Неинвазивный мониторинг размера поражения в гетерологичных мыши модели эндометриоза

Резюме

Здесь мы представляем протокол для жить изображений дневно обозначенные человека эндометрия фрагментов, привитые на мышах. Этот метод позволяет изучать последствия препаратами выбора размера endometriotic поражения посредством мониторинга и количественной оценки флуоресценции, испускаемых флуоресцентные репортер в реальном времени

Аннотация

Здесь мы описываем протокол для реализации гетерологичных мыши модели, в которой прогрессирования эндометриоз может оцениваться в реальном времени через неинвазивного мониторинга флуоресценции, испускаемых имплантированных внематочная эндометрия ткани человека. Для этой цели биопсии эндометрия человека получены от доноров женщин продолжающихся ооцитов. Человека эндометрия фрагменты культивированный присутствии аденовирусов спроектирован, чтобы выразить cDNA для репортера флуоресцентный белок mCherry. После визуализации помечены тканей с оптимальной скоростью флуоресценции после инфекции, впоследствии выбрали для имплантации в получателей мышей. Одну неделю до операции имплантации, oophorectomized получателей мышей, и эстрадиола гранулы находятся подкожно для поддержания выживания и роста поражений. В день операции мыши являются наркотизированных и брюшной полости, осуществляется через небольшой (1,5 см) разрез linea alba. Дневно обозначенные имплантатов являются tweezed, кратко пропитанной клеем и придает перитонеальных слоев. Зашиваются надрезы, и животных осталось вернуть на пару дней. Флуоресцирование, излучаемых endometriotic имплантаты обычно неинвазивным контролируется каждые 3 дня за 4 недели с системой визуализации в естественных условиях. Вариации в размере endometriotic имплантантов может быть оценена в реальном времени путем количественной оценки mCherry сигнал и нормализации против начальный момент времени, показаны максимальные флуоресценции интенсивности.

Традиционные грызунов доклинических моделей эндометриоз не позволяют Неинвазивный мониторинг поражения в режиме реального времени, но скорее позволяют производить оценку воздействия наркотиков assayed в конечной точке. Этот протокол позволяет отслеживать поражений в режиме реального времени и более полезным для изучения терапевтический потенциал наркотиков в доклинических моделях эндометриоза. Основным ограничением модели таким образом, что Неинвазивный мониторинг не возможно более длительных периодов времени из-за episomal выражение Ad-вируса.

Введение

Эндометриоз является хронические гинекологические расстройства, инициированных имплантации функциональных эндометрия вне полости матки. Эктопическая поражения растут и вызвать воспалительные процессы, ведущие к хронической тазовой боли и бесплодие¹. Предполагается, что до 10 – 15% женщин репродуктивного возраста страдают от endometriosis2, и она присутствует в примерно 40 – 50% от бесплодных женщин³. Текущий фармакологического лечения эндометриоза удалось полностью искоренить поражения и не свободной от побочных эффектов^4,5. Исследования для более эффективного лечения требует уточнения существующих животных моделей эндометриоза таким образом, что можно надлежащим образом имитировать человека поражений, и воздействие соединений на размер поражения среди прочего могут оцениваться тесно.

Предводитель модели были использованы для имитации эндометриоза, по разработке внематочная поражения гистологически идентичные и подобные сайты как люди^6,,78; Однако этические проблемы и высокие экономические издержки связанные с эксперименты с приматов предел их использования⁹. Следовательно использование мелких животных, особенно грызунов, для реализации моделей-vivo эндометриоза продолжает отдавать предпочтение как позволяет исследования с большим количеством лиц^10,11. Эндометриоз может быть наведено в этих животных путем пересадки куски грызунов маточные Рожки («гомологичных модели»)^12,13 или эндометрия/endometriotic тканей человека внематочная сайты (гетерологичных модели)¹⁴ . В отличие от людей грызуны не сбрасывают их эндометрия ткани и тем самым эндометриоз может не быть разработаны спонтанно в этих видов. Таким образом гомологичных мышь, которую модели эндометриоза подверглись критике с тем, что имплантированных внематочная мыши маточных тканей не отражает характеристик человека endometriotic поражений¹⁵.

В гетерологичных модели эндометриоз, где свежий человека фрагменты эндометрия вживляются в иммунодефицитных животных можно имитировать соответствующий физиологии эндометриоза. В обычных гетерологичных модели терапевтическое воздействие соединений интерес обычно оцениваются в конечной точке оценки размера поражения с использованием суппорта¹⁶. Очевидным ограничением является, что, таким образом, конечной Животные модели не позволяют изучать динамику имплантации или endometriotic поражение развития с течением времени. Дополнительное ограничение, что использование суппорта не позволяет точные измерения размера поражения. Действительно стандартная ошибка, предоставляемый суппортами находится в том же диапазоне (то есть, миллиметров) размер повреждений, имплантированные в мышей, таким образом ограничивая потенциал этих инструментов для выявления фактического изменения в размер.

Для того, чтобы преодолеть такие ограничения, здесь, мы описываем поколения гетерологичных мышиной модели эндометриоза, в котором спроектирован имплантированных тканей человека выразить репортер m вишня флуоресцентный белок. Обнаружение флуоресцентного сигнала с системой соответствующего изображения позволяет Неинвазивный мониторинг состояния поражения с одновременным количественного определения его размера в режиме реального времени. Таким образом наша модель имеет явные преимущества по сравнению с обычными конечной модели, как он приносит возможность Неинвазивный мониторинг в режиме реального времени и возможность для выполнения более объективной и точной оценки вариации размеров поражения.

протокол

Использование образцов человеческой ткани был одобрен институциональных Наблюдательный Совет и Комитет по этике из больницы Университарио La Fe. Все пациенты условии письменного информированного согласия. Исследование с участием животных была одобрена Комитетом институционального ухода животных на Centro де инвестигасьон Принсипи Фелипе де Валенсия, и все процедуры были выполнены следующие руководящие принципы для ухода и использования млекопитающих из национальных институтов здравоохранения.

1. эндометрия ткани сбора и предварительной обработки

1. Получите хорошее качество биопсии человеческой аспирата эндометрия с помощью канюли, подключенный к устройству всасывания. Залейте биопсии в колбу, содержащие 10 мл стерильным физиологическим и мыть с нежным ручной агитации.
   Примечание: Процедуры на как получить хорошее качество биопсии были ранее описанных¹⁷.
2. Вымойте биопсии любых оставшихся крови или слизи. Повторите этот процесс, поливая ткань для фляги, содержащий свежие солевых столько пальцев при необходимости до тех пор, пока ткань наблюдается чистый.
3. Перенос биопсии фрагментов с здоровый внешний вид в раствор, содержащий 10 мл завершить среднего среднего (DMEM) Дульбекко изменение орла с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 1% раствор антибиотика противогрибковое.
4. Залить содержимое в 10 см Петри и приступить к нарезать³ штук 5-10 мм с парой скальпели ткани.

2. аденовирусных Transfection эндометрия фрагментов

Примечание: Все материалы, которые будут использоваться в процессе должен вводиться в капюшоне заранее. Взять все, что не будет использоваться в процессе и место колбу с хлоркой. Весь материал, который вступает в контакт с аденовирусных вектор должен быть вылечен с отбеливателем прежде чем выбросить его в контейнере биологической опасности.

1. После биопсии были рубленые, принять новый Петри. Пипетка несколько 30 – 50 мкл DMEM капли распространения на протяжении всего блюдо. Оставьте достаточно места между капли, так что они не вступают в контакт.
2. Помогал с иглой, прилагается к шприцу, место одного куска фрагмент внутри каждого из среднего капель.
   Примечание: Каждая капля должен содержать одну часть эндометрия.
3. Приготовить рабочий раствор Ad-mCherry путем разбавления 1:20 от mCherry аденовирусных Стоковый раствор [1 x 10¹⁰ ОРП/мл]) в среде DMEM средних без антибиотиков (DMEM + 10% фильтруют FBS).
4. Отказаться от 100 – 200 мкл Ad-mCherry раствора в скважину на 96-луночных плита, заполнение как многие скважины, как фрагменты доступны в чашке Петри капель (шаг 2.2). Кроме того заполните по крайней мере 3 скважины с аденовирус бесплатно DMEM среднего как отрицательный контроль.
5. Помогал с иглой, прилагается к шприцу, передачи каждый из фрагментов в Петри (шаг 2.2) каждому из скважин, содержащий объявление mCherry решение в 96-луночных пластины.
6. Место 96 хорошо плита, содержащие фрагменты эндометрия с Ad-mCherry раствор в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO₂ для 16 h.
7. Промывают оставшиеся аденовирусов в среде путем передачи тканей в новую плиту 96-луночных заполнены с полным DMEM среднего (с антибиотиками противогрибковые, бесплатно аденовирус) и проинкубируйте 37 ° C с 5% CO₂ за 24-48 ч.
   Примечание: Не забудьте покрытия с хлоркой, все хорошо пластины и советы, которые вступил в контакт с Ad вирус прежде чем выбросить в контейнер биологической опасности.
8. Вынуть пластину из инкубатора и поместите его под микроскопом флуоресценции в 568 Нм (красный канал) для тестирования для оптимального маркировки.
9. Выбрать самых блестящих осколков и поместить их в новую плиту 96-луночных с свежий полный DMEM среднего (с антибиотиками противогрибковые, бесплатно аденовирус).
10. Уплотнение пластину с пластиковой парафин фильм и транспортировки его в зоне свободной от конкретного патогена животного для имплантации эндометрия фрагментов в получателей животных.

3. Создание модели мыши эндометриоза

Примечание: Использовать 6-8 недели-старый Атинические ню (или аналогичных ослабленным штаммы) самок мышей, в конкретных условиях, возбудитель – бесплатно, как получателей животных. Чтобы избежать гормонального цикла зависимых вариации и одновременно рост поражения топлива с эстрадиол, животные, ovariectomized и размещены с 60-дневной версии капсулы, содержащие 18 мг 17 βeta-эстрадиола (₂17β-E). Придатками и Пелле размещения должны выполняться по крайней мере за одну неделю до прививки эндометрия фрагменты в получателя животных.

1. Овариэктомия
   Примечание: Подготовьте хирургической стерилизации материал в капюшоне. Подготовьте оборудование для анестезии и послеоперационного восстановления зоны готовы в той же комнате.
   1. Выполните подкожной инъекции морфина производной в дозе 5 мг/кг в мышь. Пусть отдых 30 мин после инъекции, так как анальгетиков может проявляться эффекты препарата мышей.
   2. Подключите ингаляционной анестезии оборудование и пусть кислорода и изофлюрановая (2% мг/кг) поток на несколько минут в запечатанном анестезии камеру.
   3. Ввести животное в зале изофлюрановая анестезии. Подождите 3-5 мин и проверьте, что животные полностью находятся под наркозом, нажав одну из его лапы. Передача животное в области хирургии и поддержания анестезии, поставив маска с непрерывным потоком газа изофлюрановая, охватывающих дыхательных путей.
   4. После дезинфекции области с chlorohexidine, выполнить поперечной 0,5 см реберного разрез приблизительно на высоте бедра с острыми ножницами.
   5. Отделите кожу от мышцы, чтобы получить доступ к брюшной полости, выявления белой жировой ткани, которая окружает завязи и убрать яичника с щипцами рассечение.
   6. Завязывайте узел вокруг маточных труб с рассасывающиеся шовные и затяните его обеспечить соответствующие гемостаз до иссечения яичника.
   7. Закройте мышечный слой с рассасывающиеся шовные 6-0, а затем закройте кожи с 6-0 не рассасывающиеся шовные. Чистота области снова с антисептическим раствором.
   8. Повторите эту процедуру для удаления яичника боковое contra.
2. Эстрадиол Пелле имплантат
   Примечание: Позаботьтесь, что животное под наркозом во время операции овариэктомия поставить окатышей на тот момент.
   1. Сразу же после завершения процедуры овариэктомия Очистите кожу с антисептическим раствором, вокруг шеи и сделать разрез поперечной подкожной малых (0,5 см) с острыми ножницами в затылке.
   2. Используйте ножницы, чтобы вскрыть кожу от мышц, делая кармане достаточно большой, чтобы позволить размещение гранулы.
   3. Вставьте гранулы, содержащие 18 мг 17β-E₂ и шовные кожи с не рассасывающиеся шовные 6-0. Чистота области снова с антисептическим раствором.
   4. Поместите животное в зоне восстановления и администрировать оптимальную дозу долговечные обезболивания для облегчения восстановительного периода.
3. Эндометрия имплантации
   Примечание: Позвольте по крайней мере в течение семи дней карантина позволяет полного восстановления животных после овариэктомии перед началом операции имплантации эндометрия фрагмент. Для оптимальной синхронизации с маркировки ткани Соберите биопсии 2 – 3 дня до операции имплантации с тем, чтобы избежать долгосрочных культуры эксплантов.
   1. Получите хирургические комнаты в свободной зоне конкретного возбудителя готовы заранее. Также подготовьте капот с все необходимые хирургические материалы, оборудование для анестезии и послеоперационного восстановления зоны.
   2. Принесите животных в комнату, выполните подкожной инъекции морфина производной в дозе 5 мг/кг () в каждой мыши. Дайте отдохнуть в течение 30 мин после инъекции так обезболивающие эффекты препарата может проявляться мышей.
   3. Подключите ингаляционной анестезии оборудование и пусть кислорода и изофлюрановая (2% мг/кг) поток на несколько минут в запечатанном анестезии камеру.
   4. Перед началом операции, двигаться пластину, содержащие дневно надписью фрагменты (из шага 2.10) в капот, распечатать его и налить в чашку Петри для обработки проще фрагменты.
   5. Ввести животное в зале изофлюрановая анестезии. Подождите 3-5 мин и проверьте, что животные полностью находятся под наркозом, нажав одну из его лапы. Передача животное в области хирургии и поддержания анестезии, поставив маска с непрерывным потоком газа изофлюрановая, охватывающих дыхательных путей.
   6. Место наркотизированных животного лицом вверх. Продезинфицируйте брюшной области. Выполните продольной 1,5 см разрез в брюшной полости с острыми ножницами и отделить кожу от мышц. Затем выполните разрез продольной 1,5 см в мышцы для доступа к брюшной полости.
   7. Удерживайте левый край мышечной стенки живота мини-пинцетом и сложите его пытаются подвергать внутренней поверхности брюшины снаружи.
   8. Возьмите имплантат эндометрия с помощью пинцета, Мини, кратко вымочить в n бутил Эстер Цианакрилатный клей и поместить его в брюшине, где он будет привязываться. Дайте ему высохнуть в течение нескольких секунд. Повторите шаги 3.3.6 и 3.3.7 поставить имплант на контралатеральную сторону брюшины.
   9. Закройте мышечный слой с швом рассасывающиеся 6-0, а затем закройте кожи с не рассасывающиеся шовные 6-0. Чистота области снова с антисептическим раствором.
   10. Поместите животное в зоне восстановления и администрировать оптимальную дозу долговечные анальгезии.

4. в Vivo флуоресцентных изображений с в Vivo, изображений системы

1. Включите в естественных условиях устройство обработки изображений системы, инициализировать программу и разрешить CCD камеры остыть в течение нескольких минут.
2. Подготовка оборудования ингаляционной анестезии. Откройте изофлюрановая потока на 2% на пару мин для заполнения обезболивающий камеры. Подготовьте зоны восстановления после анестезии.
3. После начала программы и ПЗС-камеры остыли, щелкните инструмент Визуализации мастера : учебник начинается с серии последовательных windows отображается, каждый из которых соответствует параметру интерес с несколькими вариантов могут быть использованы нажав на соответствующее поле. Двигаться вперед с учебником, установив соответствующие флажки в каждом окне и нажмите кнопку ОК , чтобы перейти к следующему набору параметров с следующую последовательность.
   1. Выберите поле Epiluminescence для параметра флуоресценции, выберите поле mCherry для параметра filter пар. Установите флажки фотография режиме и Подтвердить фокус и выберите поле автоматическое для параметра экспозиции.
4. После того, как был создан прибор, переместите одно животное в камере анестезии. Когда полностью под наркозом, передачи животное внутри в vivo imaging системы клетки и поместите его в бок вверх с его голову внутрь трубочка, подключенный к машине анестезии. Закройте крышку и нажмите получить для мониторинга.
5. Приобрести изображения (в общей сложности пять изображений, один образ для каждой пары фильтров выбран) и сохранение данных, нажав кнопку Сохранить как . Переместите мышь в области восстановления после анестезии. Повторите процесс с остальных животных.
6. Повторяйте наблюдение два или три раза в неделю по итогам сигнал надлежащим образом в течение времени.
7. Перейти в жертву животное в конце курса время CO₂ удушение.

5. Количественная оценка в Vivo флуоресценции изображений

1. Сегрегация фактической флуоресценции через расслоение изображения:
   1. Откройте в Vivo Imaging анализ сочетании программного обеспечения.
   2. Выберите файл «Sequenceinfo», чтобы начать анализ. Появится два окна: «Последовательность взгляд» и «Палитра». Выберите Палитру и после отображения меню выберите следующие параметры.
   3. Выберите исправления и нажмите на поле Адаптивное вычитание фона FL для удаления нежелательных флуоресцентные сигналы из данных светящиеся изображения. Выберите порог наибольший интерес и нажмите кнопку установить.
   4. Нажмите кнопку спектральные Unmixing, выберите длин волн интерес, метод, выбранный для unmixing (Библиотека, экскурсии, автоматическая или ручная) и нажмите кнопку начать Unmix.
   5. Выберите Unmixed изображения, соответствующие mCherry сигнала и дважды щелкните. Появится новое окно с окончательное изображение сигнала интерес.
   6. Повторите шаг 5.1.3.
   7. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Если требуется представитель изображение (JPEG) unmix результата, выберите нужные параметры в палитру | Изображение отрегулируйте (цвет таблицы биннинга, контраст, и т.д.), а затем выберите команду Экспортировать графику в окне unmix для экспорта текущего представления изображение как изображение.
   8. Сохраните файл несмешанных: файл | Сохранить как | Выберите папку и ОК.
   9. Повторите процесс с остальной частью мониторинга дней и со всеми животными.
2. Трансформирования создана и сигнал количественной оценки
   1. Нажмите кнопку Обзор и выберите файл несмешанных (см. шаг 5.1.8), представляющих интерес для анализа. Появится новое окно.
   2. Нажмите кнопку Добавить в список , чтобы включить все несмешанных файлы от каждого животного в разное время точки и нажмите на Нагрузку как группа. Все изображения должны появиться как единую последовательность.
   3. Перейдите в окно Палитры инструментов : нажмите покинуть полендивидуальное шкалу для получения всех изображений на той же шкале.
   4. Дважды щелкните в одном изображении последовательности и создавать ROI в зоне интереса, используя следующую последовательность. Пойдите к Инструменты ROI и выберите параметр Auto 1 и контурной , нажмите на круглую появляться, поместите его на центре флуоресцентного сигнала и нажмите кнопку создать на открывшемся окне.
      Примечание: Это автоматически выделяет пикселей с интенсивностью флуоресценции выше фоновых значений (т.е., поражения) и генерирует форму, OBLASTь которого охватывает изложенные пикселей.
   5. Скопируйте созданный ROI форму и вставьте на фоне зоны там, где нет сигнала.
   6. Нажмите на мера ROI | Выбрать все для отображения значений интенсивности флуоресценции. Приступить к выбрать значения данных с помощью мыши, щелкните правой кнопкой, нажмите кнопку Копировать и вставить в таблицу.

6. данные (флуоресцентные сигнал) нормализации

1. Выберите начальное время точку, в которой сигнал максимальной интенсивности. Перейти к нормализации сигнала на каждом этапе, используя формулу:
   Сигнал интенсивности в каждой точке время / интенсивность максимального сигнала наблюдается в течение времени) x 100.

Результаты

Здесь мы описывают процесс создания гетерологичных модели эндометриоза, в котором сохраняется архитектура поражений путем имплантации дневно обозначенные частей человеческого эндометрия в ослабленным мышей, таким образом позволяя неинвазивных мониторинг прогрес?...

Обсуждение

Протокол здесь подробно описывает реализацию животной модели эндометриоз, в котором архитектура имплантации поражения архитектура сохраняется пока одновременно позволяет реального времени оценки флуоресценции испускаемого mCherry с меткой эндометрия ткани. В этом протоколе мы описыв?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	---	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g	B-BRAUN	---	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	---	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	---	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	---	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator