Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы представляем протокол для жить изображений дневно обозначенные человека эндометрия фрагментов, привитые на мышах. Этот метод позволяет изучать последствия препаратами выбора размера endometriotic поражения посредством мониторинга и количественной оценки флуоресценции, испускаемых флуоресцентные репортер в реальном времени
Здесь мы описываем протокол для реализации гетерологичных мыши модели, в которой прогрессирования эндометриоз может оцениваться в реальном времени через неинвазивного мониторинга флуоресценции, испускаемых имплантированных внематочная эндометрия ткани человека. Для этой цели биопсии эндометрия человека получены от доноров женщин продолжающихся ооцитов. Человека эндометрия фрагменты культивированный присутствии аденовирусов спроектирован, чтобы выразить cDNA для репортера флуоресцентный белок mCherry. После визуализации помечены тканей с оптимальной скоростью флуоресценции после инфекции, впоследствии выбрали для имплантации в получателей мышей. Одну неделю до операции имплантации, oophorectomized получателей мышей, и эстрадиола гранулы находятся подкожно для поддержания выживания и роста поражений. В день операции мыши являются наркотизированных и брюшной полости, осуществляется через небольшой (1,5 см) разрез linea alba. Дневно обозначенные имплантатов являются tweezed, кратко пропитанной клеем и придает перитонеальных слоев. Зашиваются надрезы, и животных осталось вернуть на пару дней. Флуоресцирование, излучаемых endometriotic имплантаты обычно неинвазивным контролируется каждые 3 дня за 4 недели с системой визуализации в естественных условиях. Вариации в размере endometriotic имплантантов может быть оценена в реальном времени путем количественной оценки mCherry сигнал и нормализации против начальный момент времени, показаны максимальные флуоресценции интенсивности.
Традиционные грызунов доклинических моделей эндометриоз не позволяют Неинвазивный мониторинг поражения в режиме реального времени, но скорее позволяют производить оценку воздействия наркотиков assayed в конечной точке. Этот протокол позволяет отслеживать поражений в режиме реального времени и более полезным для изучения терапевтический потенциал наркотиков в доклинических моделях эндометриоза. Основным ограничением модели таким образом, что Неинвазивный мониторинг не возможно более длительных периодов времени из-за episomal выражение Ad-вируса.
Эндометриоз является хронические гинекологические расстройства, инициированных имплантации функциональных эндометрия вне полости матки. Эктопическая поражения растут и вызвать воспалительные процессы, ведущие к хронической тазовой боли и бесплодие1. Предполагается, что до 10 – 15% женщин репродуктивного возраста страдают от endometriosis2, и она присутствует в примерно 40 – 50% от бесплодных женщин3. Текущий фармакологического лечения эндометриоза удалось полностью искоренить поражения и не свободной от побочных эффектов4,5. Исследования для более эффективного лечения требует уточнения существующих животных моделей эндометриоза таким образом, что можно надлежащим образом имитировать человека поражений, и воздействие соединений на размер поражения среди прочего могут оцениваться тесно.
Предводитель модели были использованы для имитации эндометриоза, по разработке внематочная поражения гистологически идентичные и подобные сайты как люди6,,78; Однако этические проблемы и высокие экономические издержки связанные с эксперименты с приматов предел их использования9. Следовательно использование мелких животных, особенно грызунов, для реализации моделей-vivo эндометриоза продолжает отдавать предпочтение как позволяет исследования с большим количеством лиц10,11. Эндометриоз может быть наведено в этих животных путем пересадки куски грызунов маточные Рожки («гомологичных модели»)12,13 или эндометрия/endometriotic тканей человека внематочная сайты (гетерологичных модели)14 . В отличие от людей грызуны не сбрасывают их эндометрия ткани и тем самым эндометриоз может не быть разработаны спонтанно в этих видов. Таким образом гомологичных мышь, которую модели эндометриоза подверглись критике с тем, что имплантированных внематочная мыши маточных тканей не отражает характеристик человека endometriotic поражений15.
В гетерологичных модели эндометриоз, где свежий человека фрагменты эндометрия вживляются в иммунодефицитных животных можно имитировать соответствующий физиологии эндометриоза. В обычных гетерологичных модели терапевтическое воздействие соединений интерес обычно оцениваются в конечной точке оценки размера поражения с использованием суппорта16. Очевидным ограничением является, что, таким образом, конечной Животные модели не позволяют изучать динамику имплантации или endometriotic поражение развития с течением времени. Дополнительное ограничение, что использование суппорта не позволяет точные измерения размера поражения. Действительно стандартная ошибка, предоставляемый суппортами находится в том же диапазоне (то есть, миллиметров) размер повреждений, имплантированные в мышей, таким образом ограничивая потенциал этих инструментов для выявления фактического изменения в размер.
Для того, чтобы преодолеть такие ограничения, здесь, мы описываем поколения гетерологичных мышиной модели эндометриоза, в котором спроектирован имплантированных тканей человека выразить репортер m вишня флуоресцентный белок. Обнаружение флуоресцентного сигнала с системой соответствующего изображения позволяет Неинвазивный мониторинг состояния поражения с одновременным количественного определения его размера в режиме реального времени. Таким образом наша модель имеет явные преимущества по сравнению с обычными конечной модели, как он приносит возможность Неинвазивный мониторинг в режиме реального времени и возможность для выполнения более объективной и точной оценки вариации размеров поражения.
Использование образцов человеческой ткани был одобрен институциональных Наблюдательный Совет и Комитет по этике из больницы Университарио La Fe. Все пациенты условии письменного информированного согласия. Исследование с участием животных была одобрена Комитетом институционального ухода животных на Centro де инвестигасьон Принсипи Фелипе де Валенсия, и все процедуры были выполнены следующие руководящие принципы для ухода и использования млекопитающих из национальных институтов здравоохранения.
1. эндометрия ткани сбора и предварительной обработки
2. аденовирусных Transfection эндометрия фрагментов
Примечание: Все материалы, которые будут использоваться в процессе должен вводиться в капюшоне заранее. Взять все, что не будет использоваться в процессе и место колбу с хлоркой. Весь материал, который вступает в контакт с аденовирусных вектор должен быть вылечен с отбеливателем прежде чем выбросить его в контейнере биологической опасности.
3. Создание модели мыши эндометриоза
Примечание: Использовать 6-8 недели-старый Атинические ню (или аналогичных ослабленным штаммы) самок мышей, в конкретных условиях, возбудитель – бесплатно, как получателей животных. Чтобы избежать гормонального цикла зависимых вариации и одновременно рост поражения топлива с эстрадиол, животные, ovariectomized и размещены с 60-дневной версии капсулы, содержащие 18 мг 17 βeta-эстрадиола (217β-E). Придатками и Пелле размещения должны выполняться по крайней мере за одну неделю до прививки эндометрия фрагменты в получателя животных.
4. в Vivo флуоресцентных изображений с в Vivo, изображений системы
5. Количественная оценка в Vivo флуоресценции изображений
6. данные (флуоресцентные сигнал) нормализации
Здесь мы описывают процесс создания гетерологичных модели эндометриоза, в котором сохраняется архитектура поражений путем имплантации дневно обозначенные частей человеческого эндометрия в ослабленным мышей, таким образом позволяя неинвазивных мониторинг прогрес?...
Протокол здесь подробно описывает реализацию животной модели эндометриоз, в котором архитектура имплантации поражения архитектура сохраняется пока одновременно позволяет реального времени оценки флуоресценции испускаемого mCherry с меткой эндометрия ткани. В этом протоколе мы описыв?...
Авторы не имеют ничего сообщать.
Эта работа была поддержана испанским министерством экономики и конкурентоспособности через Мигель Сервет программу [CP13/00077] создана ФЕДЕР (Европейский фонд регионального развития) и присуждена к д-р р. Гомес, а также Карлос III институт здравоохранения гранты Dr R Гомес [ПЭ14/00547 и PI17/02329] и профессор а. Кано [ПЭ12/02582].
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены