Surveillance non invasive de la taille de la lésion dans un modèle murin hétérologues d’endométriose

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour vivre-imagerie des fragments de l’endomètre humains fluorescent étiquetés greffés chez des souris. La méthode permet d’étudier les effets des médicaments de choix sur la taille de la lésion endometriotic grâce à la surveillance et la quantification de la fluorescence émise par le journaliste fluorescent en temps réel

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la mise en œuvre d’un modèle de souris hétérologues dans lequel la progression de l’endométriose peut être évaluée en temps réel grâce à une surveillance non invasive de la fluorescence émise par le tissu endométrial humain ectopique implanté. À cette fin, biopsie de l’endomètre humain proviennent de don d’ovocytes en cours de donateurs femmes. Des fragments de l’endomètre humains sont cultivées en présence de l’adénovirus machinés pour cDNA express pour le mCherry de protéine fluorescente de journaliste. Après visualisation, étiqueté tissus avec un taux optimal de fluorescence après infection sont par la suite choisi pour l’implantation chez les bénéficiaires. Une semaine avant la chirurgie d’implantation, souris bénéficiaires sont chez et pastilles d’estradiol sont placés par voie sous-cutanée pour soutenir la survie et la croissance des lésions. Le jour de la chirurgie souris sont cavité péritonéale et anesthésiée, accédée via une incision de petite taille (1,5 cm) de la linea alba-. Les implants fluorescent étiquetés sont épilés, brièvement trempés dans la colle et attachées à la couche péritonéale. Incisions sont suturées et animaux à gauche pour récupérer pendant quelques jours. Fluorescence émise par les implants endometriotic est habituellement non invasive surveillé tous les 3 jours pendant 4 semaines avec un système d’imagerie in vivo. Variations de la taille des implants endometriotic peuvent être estimées en temps réel par quantification du signal mCherry et normalisation contre le temps-point initial indiquant l’intensité de la fluorescence maximale.

Les rongeurs précliniques traditionnelles des modèles de l’endométriose ne permettent pas la surveillance non invasive de la lésion en temps réel mais plutôt permettent une évaluation des effets des médicaments testés à la fin. Ce protocole permet de suivre en temps réel des lésions et est plus utile d’explorer le potentiel thérapeutique des médicaments dans les modèles précliniques de l’endométriose. La principale limitation du modèle ainsi produite est que surveillance non invasive n’est pas possible sur de longues périodes de temps en raison de l’expression épisomiques d’Ad-virus.

Introduction

L’endométriose est une affection gynécologique chronique initiée par l’implantation de l’endomètre fonctionnel en dehors de la cavité utérine. Les lésions ectopiques croissent et induisent des processus inflammatoires, conduisant à la chronique pelvienne douleur et l’infertilité¹. On estime que vers le haut à 10 – 15 % des femmes en âge de procréer sont influencés par endometriosis2, et elle est présente dans environ 40 – 50 % des femmes infertiles³. Les traitements pharmacologiques actuels pour l’endométriose sont incapables d’éradiquer complètement les lésions et pas sans effets secondaires^4,5. La recherche des thérapies plus efficaces requiert du raffinement des modèles animaux existants de l’endométriose, de telle sorte que les lésions humaines peuvent être imitées de manière appropriée, et évaluer attentivement les effets des composés sur la taille de la lésion entre autres.

Modèles de primates ont été utilisés pour imiter l’endométriose par implantation ectopiques lésions histologiquement identiques et sur des sites similaires comme les humains^6,7,8; Toutefois, les préoccupations éthiques et le coût économique élevé liée à l’expérimentation avec les primates limite leur utilisation⁹. En conséquence, l’utilisation de petits animaux, surtout des rongeurs, pour la mise en œuvre de modèles in vivo de l’endométriose continue à être favorisée car elle permet des études avec un plus grand nombre de personnes^10,11. L’endométriose peut être induite chez ces animaux en transplantant des morceaux de rongeurs cornes utérines (modèles « homologues »)^12,13 ou tissu endométrial/endometriotic humain aux sites ectopiques (modèles hétérologues)¹⁴ . Contrairement aux humains, les rongeurs ne perdent pas leur tissu endométrial et ainsi l’endométriose ne peut pas être développé spontanément chez ces espèces. Par conséquent, homologue souris modèles de l’endométriose ont été critiquées en raison du fait qu’implanté des tissus utérins souris ectopique ne reflète pas les caractéristiques des lésions endometriotic humaines¹⁵.

Physiologie appropriée de l’endométriose peut être imitée dans les modèles hétérologues d’endométriose où des fragments de l’endomètre humains frais sont implantés chez des animaux immunodéficients. Les modèles conventionnels hétérologues, les effets thérapeutiques des composés d’intérêt sont généralement évalués à la fin par l’évaluation de la taille de la lésion à l’aide d’étriers¹⁶. Une limitation évidente est que, par conséquent, les modèles animaux de point de terminaison ne permettent pas étudier la dynamique de l’implantation ou le développement des lésions endometriotic au fil du temps. Une autre limite est que l’utilisation des étriers ne permet pas de mesures précises de la taille de la lésion. En effet, l’écart-type fourni par étriers est dans la même gamme (c.-à-d. millimètres) que la taille des lésions implantés chez des souris, limitant ainsi la capacité de ces outils pour détecter les variations réelles dans la taille.

Afin de surmonter ces limitations, dans les présentes, nous décrivons la génération d’un modèle de souris hétérologues d’endométriose dans lequel les tissus humains implantés sont conçu pour exprimer une protéine fluorescente de journaliste m-Cherry. Détection du signal fluorescent avec un système d’image appropriée permet une surveillance non invasive de l’état de la lésion avec quantification simultanée de sa taille en temps réel. Ainsi, notre modèle prévoit des avantages évidents par rapport aux modèles de point de terminaison conventionnelle car elle apporte la possibilité de surveillance non invasive en temps réel et la possibilité d’effectuer les plus objectives et une estimation précise des variations dans la taille de la lésion.

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Protocole

L’utilisation d’échantillons de tissus humains a été approuvée par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de l’Hospital Universitario La Fe. Consentement éclairé a fourni tous les patients. L’étude impliquant des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection Animal au Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, et toutes les procédures ont été réalisées suivant les directives pour le soin et l’utilisation des mammifères auprès des instituts nationaux de la santé.

1. pré-traitement et Collection de tissu endométrial

1. Obtenir une biopsie de bonne qualité d’aspiration l’endomètre humaine en utilisant une canule reliée à un appareil d’aspiration. Versez la biopsie dans un flacon contenant 10 mL de stérile saline et laver avec de l’agitation manuelle douce.
   Remarque : Procédures à suivre afin d’obtenir des biopsies de bonne qualité ont été décrites précédemment¹⁷.
2. Laver la biopsie de sang ou de mucus restant. Répétez l’opération en versant le tissu pour flacons contenant solution saline frais dents autant que nécessaire jusqu'à ce que le tissu est propre.
3. Fragments de biopsie de transfert avec une apparence saine dans une solution contenant 10 mL d’achever moyen (DMEM) moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco avec une solution antibiotique-antimycosiques sérum bovin fœtal (SVF) et 1 % à 10 %.
4. Verser le contenu dans une boîte de pétri de 10 cm et continuez à couper le tissu en 5 à 10 mm³ pièces avec une paire de bistouris.

2. adénovirale Transfection des Fragments de l’endomètre

Remarque : Tous les matériaux qui vont être utilisés dans le processus devraient être introduites dans la hotte à l’avance. Retirez tout ce qui ne va pas être utilisé dans le processus et placer un ballon avec l’eau de Javel. Tout le matériel qui entre en contact avec le vecteur adénoviral doit être désinfecté avec l’eau de Javel avant de jeter dans le conteneur de biohazard.

1. Une fois la biopsie a été coupée, prenez une nouvelle boîte de pétri. Pipetter plusieurs gouttes DMEM µL 30 – 50 de propagation dans tout le plat entier. Laisser un espace suffisant entre les gouttes alors qu’ils n’entrent pas en contact.
2. Avec l’aide d’une aiguille attachée à la seringue, placez un seul morceau de fragment à l’intérieur de chacune des baisses moyennes.
   Remarque : Chaque goutte doit contenir un seul élément de l’endomètre.
3. Préparer la solution d’Ad-mCherry en diluant 01:20 de la solution mère adénoviraux mCherry [1 x 10¹⁰ UFP/mL]) en DMEM moyen sans antibiotiques (DMEM + 10 % filtré FBS).
4. Pipeter 100 – 200 μL de la solution d’Ad-mCherry / puits sur une plaque à 96 puits, remplissage des puits autant que des fragments sont disponibles dans les boîte de pétri gouttes (étape 2.2). En outre, remplir au moins 3 puits avec un milieu DMEM sans adénovirus comme témoin négatif.
5. Avec l’aide d’une aiguille attachée à la seringue, chacun des fragments dans la boîte de pétri (étape 2.2) transfert à chaque puits contenant une solution ad-mCherry dans la plaque à 96 puits.
6. Placer la plaque de 96 puits contenant les fragments de l’endomètre avec une solution Ad-mCherry dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 16 h.
7. Laver à l’adénovirus restants dans le milieu en transférant des tissus dans une nouvelle plaque de 96 puits remplie de milieu DMEM complet (avec antibiotiques-Antimycotiques, libre d’adénovirus) et laisser incuber à 37 ° C avec 5 % CO₂ pendant 24 à 48 h.
   Remarque : N’oubliez pas de recouvrir d’eau de Javel tous les plats et des conseils qui sont venus en contact avec Ad-virus avant de le jeter dans le récipient de biohazard.
8. Retirez la plaque de l’incubateur et placez-le sous un microscope à fluorescence à 568 nm (canal rouge) pour tester l’étiquetage optimales.
9. Choisissez les fragments plus brillants et les placer dans une nouvelle plaque de 96 puits avec un milieu DMEM complet frais (avec antibiotiques-Antimycotiques, libre d’adénovirus).
10. Sceller la plaque avec un film plastique paraffine et à voyager dans la zone spécifique-exempts de micro-organismes pathogènes animale pour implantation de fragments de l’endomètre dans les receveuses.

3. génération du modèle souris endométriose

Remarque : Utilisez 6 à 8 semaines-vieux nude athymiques (ou des souches similaires immunodéprimés) des souris femelles logées dans des conditions particulières – exempts de pathogènes, comme les animaux receveurs. Pour éviter les variations hormonales de cycle-dépendante et en même temps alimenter la croissance lésion avec l’estradiol, les animaux sont ovariectomisées et placé avec le communiqué de 60 jours en gélule 18 mg de 17 βeta-Estradiol (17β-E₂). Ovariectomie et pellet de placement doivent être effectuées au moins une semaine avant la greffe de fragments de l’endomètre dans les receveuses.

1. Ovariectomie
   Remarque : Préparer le matériel stérilisé chirurgical sous une hotte. Préparer le matériel d’anesthésie et une zone de récupération post-chirurgicale prête dans la même pièce.
   1. Effectuer une injection sous-cutanée de dérivé de morphine à la dose de 5 mg/kg / souris. Laissez les souris reposer pendant 30 min après l’injection donc comme analgésiques des effets du médicament peuvent se manifester.
   2. Connectez l’inhalation anesthésie matériel et laissez oxygène et isoflurane (2 % mg/kg) de flux pendant quelques minutes dans une chambre scellée de l’anesthésie.
   3. Introduire l’animal dans la chambre d’anesthésie isoflurane. Attendre 3 à 5 min et vérifier que les animaux est complètement anesthésiés en appuyant sur une de ses pattes. Transférer l’animal dans le domaine de la chirurgie et maintenir l’anesthésie en plaçant un masque avec un flux continu de gaz isoflurane couvrant les voies respiratoires.
   4. Après la désinfection de la zone avec la chlorhexidine, effectuer une incision costale transversal 0,5 cm environ à la hauteur de la hanche avec des ciseaux pointus.
   5. Séparer le muscle pour accéder à la cavité abdominale, d’identifier les coussinets adipeux blanc qui entoure l’ovaire et de rétracter l’ovaire avec une pince de dissection de la peau.
   6. Faire un noeud autour de l’oviducte avec suture résorbable et serrez-la pour assurer l’hémostase appropriée avant l’excision de l’ovaire.
   7. Fermez la couche musculaire avec suture résorbable 6-0 et puis fermez la peau avec une suture non résorbable 6-0. Nettoyer la zone avec une solution antiseptique.
   8. Répétez la procédure pour enlever l’ovaire latérale contra.
2. Estradiol-pellet implant
   Remarque : Veiller à ce que l’animal est anesthésié pendant la chirurgie de l’ovariectomie pour placer les boulettes à ce moment-là.
   1. Immédiatement après l’achèvement de la procédure de l’ovariectomie, nettoyer la peau avec une solution antiseptique qui entoure le cou et faire une incision transversale petit sous-cutanée (0,5 cm) avec des ciseaux pointus dans la nuque.
   2. Utilisez des ciseaux à disséquer la peau du muscle, faire une poche assez grande pour permettre de placer les boulettes.
   3. Insérez le culot contenant 18 mg de 17β-E₂ et suture de la peau avec une suture non résorbable 6-0. Nettoyer la zone avec une solution antiseptique.
   4. Placer l’animal dans la zone de récupération et d’administrer une dose optimale de longue durée analgésie pour faciliter la période de récupération.
3. Chirurgie d’implantation de l’endomètre
   Remarque : Laisser au moins une période de quarantaine de sept jours pour permettre une récupération complète des animaux après l’ovariectomie avant de commencer l’implantation chirurgicale de fragments de l’endomètre. Pour une synchronisation optimale avec étiquetage des tissus, recueillir la biopsie 2 – 3 jours avant la chirurgie d’implantation afin d’éviter à long terme culture des explants.
   1. La salle chirurgicale dans la zone franche de pathogènes spécifiques se préparent à l’avance. Préparation de la hotte avec tout le matériel chirurgical nécessaire, le matériel d’anesthésie et de la zone de récupération après une chirurgie aussi.
   2. Amener les animaux à la chambre, effectuer une injection sous-cutanée d’un dérivé de la morphine à la dose de 5 mg/kg () dans chacune des souris. Laissez les souris reposer pendant 30 min après l’injection donc les effets analgésiques de drogue peuvent se manifester.
   3. Connectez l’inhalation anesthésie matériel et laissez oxygène et isoflurane (2 % mg/kg) de flux pendant quelques minutes dans une chambre scellée de l’anesthésie.
   4. Avant de commencer la chirurgie, déplacer la plaque contenant fluorescent étiqueté fragments (de l’étape 2.10) dans la hotte, il desceller et versez les fragments dans une boîte de pétri pour une manipulation plus facile.
   5. Introduire l’animal dans la chambre d’anesthésie isoflurane. Attendre 3 à 5 min et vérifier que les animaux est complètement anesthésiés en appuyant sur une de ses pattes. Transférer l’animal dans le domaine de la chirurgie et maintenir l’anesthésie en plaçant un masque avec un flux continu de gaz isoflurane couvrant les voies respiratoires.
   6. Place l’animal anesthésié face vers le haut. Désinfecter la zone ventrale. Effectuer une incision longitudinale 1,5 cm au ventre avec des ciseaux pointus et séparer la peau du muscle. Ensuite, effectuer une incision longitudinale de 1,5 cm dans le muscle pour accéder à la cavité péritonéale.
   7. Maintenez le bord gauche de la paroi musculaire de l’abdomen avec une mini pince et pliez-la tente d’exposer la face interne du péritoine à l’extérieur.
   8. Prenez un implant de l’endomètre avec mini pinces à épiler, tremper brièvement dans un adhésif cyanoacrylate n-butyl-ester et placez-le au péritoine où il sera attaché. Laisser sécher pendant quelques secondes. Répétez les étapes 3.3.6 et 3.3.7 pour placer un implant du côté controlatéral du péritoine.
   9. Fermez la couche musculaire avec une suture résorbable 6-0 et puis fermez la peau avec un non-résorbable suture 6-0. Nettoyer la zone avec une solution antiseptique.
   10. Placer l’animal dans la zone de récupération et d’administrer une dose optimale de longue durée analgésie.

4. imagerie in Vivo Fluorescent avec un In Vivo, système d’imagerie

1. Allumez l’appareil de système d’imagerie in vivo, initialiser le programme et permettent à la caméra CCD se refroidir pendant quelques minutes.
2. Préparer le matériel d’anesthésie par inhalation. Ouvrez le flux de l’isoflurane à 2 % pendant quelques minutes pour remplir la chambre anesthésique. Préparer la zone de récupération après l’anesthésie.
3. Une fois que le programme a démarré et la caméra CCD ont refroidi, cliquez sur l’outil Assistant Imaging : un tutoriel commence par une série de fenêtres consécutives affichée, chacun correspondant à un paramètre d’intérêt avec plusieurs options disponibles à choisir en cliquant sur la case correspondante. Aller de l’avant par le tutoriel en sélectionnant les cases appropriées dans chaque fenêtre et cliquez sur le bouton OK pour passer à la prochaine série de paramètres avec la séquence suivante.
   1. Activez la case à Épiluminescence pour le paramètre de fluorescence, activez la case à mCherry pour le paramètre de paires filtre. Cochez les cases de la photographie de mode et de Confirmer la mise au point et sélectionnez la case automatique pour le paramètre d’exposition.
4. Une fois que l’instrument a été mis en place, déplacer un animal à l’intérieur de la chambre de l’anesthésie. Lorsque complètement anesthésiés, transférer l’animal à l’intérieur de l' in vivo cage de système d’imagerie et placez-le à l’endroit qui a la tête à l’intérieur d’un tube relié à la machine d’anesthésie. Fermer le couvercle et cliquez sur acquérir pour la surveillance.
5. Acquérir les images qui apparaissent (un total de cinq images, une image pour chaque paire de filtres sélectionnés) et enregistrer des données en cliquant sur le bouton Enregistrer sous . Déplacez la souris vers la zone de récupération après anesthésie. Répétez le processus avec les animaux restants.
6. Répétez suivi deux ou trois fois par semaine à suivi le signal approprié au cours du temps.
7. Passez à sacrifier l’animal à la fin de l’évolution temporelle de CO₂ asphyxie.

5. quantification des In Vivo les Images de la Fluorescence

1. Ségrégation de fluorescence réel par le biais de déconvolution d’images :
   1. Ouvrez le In Vivo analyse d’imagerie couplé logiciel.
   2. Choisissez le fichier « Sequenceinfo » pour lancer l’analyse. Deux fenêtres seront affichera : « Séquence vue » et « Palette d’outils ». Choisissez la Palette d’outils et une fois que le menu a été affiché, sélectionnez les options suivantes.
   3. Sélectionnez les Corrections et cliquez sur la case Adaptive FL fond soustraction pour supprimer les signaux fluorescents indésirables des données image luminescent. Choisir le seuil du plus grand intérêt, puis cliquez sur définir.
   4. Cliquez sur Spectral Unmixing, sélectionner les longueurs d’onde d’intérêt, la méthode choisie pour la déconvolution (bibliothèque, guidée, automatique ou manuelle) et puis cliquez sur Démarrer Unmix.
   5. Sélectionnez l’image Unmixed correspondant au signal mCherry et double cliquez. Une nouvelle fenêtre apparaîtra avec l’image finale du signal d’intérêt.
   6. Répétez l’étape 5.1.3.
   7. FACULTATIF : Si une image représentative (JPEG) du résultat unmix est nécessaire, choisissez les paramètres souhaités dans la Palette d’outils de | Ajustez l’image (color table, binning, contraste, etc..), puis cliquez sur Exporter des graphiques dans la fenêtre d’unmix pour exporter la vue active d’image sous forme d’image.
   8. Enregistrez le fichier non mélangé : fichier | Enregistrer sous | Choisissez le dossier et Ok.
   9. Répétez l’opération avec le reste des jours surveillance et avec tous les animaux.
2. ROIs, mis en place et quantification du signal
   1. Cliquez sur parcourir et sélectionnez le fichier non mélangé (voir étape 5.1.8) intéressant à analyser. Une nouvelle fenêtre apparaîtra.
   2. Cliquez sur Ajouter à la liste pour inclure tous les fichiers non mélangés de chaque animal à des moments différents, puis cliquez sur Groupe de chargement comme A. Toutes les images doivent apparaître comme une seule séquence.
   3. Allez dans la fenêtre de la Palette d’outils : cliquez sur la case j’aiindividuel à obtenir toutes les images sur la même échelle.
   4. Double-cliquez sur une image de la séquence et créer un retour sur investissement sur la zone d’intérêt en utilisant la séquence suivante. Aller aux Outils de retour sur investissement et sélectionnez contour et option Auto 1 , cliquez sur le cercle apparaissant, placez-le sur le centre le signal fluorescent et puis cliquez sur Create sur la fenêtre qui s’ouvre.
      Remarque : Cela met en lumière des pixels avec une intensité de fluorescence au-dessus des valeurs de fond (par exemple, lésion) automatiquement et génère une forme dont le secteur englobe les pixels indiqués.
   5. La forme ROI créée le Copy et collent sur une zone de fond où il n’y a aucun signal.
   6. Cliquez sur mesure ROIs | Select All pour afficher les valeurs d’intensité de fluorescence. Continuez à sélectionner des valeurs de données avec la souris, cliquez sur le bouton de droite, appuyez sur copier et coller sur une feuille de calcul.

6. données (signal fluorescent) normalisation

1. Sélectionnez le point de temps initial à quel signal intensité est maximale. Passez à normaliser le signal à chaque point dans le temps en utilisant la formule :
   Signal d’intensité en chaque point du temps / intensité du signal Maximal observé au cours du temps) x 100.

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Résultats

Nous décrivons ici le processus de création d’un modèle hétérologue d’endométriose dans lequel l’architecture des lésions est préservée par l’implantation de fluorescent étiquetés morceaux d’endomètre humain dans des souris immunodéficientes, permettant ainsi non invasif suivi de la progression de la lésion. Étiquetage des fragments de l’endomètre est réalisée par l’infection à adénovirus machinés pour express mCherry, une protéine à l’émission de f...

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Discussion

Le protocole détaillé ci-après décrit la mise en œuvre d’un modèle animal de l’endométriose, dont l’architecture d’implantation architecture des lésions est préservée tout en permettant simultanément en temps réel de la fluorescence émise par mCherry marqués de tissu endométrial. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un appareil d’imagerie in vivo spécifique et des logiciels d’évaluation non invasive fluorescence émise par la lésion étiquetée. Chaque utilisateur doit adap...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	---	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g	B-BRAUN	---	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	---	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	---	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	---	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator