contener una sola pieza de endometrio.
3. Preparar la solución de trabajo Ad-mCherry diluyendo 1:20 de la solución madre de adenoviral mCherry [1 x 10¹⁰ pfu/mL]) en DMEM medio sin antibióticos (DMEM + 10% de SBF filtrada).
4. Dispensar 100 – 200 μL de la solución de Ad-mCherry por pozo en una placa de 96 pocillos, llenar tantos pozos como fragmentos están disponibles en las gotas de plato de Petri (criterio 2.2). Además, llenar por lo menos 3 pozos con medio DMEM libre de adenovirus como control negativo.
5. Ayudado con una aguja conectada a jeringa, transferir cada uno de los fragmentos en la caja Petri (paso 2.2) a cada uno de los pozos que contienen solución mCherry ad en la placa de 96 pocillos.
6. Lugar el 96-placa de pocillos que contienen los fragmentos de endometrio con Ad-mCherry solución en una incubadora a 37 ° C con 5% CO₂ para 16 h.
7. Lave hacia fuera el adenovirus restantes en el medio mediante la transferencia de tejidos en una nueva placa de 96 pocillos con medio DMEM completo (con antibióticos antimicóticos, libre de adenovirus) e incubar 37 º C con 5% CO₂ durante 24 – 48 h.
   Nota: No olvide cubrir con lavandina todas las placas bien y consejos que entraron en contacto con el virus de Ad antes de desechar el recipiente de riesgo biológico.
8. Sacar la placa de la incubadora y coloque debajo de un microscopio de fluorescencia en 568 nm (canal rojo) para probar el etiquetado óptimo.
9. Seleccionar los fragmentos más brillantes y colocarlos en una placa de 96 pocillos nueva con medio DMEM completo fresco (con antibióticos antimicóticos, libre de adenovirus).
10. Sellar la placa con una película plástica de la parafina y para transporte en el área de animales libres de patógenos específicos para la implantación de fragmentos de endometrio en animales receptores.

3. generación del modelo de ratón de Endometriosis

Nota: Use 6-8 semanas-viejo desnudo athymic (o cepas similares de immunocompromised) ratones hembra en condiciones específicas libres de patógenos, como animales receptores. Para evitar variaciones dependiente del ciclo hormonales y al mismo tiempo estimulan el crecimiento de lesión con el estradiol, los animales son ovariectomizadas y colocado con 60 días cápsulas que contienen 18 mg de 17 βeta-Estradiol (17β-E₂). Ooforectomía y pellets de colocación debe realizarse al menos una semana antes de injertar fragmentos de endometrio en los animales receptores.

1. Ooforectomía bilateral
   Nota: Preparar el material quirúrgico esterilizado en una campana. Preparar equipo de anestesia y una zona de recuperación post quirúrgica preparada en la misma habitación.
   1. Realizar una inyección subcutánea de derivado de la morfina a dosis de 5 mg/kg por el ratón. Que los ratones reposar 30 min después de la inyección así como analgésicos pueden manifestarse efectos de droga.
   2. Conecte la inhalación anestesia equipos y dejar oxígeno e isoflurano (2% mg/kg) el flujo durante unos minutos en una cámara sellada de la anestesia.
   3. Introducir el animal en la cámara de anestesia isoflurano. Espere 3-5 min y comprobar que los animales son anestesiados completamente pulsando una de sus patas. Transferir el animal a la zona de la cirugía y mantener la anestesia mediante la colocación de una mascarilla de flujo continuo de gas isoflurano cubriendo las vías aéreas respiratorias.
   4. Después de desinfectar la zona con clorohexidina, realizar una incisión costal transversal de 0,5 cm a la altura de la cadera con unas tijeras afiladas.
   5. Separar la piel y el músculo para obtener acceso a la cavidad abdominal, identificar la almohadilla de grasa blanca que rodea el ovario y retraiga el ovario con el fórceps de disección.
   6. Un nudo en el oviducto con sutura absorbible y apriete para asegurar adecuada hemostasia antes de suprimir el ovario.
   7. Cerrar la capa muscular con sutura absorbible 6-0 y luego cierre la piel con sutura no absorbible 6-0. Limpie la superficie nuevamente con solución antiséptica.
   8. Repita el procedimiento para quitar el ovario contra lateral.
2. Implante de pellets de estradiol
   Nota: Tenga cuidado de que el animal está anestesiado durante la cirugía ooforectomía para pellets en ese momento.
   1. Inmediatamente después de la terminación del procedimiento ooforectomía, limpiar la piel con solución antiséptica que rodea el cuello y hacer una incisión transversal pequeña subcutáneo (0,5 cm) con unas tijeras afiladas en la nuca.
   2. Utilice las tijeras para disecar la piel del músculo, haciendo un bolsillo lo suficientemente grande como para permitir la colocación de los balines.
   3. Inserte el pellet que contiene 18 mg de 17β-E₂ y suturar la piel con una sutura no absorbible 6-0. Limpie la superficie nuevamente con solución antiséptica.
   4. Coloque el animal en la zona de recuperación y administrar una dosis óptima de analgesia de larga duración para facilitar el período de recuperación.
3. Cirugía de implantes endometriales
   Nota: Permitir al menos un período de cuarentena de siete días para permitir la recuperación completa de los animales después de ooforectomía antes de la cirugía de implantación de fragmento endometrial. Para la sincronización óptima con el etiquetado de los tejidos, recoge la biopsia 2 – 3 días antes de la cirugía de implantación para evitar cultura a largo plazo de los explantes.
   1. Prepare la habitación quirúrgica en la zona de libre de patógenos específicos de antemano. Preparación de la campana con todo el material quirúrgico necesario, el equipo de anestesia y la recuperación post quirúrgica también.
   2. Llevar los animales a la sala, realizar una inyección subcutánea de un derivado de la morfina a dosis de 5 (mg/kg) en cada ratón. Que los ratones reposar 30 min después de la inyección por lo que pueden manifestarse efectos analgésicos del fármaco.
   3. Conecte la inhalación anestesia equipos y dejar oxígeno e isoflurano (2% mg/kg) el flujo durante unos minutos en una cámara sellada de la anestesia.
   4. Antes de comenzar la cirugía, mueva la placa de fluorescencia con fragmentos (de paso 2.10) en la campana, lo unseal y vierta los fragmentos en una placa de Petri para facilitar su manejo.
   5. Introducir el animal en la cámara de anestesia isoflurano. Espere 3-5 min y comprobar que los animales son anestesiados completamente pulsando una de sus patas. Transferir el animal a la zona de la cirugía y mantener la anestesia mediante la colocación de una mascarilla de flujo continuo de gas isoflurano cubriendo las vías aéreas respiratorias.
   6. Lugar el animal anestesiado boca arriba. Desinfectar la zona ventral. Realizar una incisión longitudinal de 1,5 cm en abdomen con unas tijeras afiladas y separar la piel del músculo. A continuación, realizar una incisión longitudinal de 1,5 cm en el músculo a la cavidad peritoneal.
   7. Sujete el borde izquierdo de la pared muscular del abdomen con mini pinzas y tratando de exponer la cara interior del peritoneo en la parte exterior del doblez.
   8. Tomar un implante endometrial con mini pinzas, sumergirlo brevemente en un adhesivo de cianoacrilato de n-butilo-éster y colocar al peritoneo donde conseguir unirá. Déjelo secar por unos segundos. Repita los pasos 3.3.6 y 3.3.7 para colocar un implante en el lado contralateral del peritoneo.
   9. Cierre la capa muscular con una sutura absorbible 6-0 y luego cierre la piel con un no-absorbible sutura 6-0. Limpie la superficie nuevamente con solución antiséptica.
   10. Coloque el animal en la zona de recuperación y administrar una dosis óptima de analgesia de larga duración.

4. en Vivo la proyección de imagen fluorescente con un Vivo en sistema de imagen

1. Encienda el dispositivo de imágenes en vivo, inicializar el programa y permita la cámara CCD se enfríe durante unos minutos.
2. Preparar el equipo de anestesia de inhalación. Abrir el flujo de isoflurano al 2% durante un par de minutos para llenar la cámara anestésica. Preparar la zona de recuperación post anestésica.
3. Una vez comenzado el programa y la cámara CCD se hayan enfriado, haga clic en la herramienta Asistente de imagen : un tutorial comienza con una serie de ventanas consecutivas muestran, cada uno correspondiente a un parámetro de interés con varias opciones a elegir haciendo clic en la casilla correspondiente. Avanzar por el tutorial, seleccionando las casillas correspondientes en cada ventana y haga clic en el botón OK para pasar a la siguiente serie de parámetros con la siguiente secuencia.
   1. Seleccione la casilla de epiluminiscencia para el parámetro de fluorescencia, seleccione la caja mCherry para el parámetro de filtro pares. Marque la casilla modo de fotografía y el Enfoque de confirmar y seleccione la caja automática para el parámetro de exposición.
4. Una vez que el instrumento ha sido establecido, mover un animal dentro de la cámara de anestesia. Cuando completamente anestesiados, transferir el animal dentro del en vivo jaula del sistema de la proyección de imagen y colocar de lado para arriba con su cabeza dentro de un túbulo conectado a la máquina de anestesia. Cierre la tapa y haga clic en adquirir para el control.
5. Adquirir las imágenes que aparecen (un total de cinco imágenes, una imagen para cada par de filtros seleccionados) y guardar los datos haciendo clic en el botón Guardar como . Mueva el ratón al área de recuperación post anestésica. Repita el proceso con el resto de los animales.
6. Repetir control a dos o tres veces por semana durante el seguimiento la señal adecuada durante el curso del tiempo.
7. Proceder al sacrificio del animal al final del curso del tiempo por asfixia de CO₂ .

5. cuantificación de imágenes de fluorescencia In Vivo

1. Segregación de fluorescencia real a través de imágenes unmixing:
   1. Abra el In Vivo análisis de imagen había acoplado programa de Software.
   2. Seleccionar el archivo "Sequenceinfo" para iniciar el análisis. Aparecerán dos ventanas: "Vista de la secuencia" y "Paleta". Elegir la Paleta de herramientas y una vez que ha sido muestra el menú, seleccione las siguientes opciones.
   3. Seleccione corrección y haga clic en la casilla Adaptive FL fondo resta quitar las señales fluorescentes indeseables de los datos de imagen luminiscente. Elegir el umbral de mayor interés y haga clic en establecer.
   4. Haga clic en espectral Unmixing, seleccionar las longitudes de onda de interés, el método elegido para idear (biblioteca, visitas guiada, automático o manual) y haga clic en iniciar Unmix.
   5. Seleccione la imagen de Unmixed correspondiente a mCherry señal y haga doble clic. Aparecerá una nueva ventana con la imagen final de la señal de interés.
   6. Repetir el punto 5.1.3.
   7. OPCIONAL: Si se necesita una imagen representativa (JPEG) del unmix resultado, seleccione los ajustes deseados en paleta de herramientas | Ajuste de la imagen (color tabla binning, contraste, etcetera) y luego haga clic en Exportar gráficos en la ventana de unmix para exportar la vista actual de la imagen como una imagen.
   8. Guarde el archivo sin mezclar: archivo | Guardar como | Seleccione la carpeta y Ok.
   9. Repita el proceso con el resto de los días de vigilancia y con todos los animales.
2. ROIs configurar y cuantificación de la señal
   1. Haga clic en examinar y seleccione el archivo sin mezclar (ver paso 5.1.8) de interés para ser analizada. Aparecerá una nueva ventana.
   2. Haga clic en Agregar a la lista para incluir todos los archivos sueltos de cada animal en diferentes puntos temporales y luego haga clic en Carga como un grupo. Todas las imágenes deben aparecer como una sola secuencia.
   3. Ir a la ventana de la Paleta de herramientas : haga clic en desactivar la casilla de escalaindividual para obtener todas las imágenes en la misma escala.
   4. Haga doble clic en una imagen de la secuencia y crear un retorno de la inversión en la zona de interés utilizando la siguiente secuencia. Vaya a Herramientas de ROI y selecciona contorno y 1 Auto , haga clic en la forma de círculo que aparece, colocar en el centro de la señal fluorescente y a continuación, haga clic en crear en la ventana mostrada.
      Nota: Automáticamente destaca píxeles con una intensidad de fluorescencia sobre los valores de fondo (es decir, la lesión) y genera una forma cuya área abarca los píxeles del contorno.
   5. La forma creada de ROI de copiar y pegar en una zona del fondo donde no hay señal.
   6. Haga clic en medida ROIs | Seleccionar todo para mostrar los valores de intensidad de fluorescencia. Proceder a seleccionar los valores de datos con el ratón, haz clic en el botón derecho, pulse copiar y pegar en una hoja de cálculo.

6. los datos (señal fluorescente) normalización

1. Seleccione el momento inicial en que señal de intensidad es máxima. Proceder a normalizar la señal en cada momento mediante la fórmula:
   Señal de intensidad en cada punto del tiempo / intensidad de la señal máximo observado durante el curso del tiempo) x 100.

Resultados

Aquí, describimos el proceso para la creación de un modelo heterólogo de la endometriosis en la cual se conserva la arquitectura de las lesiones implantando fluorescencia etiquetadas pedazos de endometrio humano en ratones inmunocomprometidos, permitiendo de este modo no invasivo seguimiento de la progresión de la lesión. Etiquetado fragmentos endometriales se logra por la infección con adenovirus dirigido a expreso mCherry, una proteína que emite fluorescencia en la región infrar...

Discusión

El protocolo detallado en el presente documento describe la aplicación de un modelo animal de endometriosis en la cual la arquitectura de implantación de arquitectura de lesiones se conserva mientras que simultaneamente permite evaluación en tiempo real de la fluorescencia emitida por mCherry etiquetado el tejido endometrial. En este protocolo, describimos el uso de un sistema específico de proyección de imagen en vivo y programas relacionados con evaluación no invasiva fluorescencia emitida por la lesión marcada....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	---	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g	B-BRAUN	---	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	---	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	---	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	---	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator