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Method Article
Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging di vivere di frammenti endometriali umane fluorescente contrassegnati innestate nei topi. Il metodo permette di studiare gli effetti dei farmaci di scelta sulla dimensione della lesione endometriotic attraverso il monitoraggio e la quantificazione della fluorescenza emessa dal reporter fluorescente in tempo reale
Qui, descriviamo un protocollo per l'attuazione di un modello di topo eterologo in cui progressione di endometriosi può essere valutata in tempo reale attraverso il monitoraggio non invasivo della fluorescenza emessa dal tessuto dell'endometrio umano ectopico impiantato. Per questo scopo, le biopsie dell'endometrio umano vengono ottenute dalla donazione di ovociti in corso donne di donatore. Frammenti dell'endometrio umani sono coltivate in presenza di adenovirus progettato per esprimere cDNA per il reporter proteina fluorescente mCherry. Al momento della visualizzazione, etichettato tessuti con un tasso ottimo di fluorescenza dopo infezione successivamente vengono scelti per l'impianto in topi destinatari. Una settimana prima dell'intervento di impianto, destinatari topi sono oophorectomized e pallini di estradiolo sono posizionati per via sottocutanea per sostenere la sopravvivenza e la crescita delle lesioni. Il giorno dell'intervento, i topi sono anestetizzate e peritoneale cavità accessibili attraverso un'incisione di piccole dimensioni (1,5 cm) da linea-alba. Impianti fluorescente contrassegnati sono tweezed, brevemente imbevuti di colla e attaccati allo strato peritoneale. Incisioni sono suturate e gli animali lasciati a recuperare per un paio di giorni. Fluorescenza emessa da impianti endometriosici solitamente non invasivo è monitorata ogni 3 giorni per 4 settimane con un sistema di imaging in vivo. Variazioni nelle dimensioni di impianti endometriosici possono essere stimate in tempo reale mediante la quantificazione del segnale mCherry e normalizzazione contro il tempo-punto iniziale che mostra l'intensità di fluorescenza massima.
Roditori tradizionale preclinici di modelli di endometriosi non consentono il monitoraggio non invasivo della lesione in tempo reale, ma piuttosto consentono la valutazione degli effetti di farmaci dosati al punto finale. Questo protocollo permette di tenere traccia di lesioni in tempo reale ed è più utile per esplorare il potenziale terapeutico di farmaci in modelli preclinici di endometriosi. Il limite principale del modello così generato è che il monitoraggio non invasivo non è possibile per lunghi periodi di tempo a causa dell'espressione episomal del annuncio-virus.
L'endometriosi è un disturbo ginecologico cronico avviato tramite l'impianto dell'endometrio funzionale di fuori della cavità uterina. Le lesioni ectopiche crescono e inducono processi infiammatori che conduce a dolore e sterilità pelvica cronica1. Si stima che fino a 10-15% delle donne dell'età riproduttiva sono affetti da endometriosis2, ed è presente in circa il 40-50% delle donne infertili3. Gli attuali trattamenti farmacologici per endometriosi sono in grado di eliminare completamente le lesioni e non privo di effetti collaterali4,5. La ricerca di terapie più efficiente richiede del perfezionamento dei modelli animali esistenti di endometriosi in modo tale che le lesioni umane possono essere imitate in modo appropriato, e gli effetti dei composti sulla dimensione della lesione tra gli altri possono essere valutati molto attentamente.
Primate modelli sono stati utilizzati per simulare l'endometriosi di impiantare le lesioni ectopiche istologicamente identiche e a siti simili come in esseri umani6,7,8; Tuttavia, preoccupazioni etiche e gli elevati costi economici legate alla sperimentazione con primati limite loro uso9. Di conseguenza, l'uso di piccoli animali, specialmente roditori, per la realizzazione di modelli in vivo di endometriosi continua ad essere favorito in quanto consente di studi con i più grandi numeri di individui10,11. L'endometriosi può essere indotta in questi animali trapiantando o pezzi di roditore corni uterini "(modelli di omologhe")12,13 o tessuto umano dell'endometrio/endometriosiche per luoghi ectopici (modelli eterologhe)14 . In contrasto con gli esseri umani, roditori non versato il loro tessuto dell'endometrio e quindi l'endometriosi non possono essere sviluppata spontaneamente in queste specie. Pertanto, omologa mouse modelli di endometriosi sono state criticate in quanto impiantato tessuto uterino ectopica del mouse non riflette le caratteristiche delle lesioni endometriosiche umane15.
Fisiologia appropriata di endometriosi può essere imitato nei modelli eterologi di endometriosi dove frammenti endometriali umane fresche vengono impiantati in animali immunodeficienti. In modelli convenzionali eterologi, gli effetti terapeutici di composti di interesse sono comunemente valutati al punto finale dalla valutazione della dimensione della lesione con l'uso di pinze16. Una limitazione evidente è che, come tale, modelli animali dell'endpoint non consentono studiando l'impianto dynamics o lo sviluppo della lesione endometriotic nel corso del tempo. Un'ulteriore limitazione è che l'uso dei calibri non consente misure accurate della dimensione della lesione. Infatti, l'errore standard fornito da pinze è nella stessa fascia (cioè millimetri) come la dimensione delle lesioni impiantati nei topi, limitando così la capacità di questi strumenti per rilevare variazioni effettive dimensioni.
Al fine di superare tali limitazioni, qui, descriviamo la generazione di un modello murino eterologo di endometriosi in cui tessuto umano impiantato è costruita per esprimere una proteina fluorescente di reporter m-Cherry. Rilevamento del segnale fluorescente con un sistema di immagine appropriata consente il monitoraggio non invasivo dello status di lesione con quantificazione simultanea delle sue dimensioni in tempo reale. Così, il nostro modello fornisce chiari vantaggi rispetto ai modelli convenzionali endpoint in quanto porta l'opportunità di non invasivo di monitoraggio in tempo reale e la possibilità di eseguire più obiettivo e stima accurata delle variazioni nella dimensione della lesione.
L'uso di campioni di tessuto umano è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale Universitario La Fe e Institutional Review Board. Tutti i pazienti hanno fornito consenso informato scritto. Lo studio che coinvolgono gli animali è stato approvato dal comitato di cura animale istituzionale presso il Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, e tutte le procedure sono state effettuate seguendo le linee guida per la cura e l'uso dei mammiferi da istituti nazionali della salute.
1. pre-trattamento e la raccolta di tessuto dell'endometrio
2. adenoviral transfezione di frammenti endometriali
Nota: Tutti i materiali che stanno per essere impiegati nel processo dovrebbero essere introdotto nella cappa in anticipo. Togliere tutto ciò che non sta per essere utilizzati nel processo e posizionare una boccetta con candeggina. Tutto il materiale che entra in contatto con il vettore adenovirale dovrà essere disinfettato con la candeggina prima di scartarlo nel contenitore di biohazard.
3. generazione del modello del topo di endometriosi
Nota: Utilizzare 6 – 8 settimana-vecchio athymic nudo (o ceppi simili immunocompromessi) topi femmina ospitati in specifiche condizioni di agente patogeno – gratis, come destinatari animali. Per evitare variazioni ormonali del ciclo-dipendente e contemporaneamente alimentare la crescita lesione con estradiolo, sono animali ovariectomizzati e posizionato con 60 giorni di rilascio capsule contenenti 18 mg di βeta-estradiolo 17 (17 β-E2). Posizionamento di ovariectomia e pellet devono essere effettuate almeno una settimana di anticipo l'innesto di frammenti endometriali negli animali destinatari.
4. in Vivo Imaging fluorescente con In Vivo Imaging System
5. quantificazione di In Vivo fluorescenza immagini
6. dati (segnale fluorescente) normalizzazione
Qui, descriviamo il processo per la creazione di un modello eterologo di endometriosi che conserva l'architettura delle lesioni impiantando fluorescente contrassegnati pezzi di endometrio umano in topi immunocompromessi, consentendo in tal modo non invasivo monitoraggio della progressione della lesione. Etichettatura dei frammenti endometriali è raggiunto tramite l'infezione con l'adenovirus progettato per esprimere mCherry, una proteina che emettono fluorescenza nella regione del vicino...
Il protocollo dettagliato nel presente documento viene descritta l'implementazione di un modello animale di endometriosi in cui l'architettura di impiantare architettura lesioni è conservata mentre simultaneamente permettendo la valutazione di tempo reale della fluorescenza emessa da mCherry con l'etichetta tessuto endometriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un specifico sistema di imaging in vivo e relativo software per valutare in modo non invasivo fluorescenza emessa dalla lesione con etichetta. Ogni ute...
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Questo lavoro è stato supportato dal Ministero spagnolo dell'economia e la competitività attraverso il Miguel Servet programma [CP13/00077] ha cofondato dal FESR (Fondo europeo di sviluppo regionale) e assegnato a Dr R. Gómez nonché da Carlos III Istituto superiore di sanità sovvenzioni conferite Dr R Gómez [PI14/00547 e PI17/02329] e Prof A. Cano [PI12/02582].
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | --- | In vivo monitoring software |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
Isovet 1,000 mg/g | B-BRAUN | --- | Isoflurane (Anesthetic) |
Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | --- | Buprenorphine (Analgesic solution) |
Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | --- | Morphine (Analgesic solution) |
Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | --- | Sutures |
Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | --- | Antiseptic solution |
Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | --- | fluorescence microscope |
Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
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