ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור live-הדמיה של fluorescently שכותרתו קטעי רירית הרחם האנושי הושתל בעכברים. השיטה מאפשרת ללמוד את השפעות הסמים על גודל הנגע endometriotic באמצעות ניטור, כימות של זריחה הנפלטים על ידי הכתבת פלורסנט בזמן אמת

Abstract

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליישום מודל העכבר heterologous שבו ההתקדמות של אנדומטריוזיס יכול להיות מוערך בזמן אמת באמצעות ניטור לא פולשנית של זריחה הנפלטת מושתל חוץ רחמי רקמה רירית הרחם אנושית. למטרה זו, ביופסיות של רירית הרחם האנושי מתקבלים מתרומה oocyte מתמשך של התורם נשים. קטעי רירית הרחם אדם מתורבתים בנוכחות adenoviruses מתוכנן cDNA אקספרס עבור mCherry חלבון פלואורסצנטי הכתב. על ויזואליזציה, תוויות רקמות עם שיעור אופטימלית של קרינה פלואורסצנטית לאחר זיהום נבחרו לאחר מכן עבור ההשתלה בעכברים הנמען. שבוע לפני ניתוח ההשתלה, עכברים הנמענים הם oophorectomized, כדורי אסטרדיול ממוקמים subcutaneously לקיים את הישרדות וצמיחה של נגעים. ביום של הניתוח עכברים הם מרדימים, ואת הצפק חלל לגשת דרך חתך קטן (כ- 1.5 ס מ) על ידי לינאה-אלבה. שתלים fluorescently שכותרתו tweezed, בקצרה טבולים בדבק, מחוברת לשכבה הצפק. חתכים ומאחים והשאירו חיות להתאושש במשך כמה ימים. קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי שתלים endometriotic בדרך כלל לא פולשני מנוטר כל 3 ימים 4 שבועות עם מערכת הדמיה ויוו. וריאציות בגודל של endometriotic שתלים יכול להיות בזמן אמת לפי אומדן כימות של mCherry אות ו נורמליזציה נגד הראשונית הזמן נקודת-מציג עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקסימלי.

מכרסמים פרה המסורתי של מודלים של אנדומטריוזיס אינם מאפשרים פיקוח בלתי פולשני של הנגע בזמן אמת אבל מאפשר הערכת ההשפעות של תרופות לבדיקה על נקודת הקצה. פרוטוקול זה מאפשר לעקוב אחר נגעים בזמן אמת והוא שימושי יותר לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של תרופות במודלים פרה של אנדומטריוזיס. המגבלה העיקרית של המודל כך שנוצר הוא כי ניטור פולשני אינו אפשרי על פני תקופות זמן בשל ביטוי episomal של Ad-וירוס.

Introduction

אנדומטריוזיס היא מחלה כרונית גניקולוגיות שיזם ההשתלה של רירית הרחם פונקציונלי מחוץ חלל הרחם. חוץ רחמי נגעים גדלים, זירוז תהליכים דלקתיים שמוביל כרונית האגן כאב שרירים פוריות¹. ההערכה היא כי עד כדי 10 – 15% מהנשים בגיל הפריון הושפעו endometriosis2, זה קיים כ- 40%-50% של נשים עקרה³. טיפולים שוטפים תרופתי אנדומטריוזיס הינם מסוגל לחסל לחלוטין נגעים לא ללא תופעות לוואי^4,5. המחקר עבור טיפולים יעילים יותר מחייב של העידון של הדגמים בעלי חיים הקיים של אנדומטריוזיס באופן כזה כי יכול להיות חיקה כראוי האנושי נגעים, ההשפעות של תרכובות על גודל הנגע בין היתר יכול להידרש מקרוב.

פרימטים הדגמים השתמשו כדי לחקות אנדומטריוזיס מאת נגעים חוץ רחמי implanting זהה בהיסטולוגיה, באתרים דומים כמו בני אדם^6,7,8; עם זאת, חששות אתיים והעלויות כלכלית גבוהה קשורה ניסויים עם מגבלת פרימטים שלהם לשימוש⁹. כתוצאה מכך, השימוש של בעלי חיים קטנים, בעיקר מכרסמים, ליישום בבית-vivo מודלים של אנדומטריוזיס ימשיך להיות העדיף שכן היא מאפשרת לימודי עם מספר גדול של אנשים^10,11. אנדומטריוזיס יכול להיגרם בבעלי חיים אלה על ידי משתילים חתיכות של מכרסמים הרחם קרניים ("מודלים הומולוגיים")^12,13 או רקמה רירית הרחם/endometriotic אנושית לאתרים חוץ רחמי (מודלים heterologous)¹⁴ . בניגוד לבני אדם, מכרסמים אל תזילו רקמת רירית הרחם שלהם, ובכך אנדומטריוזיס לא ניתן לפתח באופן ספונטני במינים אלו. לכן, העכבר הומולוגי מודלים של אנדומטריוזיס ננזף בשל העובדה כי מושתל רקמת הרחם חוץ רחמי העכבר אינו משקף את מאפייני האנושי נגעים endometriotic¹⁵.

פיזיולוגיה המתאים של אנדומטריוזיס יכול חיקה במודלים heterologous של אנדומטריוזיס איפה טריים האנושי קטעי רירית הרחם מושתלים לתוך חיות immunodeficient. במודלים heterologous המקובלת, ההשפעות הטיפוליות של תרכובות עניין הם בדרך כלל לאומדן בנקודת הקצה ההערכה של גודל הנגע בעזרת מחוגה¹⁶. מגבלה ברור הוא, ככזה, הקצה של מודלים בעלי חיים אינם מאפשרים לימוד הדינמיקה ההשתלה או התפתחות הנגע endometriotic לאורך זמן. מגבלה נוספת היא כי השימוש מחוגה אינו מאפשר מדידות מדויקות של גודל הנגע. אכן, שגיאת התקן שסופק על-ידי מחוגה הוא בטווח זהה (קרי, מילימטרים) כגודל של נגעים שהושתלו בעכברים, לפיכך הגבלת הקיבולת של כלים אלה כדי לזהות וריאציות בפועל בגודלם.

כדי להתגבר על מגבלות כאלה, במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל heterologous העכבר של אנדומטריוזיס בו מושתל רקמה אנושית מתוכנן לבטא m-שרי כתב חלבון פלואורסצנטי. זיהוי של האות פלורסנט עם מערכת התמונה מאפשר בקרה בלתי פולשני של מצב הנגע באמצעות כימות בו זמנית הגודל שלה בזמן אמת. לפיכך, המודל שלנו מספק יתרונות משמעותיים בהשוואה למודלים קצה קונבנציונאלי כשהוא מחזיר את ההזדמנות של ניטור פולשני בזמן אמת ועל האפשרות לביצוע יותר אובייקטיבית, אומדן מדויק של וריאציות בגודל הנגע.

Protocol

השימוש של דגימות רקמה אנושית אושרה על ידי הועד המוסדי יו ר ועדת האתיקה של בית החולים Universitario La Fe. כל המטופלים מסופקים בכתב הסכמה מדעת. המחקר המערבות בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים ב ולנסיה סנטרו דה Investigacion פרינסיפה פליפה, כל ההליכים שבוצעו בעקבות הנחיות טיפול ושימוש יונקים מן המוסדות הלאומיים של בריאות.

1. רירית הרחם רקמות איסוף ועיבוד קדם

1. לקבל ביופסיה באיכות טובה של האדם וביופסיה רירית הרחם באמצעות של הצינורית מחוברת למכשיר suction. שופכים את הביופסיה לתוך בקבוקון המכיל 10 מ"ל של סטרילי מלוחים, תשטוף עם עצבנות ידני עדין.
   הערה: הליכים אודות אופן ההשגה של ביופסיות באיכות טובה כבר שתואר לעיל¹⁷.
2. לשטוף את הביופסיה של ריר או דם הנותרים. חזור על התהליך על ידי מזיגת רקמות בקבוקונים המכילים תמיסת מלח טריים רבים שיני כנדרש עד רקמות נצפית נקי.
3. העברת קטעים ביופסיה מראה בריא לתוך פתרון המכיל 10 מ"ל של השלם בינוני ששינה הנשר של Dulbecco בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic.
4. יוצקים את התוכן ב- 10 ס מ פטרי והמשך חותכים את הרקמה לחתיכות³ 5 – 10 מ מ עם זוג ואזמלי מנתחים.

2. adenoviral תרביות תאים של רירית הרחם קטעים

הערה: כל החומרים שהולכים להיות מועסק בתהליך צריך להכיר בשכונה בתיאום מראש. . להוציא הכל. זה לא הולך להיות בשימוש בתהליך ולמקם בקבוקון עם אקונומיקה. כל החומר בא במגע עם וקטור adenoviral חייבים להיות נקיים עם המלבין לפני השלכת אותו בתוך המיכל הביולוגי

1. לאחר הביופסיה קטועה, לוקחים צלחת פטרי חדש. Pipette טיפות DMEM µL 30 – 50 מרובים של התפשטות ברחבי המנה כולה. להשאיר מספיק מקום בין טיפות אז הם לא באים במגע.
2. סייעו עם מחט מזרק מצורף, מניחים חתיכה אחת של קטע בתוך כל אחד הטיפות בינוני.
   הערה: כל טיפה צריך להכיל חתיכה אחת של רירית הרחם.
3. הכן את הפתרון עובד Ad-mCherry על ידי דילול 20:1 mCherry adenoviral מניות הפתרון [pfu¹⁰ עונה 1 פרק 10/mL]) לתוך DMEM בינונית ללא אנטיביוטיקה (DMEM + 10% מסוננת FBS).
4. לוותר על 100-200 μL של הפתרון Ad-mCherry לכל טוב על צלחת 96-ובכן, מילוי בארות רבות כמו שברי זמינים הטיפות פטרי (שלב 2.2). בנוסף, למלא לפחות 3 בארות עם אדנו חינם DMEM בינוני כפקד שלילי.
5. סייעו עם מחט מזרק מצורף, להעביר כל אחד השברים בצלוחית הפטרי (שלב 2.2) לכל אחת מן הבארות המכיל ad-mCherry פתרון בצלחת 96-ובכן.
6. מקום 96 טוב-הצלחת המכיל את קטעי רירית הרחם עם Ad-mCherry פתרון לתוך בריחה ב 37 ° C עם 5% CO₂ 16 h.
7. תשטוף את adenoviruses הנותרים במדיום על ידי העברת רקמות לתוך צלחת 96-ובכן חדש מלא מלא DMEM בינוני (עם אנטיביוטיקה-antimycotics, חינם של אדנו) ואת תקופת דגירה של 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 24-48 שעות.
   הערה: זכור לכסות עם אקונומיקה כל טוב צלחות וטיפים שבאו במגע עם Ad-וירוס לפני השלכת לתוך המיכל הביולוגי.
8. להוציא לצלחת מן החממה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ זריחה-568 nm (ערוץ אדום) לבדיקת תיוג אופטימלית.
9. לבחור השברים הכי מבריק, למקם אותם לתוך צלחת 96-ובכן חדשים טריים בינונית DMEM מלאה (עם אנטיביוטיקה-antimycotics, חינם של אדנו).
10. לאטום את הצלחת היטב עם סרט פרפין פלסטיק ולהעביר אותה כדי לאזור ספציפי פתוגן-ללא בעלי חיים השרשת קטעי רירית הרחם חיות הנמען.

3. הדור של דגם העכבר אנדומטריוזיס

הערה: להשתמש בשבוע 6-8-עירום athymic הישן (או דומים זנים immunocompromised) עכברים הנשי שוכנו חינם – פתוגן תנאים מסוימים, כמו חיות הנמען. כדי להימנע הורמונלי תלויי-מחזור וריאציות וצמיחה בו-זמנית דלק הנגע עם אסטרדיול, בעלי החיים שחרור 60 יום ovariectomized, ולהניחו עם קפסולות המכילה 18 מ"ג של βeta 17-אסטרדיול (17β-E₂). Oophorectomy והשמת צניפה יש לבצע לפחות שבוע מראש הרכבה קטעי רירית הרחם לתוך החיות הנמען.

1. Oophorectomy
   הערה: להכין חומר סטיריליים כירורגי בשכונה. להכין ציוד ההרדמה אזור ההחלמה שלאחר הניתוח מוכן באותו חדר.
   1. לבצע זריקה תת עורית של מורפיום נגזר במינון של 5 מ"ג/ק"ג לכל העכבר. תן העכברים לנוח 30 דקות לאחר ההזרקה כך כמו משככי כאבים יכולה להיות מבוטאת ההשפעות של התרופה.
   2. לחבר את שאיפת הרדמה ציוד ולתת חמצן, איזופלוריין (2% מ"ג/ק"ג) זרימה למשך כמה דקות לתא אטום הרדמה.
   3. להציג את החיה אל החדר הרדמה איזופלוריין. לחכות 3-5 דקות ולבדוק חיות הן מורדם לחלוטין על ידי לחיצה על אחד את הטלפיים שלה. העברת החיה אל אזור הניתוח ולקיים הרדמה על ידי הצבת מסכה עם זרימה רציפה של גז איזופלוריין מכסה את דרכי הנשימה בדרכי הנשימה.
   4. לאחר חיטוי האזור עם chlorohexidine, לבצע רוחבי 0.5 ס מ costal חתך בערך בגובה של הירך עם מספריים חדות.
   5. להפריד את העור לשריר כדי לקבל גישה אל חלל הבטן, לזהות משטח שמן לבן המקיף את השחלה ומשכו את השחלה עם מלקחיים לנתיחה.
   6. לקשור סביב oviduct בתפר שנספג היטב כדי להבטיח hemostasis המתאים לפני excising השחלה.
   7. סגור את שכבת השרירים 6-0 בתפר שנספג ולאחר מכן סגור את העור עם תפרים נספגים 6-0. לנקות את האזור שוב עם פתרון חיטוי.
   8. חזור על הפעולות כדי להסיר את השחלה לרוחב קונטרה.
2. אסטרדיול הצניפה שתל
   הערה: תשמרי החיה. הוא מורדם במהלך הניתוח oophorectomy למקום כדורי בנקודה זו.
   1. מיד לאחר השלמת ההליך oophorectomy, לנקות את העור עם פתרון חיטוי סביב הצוואר, עושים חתך קטן תת עורי רוחבי (0.5 ס מ) עם מספריים חדות על העורף.
   2. השתמש את המספריים לנתח את העור מן השריר, ביצוע כיס גדול מספיק כדי לאפשר הצבת כדורי.
   3. הוסף את גלולה המכילה 18 מ"ג של 17β-E₂ , תפר את העור בתפר נספגים 6-0. לנקות את האזור שוב עם פתרון חיטוי.
   4. מקם את החיה באזור השחזור ולפקח מנה אופטימלי של שיכוך כאבים לטווח ארוך כדי להקל על תקופת ההחלמה.
3. ניתוח שתל רירית הרחם
   הערה: אפשר לפחות תקופה של בידוד שבעה ימים כדי לאפשר החלמה מלאה של בעלי חיים לאחר oophorectomy לפני שמתחילים ניתוח ההשתלה פרגמנט רירית הרחם. עבור סינכרון אופטימלית עם תיוג של רקמות, לאסוף את הביופסיה 2 – 3 ימים לפני ניתוח ההשתלה כדי למנוע התרבות ארוכת טווח של explants.
   1. . תכין את החדר כירורגי באזור החופשי פתוגן מסוים מראש להכין גם את מכסה המנוע עם כל נדרש ניתוח חומר, ציוד הרדמה לאזור ההחלמה שלאחר הניתוח.
   2. להביא את החיות לחדר, לבצע זריקה תת עורית של נגזרת מורפיום במינון של 5 (מ"ג/ק"ג) כל עכבר. תן העכברים לנוח 30 דקות לאחר ההזרקה כך יכולה להיות מבוטאת משככי כאבים ההשפעות של התרופה.
   3. לחבר את שאיפת הרדמה ציוד ולתת חמצן, איזופלוריין (2% מ"ג/ק"ג) זרימה למשך כמה דקות לתא אטום הרדמה.
   4. לפני תחילת הניתוח, להעביר לצלחת המכילה fluorescently שכותרתו קטעים (מתוך שלב 2.10) לתוך המנוע, לפתוח אותו ואת שופכים את השברים לתוך צלחת פטרי עבור טיפול קל יותר.
   5. להציג את החיה אל החדר הרדמה איזופלוריין. לחכות 3-5 דקות ולבדוק חיות הן מורדם לחלוטין על ידי לחיצה על אחד את הטלפיים שלה. העברת החיה אל אזור הניתוח ולקיים הרדמה על ידי הצבת מסכה עם זרימה רציפה של גז איזופלוריין מכסה את דרכי הנשימה בדרכי הנשימה.
   6. המקום החיה anesthetized פונות למעלה. לחטא את האזור הגחון. לבצע חתך אורכי 1.5 ס מ באזור הבטן עם מספריים חדות, להפריד את העור לשריר. לאחר מכן, לבצע חתך אורכי 1.5 ס מ בשריר לגשת חלל הצפק.
   7. להחזיק את הקצה השמאלי של הקיר שרירי הבטן עם מלקחיים מיני ומקפלים אותו מנסה לחשוף את הפן הפנימי של צפק מבחוץ.
   8. לקחת שתל רירית הרחם עם פינצטה מיני, לספוג אותו בקצרה דבק n-בוטיל-אסתר cyanoacrylate ולמקם אותו כדי הצפק איפה זה להיקשר. . תן לו להתייבש במשך כמה שניות. חזור על שלבים 3.3.6 ו 3.3.7 כדי למקם את השתל בצד contralateral של הצפק.
   9. לסגור את שכבת השרירים בתפר שנספג 6-0 ולאחר מכן סגור העור עם נספגים 6-0 בתפר. לנקות את האזור שוב עם פתרון חיטוי.
   10. מקם את החיה באזור השחזור ולפקח מנה אופטימלי של שיכוך כאבים לטווח ארוך.

4. בתחום ההדמיה פלורסנט Vivo עם Vivo בתוך מערכת הדמיה

1. הפעל את ההתקן מערכת הדמיה ויוו, לאתחל את התוכנית ולאפשר את מצלמת CCD להתקרר למשך כמה דקות.
2. הכינו את מכשירי אינהלציה הרדמה. פתח את זרימת איזופלוריין ב-2% לכמה דקות כדי למלא תא הרדמה. הכינו את אזור התאוששות שלאחר ההרדמה.
3. לאחר התוכנית החלה מצלמת CCD קיררה., לחץ על הכלי אשף הדמיה : ערכת לימוד מתחיל עם סדרה של רצופים של windows מוצג, כל אחד המתאים פרמטר עניין עם כמה אפשרויות זמינות להיבחר. על ידי לחיצה בתיבה המתאימה. מעבר קדימה דרך ההדרכה על-ידי בחירה בתיבות המתאימות בכל חלון ולחץ על לחצן אישור כדי לעבור מערך פרמטרים עם הרצף הבא הבא.
   1. בחר את תיבת Epiluminescence עבור הפרמטר פלורסצנטיות, בחר את תיבת mCherry עבור הפרמטר זוגות ' מסנן '. סמן את התיבות צילום מצב , המוקד לאשר ובחר את תיבת אוטומטית עבור הפרמטר חשיפה.
4. ברגע המכשיר הוגדרה, לעבור חיה אחת בתוך החדר הרדמה. כשהוא מורדם לחלוטין, להעביר את. החיה בפנים ויוו הדמיה מערכת כלוב והנח אותו בצד את ראשו בתוך צנורית מחובר מכונת ההרדמה. סגור את המכסה ולחץ על ' רכוש ' עבור ניטור.
5. לרכוש את כל תמונות (סך של חמש תמונות, תמונה אחת עבור כל זוג של מסננים שנבחרו), לשמור את הנתונים על-ידי לחיצה על הלחצן ' שמור בשם '. להזיז את העכבר אל האזור של התאוששות שלאחר ההרדמה. חזור על התהליך עם החיות הנותרים.
6. חזור על ניטור שתיים או שלוש פעמים בשבוע מעקב האות כראוי במהלך הזמן.
7. המשך להקריב את החיה בסוף מסלול הזמן בעזרת₂ CO.

5. כימות In Vivo פלורסצנטיות תמונות

1. סגרגציה של זריחה בפועל באמצעות תמונות unmixing:
   1. פתח את In Vivo הדמיה ניתוח משולב תוכנה.
   2. לבחור את הקובץ "Sequenceinfo" כדי להתחיל את הניתוח. שני חלונות יופיעו: "רצף view" ו- "כלי Palette". לבחור צבעים הכלי , לאחר התפריט הוצגה לבחור את האפשרויות הבאות.
   3. בחר תיקונים ולחץ על תיבת מסתגלת חיסור רקע FL כדי להסיר את אותות פלואורסצנט לא רצויה נתוני התמונה זורח. לבחור את סף הגדול הריבית ולחץ על הגדר.
   4. לחץ על הספקטרום Unmixing, בחר אורכי הגל של עניין, השיטה במחירים unmixing (ספריית, מודרכים, אוטומטית או ידנית) ולאחר מכן לחץ על להתחיל Unmix.
   5. בחר את התמונה Unmixed המתאים לאות mCherry ולאחר לחיצה כפולה. יופיע חלון חדש עם התמונה הסופית של האות עניין.
   6. חזור על שלב 5.1.3.
   7. אופציונלי: אם דמות ייצוגית (JPEG) של התוצאה unmix יש צורך, בחר את ההגדרות הרצויות ב- כלי לוח | תמונה כוונן (צבע שולחן, binning, לעומת זאת, וכו.), ולאחר מכן לחץ על ייצוא גרפיקה בחלון ' unmix ' כדי לייצא את התצוגה הנוכחית של התמונה כתמונה.
   8. שמור את הקובץ החלקיות: קובץ | שמירת | בחר תיקיית , בסדר.
   9. חזור על התהליך עם שאר הימים ניטור ועם כל בעלי החיים.
2. ROIs להגדיר ו אות כמת
   1. לחץ על עיון ובחר את הקובץ החלקיות (ראה שלב 5.1.8) לעניין להיות מנותח. יופיע חלון חדש.
   2. לחץ על הוסף לרשימת כדי לכלול את כל הקבצים החלקיות של כל בעל חיים בנקודות זמן שונות ולאחר מכן לחץ על טען בתור קבוצה. כל התמונות להופיע כרצף אחד.
   3. עבור אל חלון כלי הצבעים : לחץ על מהקופסא אניוהקבוצתית קנה מידה כדי לקבל את כל התמונות באותה רמה.
   4. לחץ פעמיים על תמונה אחת של הרצף וליצור של רועי ב- zone עניין באמצעות הרצף הבא. ללכת רועי כלים , בחר Countour ואת האפשרות Auto 1 , לחץ על צורת מעגל המופיעים, להניחה על המרכז האות פלורסנט ולאחר מכן לחץ על צור על החלון המוצג.
      הערה: זו באופן אוטומטי מדגיש פיקסלים עם עוצמות של זריחה מעל ערכי הרקע (קרי, הנגע), יוצרת צורה של מי האיזור מחבק את הפיקסלים מחולקת לרמות.
   5. להעתיק את הצורה רועי שנוצר ולהדביק על רקע אזור שבו אין אות.
   6. לחץ על מדד ROIs | בחר הכל כדי להציג את הערכים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. המשך לבחור ערכי נתונים עם העכבר, לחץ על הלחצן הימני, לחץ על העתק והדבק בגיליון אלקטרוני.

6. נתונים (אות ניאון) נורמליזציה

1. בחר בנקודת הזמן הראשוני ברמזור שבו עוצמת הוא מקסימלי. המשך לנרמל את האות בכל נקודה בזמן באמצעות הנוסחה:
   אות בעוצמה בכל נקודה בזמן / עוצמת האות המקסימלי שנצפה במהלך הזמן) x 100.

תוצאות

כאן, אנו מתארים את התהליך ליצירת מודל heterologous של אנדומטריוזיס שבו הארכיטקטורה של נגעים נשמר על ידי השתלת fluorescently שכותרתו פיסות רירית הרחם אנושי לתוך immunocompromised עכברים, ובכך מאפשר לא פולשנית ניטור של התקדמות הנגע. תיוג של קטעי רירית הרחם מושגת על-ידי זיהום עם אדנו מתוכנן mCherry...

Discussion

פרוטוקול מפורט במסמך זה מתאר את היישום של מודל חיה של אנדומטריוזיס שבו נשמר את הארכיטקטורה של השתלת נגעים אדריכלות בזמן בו זמנית ומאפשר הערכה בזמן אמת של קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי mCherry מתויג רקמת רירית הרחם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש של מערכת הדמיה ויוו ספציפיות וכן תוכנו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	---	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g	B-BRAUN	---	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	---	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	---	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	---	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator