JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف لنا غير الغازية في فيفو التصوير البروتوكول تكون مبسطة وفعالة من حيث التكلفة، الاستفادة من L-012، تشيميلومينيسسينت لومينول النظير، تصور والتحديد الكمي للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي تم إنشاؤها في نموذج ماوس استئصالية الجرح.

Abstract

الجيل للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) السمة مميزة للعمليات التحريضية، ولكن في الزائدة، تورط الأكسدة على نطاق واسع في مختلف الأمراض مثل السرطان، وتصلب الشرايين والسكري. وقد أظهرنا سابقا أن الخلل الوظيفي للعامل النووي (المستمدة من محمر 2)-مثل 2 (Nrf2)/التئام المستمدة من الخلية محمر كيلتش مثل البروتين 1 (كياب1) مما يشير إلى مسار يؤدي إلى المدقع روس الخلل خلال الجلدي في مرض السكري. نظراً لمستويات روس مؤشرا هاما على تطور التئام الجروح، قيمة تقنيات القياس الكمي محددة ودقيقة. وقد وصفت عدة فحوصات في المختبر لقياس روس في الخلايا والأنسجة؛ ومع ذلك، أنها توفر فقط قياس تراكمي واحد كل عينة. في الآونة الأخيرة، ووضع مؤشرات تستند إلى البروتين وطرائق التصوير أتاحت تحليلات الزمانية المكانية فريدة من نوعها. L-012 (13ح ج8كلن4الحسابية2) هو مشتق لومينول التي يمكن استخدامها في فيفو و في المختبر تشيميلومينيسسينت الكشف عن روس التي تم إنشاؤها بواسطة نابده أوكسيديز. L-012 تنبعث إشارة أقوى من غيرها المسابير الفلورسنت، ولقد ثبت أن تكون حساسة وموثوق بها للكشف عن روس. انطباق L-012-يسرت تصوير مرور الوقت يوفر معلومات قيمة عن العمليات الالتهابية مع الحد من الحاجة إلى التضحية وخفض عدد الحيوانات الدراسة الشاملة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام L-012-يسرت في فيفو التصوير للتحديد الكمي للأكسدة في نموذج لالتئام استئصالية استخدام الفئران السكري مع اختلال محلياً Nrf2/Keap1.

Introduction

والايضات الأوكسجين التي تم إنشاؤها من خلال عمليات الالتهابات تساهم مختلف الشلالات إرسال الإشارات، فضلا عن التغيير المدمرة لمكونات الخلوية1. استخدام تقنيات حساسة ومحددة لقياس روس أمر بالغ الأهمية لدراسة العمليات التحريضية ووصف آثار الأكسدة. التصوير في فيفو قيمة بسبب قدرته على توفير البيانات المكانية والزمانية الحيوية في الأنسجة الحية. L-012 هو تحقيق تشيميلومينيسسينت اصطناعية التي هي حساسة للغاية لأكسيد فائق الأنيونات وينتج كثافة ضوء أعلى من غيرها المسابير الفلورسنت في الخلايا والأنسجة والدم كله1،2،3، 4-أنها استخدمت بنجاح للتصوير في فيفو في نماذج مورين لدراسة أمراض التهابات عدة، بما في ذلك التهاب المفاصل والتهاب القولون5،6. فما زال التي ستستخدم في جرحا جلدي المنشأة شفاء النموذجي. قياس روس إنشاؤها نفس القدر ذات الصلة لتقييم تطور التئام تحت ظروف مختلفة. حساسية وطبيعة موسع لهذا الأسلوب يجعل من تقنية واعدة لدراسة التئام عبر نماذج مورين.

Nrf2 محرك رئيسي للاستجابة المضادة للأكسدة وعامل النسخي مع خصوصية لمضادات الأكسدة استجابة العنصر (ARE) مشتركة في مناطق المروج العديد من الإنزيمات المضادة للأكسدة8. نظراً لغياب الأكسدة، هو المعزول Nrf2 في السيتوبلازم ب Keap1، الذي يسبب لاحقاً في أوبيكويتينيشن وتدهور. قد تورط في التوازن الأكسدة غير ملائمة، وتأخر التئام الجروح في الإعداد لزيادة الأكسدة9اختلال المسار Nrf2/Keap1. أظهرنا سابقا أن قمع Keap1 يحفز زيادة Nrf2 النشاط ويعزز الجروح الإنقاذ من التئام الجرح الجلدي باثولوجي في السكري9.

هنا يصف لنا هو بروتوكول يستخدم الإضاءة الحيوية ل-012-ساعد التصوير لقياس مستويات روس في نموذج شفاء الجروح جلدية استئصالية، هو أمر حاسم لتسليط الضوء على الرابطة بين روس والتئام الجروح. هذا الأسلوب يوضح التغييرات في الوقت الحقيقي في عبء الأكسدة داخل الجروح والمنطقة المحيطة مباشرة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يسمح للتقييم السريع للتدخلات والآليات المناولة الأكسدة تؤثر على ذلك. هنا نستخدم نموذجا من كيب1 ضربة قاضية لاستعادة التوازن الأكسدة والاختزال لتقييم إمكانية تطبيق استراتيجيتنا. لأن لدينا تقنية غير الغازية والجروح بدون عائق، يمكن استخدام الحيوان نفسه لمزيد من التحليلات المؤكدة على أساس ليساتيس الخلايا أو الأنسجة.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة من نيويورك مدرسة الطب في جامعة. يتم إيواء جميع الفئران وراء حاجز وجميع الموظفين ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.

1-اليوم 0: إعداد نموذج مورين استئصالية التئام

  1. تخدير الفئران (db/dbمن قانون مباشرة الحقوق السياسية) السكري، الذين تتراوح أعمارهم بين 8 – 12 أسبوعا، مع استنشاق 2% إيسوفلوراني. التأكد من أن كل الماوس قد تم بشكل صحيح تخديره باستخدام اختبار قرصه لوح سيرا على الأقدام. تطبيق مواد التشحيم العين العقيمة لكل عين لمنع تهيج من جفاف. ينبغي على الباحثين اتبع الإرشادات موظفيها البيطرية المؤسسية عند أنيسثيتيزينج الحيوانات باستخدام إيسوفلوراني.
  2. وزن الفئران وتسجيل وزن الجسم كل الماوس. تأكيد حالة السكري من الحيوانات عن طريق تسجيل جلوكوز الدم كل حيوان من السكر باستخدام.
  3. تطهير المعدات مساحة العمل والتخدير الإجرائية. إزالة الشعر الظهرية للفئران باستخدام المتقلب شعر، متبوعاً بتطبيق محلول إزالة الشعر للقضاء على الشعر الزائد بعيداً. استخدام مناديل الكحول لتنظيف الجلد المكشوفة، مرتين، والسماح لتجف.
  4. إنشاء 10 مم سمك كامل جرحين تمتد من خلال كارنوسوس بانيكولوس استخدام اللكمات خزعة العقيمة 10 ملم حسب جرح استئصالية راسخة شفاء تقنية7،8. استخدام قفازات معقمة للجراحة البقاء على قيد الحياة كافة. اﻷوتوكﻻف جميع الأدوات الجراحية في أكياس قبل الجراحة وفتح فقط في مجال الجراحة.
  5. مقاطعة جبيرة الجراح فتح باستخدام ورقة سيليكون سميك 0.5 ملم مع 10 ملم دائرية القواطع وتأمين الدعامات في المكان باستخدام خيوط الحرير 4-0.
  6. إزالة الحيوانات من التخدير جراحة التالية، ثم ضع على تدفئة وسادة لتسهيل استرداد السليم. ملاحظة، إذا انخفضت درجة حرارة جسم الحيوان أثناء الإجراء، الحيوان قد يتم نقل إلى لوحة تدفئة في وقت سابق لتقليل فقدان حرارة الجسم تحت التخدير. مراقبة الحيوانات حتى تكون مستيقظا ومتنقلة.
  7. حالما تعافي تماما، إرجاع الحيوانات إلى الأقفاص الفردية، التي تحتوي على الأغذية والمياه (التأكد من بعض المواد الغذائية على أرضية القفص لتخصيب اليورانيوم بعد العمليات الجراحية). توفير المناشف الورقية تمزيقه مواد التعشيش إضافية لمدة أسبوعين. لا بيت الحيوانات التي خضعت لجراحة مع الحيوانات الأخرى، لمنع التفاعلات السلبية والتغييرات في حالة شفاء الجرح.
  8. لتخفيف الألم بعد العمليات الجراحية، حقن الفئران تحت الجلد مع البوبرينورفين في 0.1 مغ/كغ وزن الجسم مرتين يوميا، تبدأ مباشرة بعد الإجراء، لمدة 3 أيام.

2-يوم 1: إعداد Keap1 siRNA

ملاحظة: إعداد جميع العلاجات داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.

  1. إعداد تمييع siRNA بالجمع بين 37.5 ميليلتر من المتوسطة المصل انخفاض 12.5 ميليلتر من 20 ميكرومتر Keap1 siRNA (سيكيب1) (250 بمول) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على الجليد.
  2. إعداد تمييع الحويصلية بالجمع بين 25 ميليلتر من المصل انخفاض متوسط 25 ميليلتر من مزيج الحويصلية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  3. إضافة 50 ميليلتر لتمييع siRNA إلى 50 ميليلتر الحويصلية تمييع dropwise (المجلد 1:1)، وتخلط برفق.
  4. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة 50 ميليلتر من هلام ميثيلسيلولوسي 2% في الماء وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  6. علاج كل الحيوانات مع أي سي هراءNS (تحكم) أو سيكياب1 (تجريبية). تطبيق الجل على الجزء العلوي من الجرح. لف الجذع للحيوان مع خلع الملابس فيلم شفاف لإبقاء جل في المكان، الحفاظ على أطرافه مجاناً للحفاظ على التنقل.

3-اليوم الثالث: إعداد حل L-012

ملاحظة: إعداد جميع الكواشف في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.

  1. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، إعداد L-012 في برنامج تلفزيوني X 1 في تركيز من 0.5 ملغ/100 مل.
  2. يدوياً دوامة أنبوب ميكروسينتريفوجي. لا تذوب L-012 تماما في برنامج تلفزيوني، إلا أنه ينبغي تعليق في السائل بالتساوي. من المذكرة، لا تحاول حل L-012 في الماء لتجنب المزعجة توازن اﻻلكتروﻻيت الفسيولوجية بعد الحقن.
  3. نقل الحل في محقن 1 مل باستخدام إبرة ز 27.
    ملاحظة: يجب التأكد من حماية الحل L-012 من الضوء.

4-يوم 3: في فيفو تصوير لجروح مرضى السكري

  1. تخدير الفئران مع استنشاق 2% إيسوفلوراني. ينبغي على الباحثين اتبع الإرشادات موظفيها البيطرية المؤسسية عند أنيسثيتيزينج الحيوانات باستخدام إيسوفلوراني. التأكد من أن كل الماوس قد تم بشكل صحيح تخديره باستخدام اختبار قرصه لوح سيرا على الأقدام. تطبيق مواد التشحيم العين العقيمة لكل عين لمنع تهيج من جفاف.
  2. إزالة بلطف خلع الملابس فيلم شفاف من الفئران دون الإخلال بالجروح.
  3. وضع الفئران في قاعة التصوير في الأوامر الخاصة بكل منها. للحفاظ على مستويات2 س السليم في الدائرة، تعيين تدفق نظام التصوير ومستويات2 غرفة س التعريفي إلى 1.0 لتر في الدقيقة.
  4. صورة الفئران للإضاءة الحيوية والصورة في الأساس قبل الحقن لمجمع L-012.
  5. مسح البطن مع مناديل الكحول والسماح لتجف. إجراء حقن داخل الحل L-012 في 5 ملغ كل 200 جرام من استخدام إبرة 27-قياس وزن الجسم. على سبيل المثال، ينبغي أن تتلقى ماوس تزن 20 غ 0.5 ملغ L-012.
  6. مباشرة بعد حقن L-012، مكان الفئران مرة أخرى في مواقعها في غرفة التصوير. صورة الفئران على مدى 60 دقيقة، لمدة 1 دقيقة على فترات 4 دقائق. تعريف الجرح 10 ملم كمنطقة ذات الاهتمام لتحديد المستوى لروس.
  7. إزالة الحيوانات من التخدير جراحة التالية، ثم ضع على تدفئة وسادة لتسهيل استرداد السليم. مراقبة الحيوانات حتى تكون مستيقظا ومتنقلة.
  8. حالما تعافي تماما، عودة الحيوانات في أقفاص فردية، الحفاظ على بيئة تخصيب اليورانيوم بعد العمليات الجراحية نفسها الموصوفة سابقا في 1.6. لا بيت الحيوانات التي خضعت لجراحة مع الحيوانات الأخرى، لمنع التفاعلات السلبية والتغييرات في حالة شفاء الجرح.

النتائج

ثلاثة أيام بعد إنشاء الجروح الثنائية وفقا لنموذج جرح استئصالية المنشأة (الشكل 1A)، يتم وضع الفئران السكري في قاعة التصوير. وتؤخذ صورة فوتوغرافية أولية ومقياسا للإضاءة الحيوية قبل حقن L-012 لمراعاة الإشارات الخلفية (الشكل 1B). عقب الحقن داخل مع...

Discussion

الأساليب الشائعة لقياس روس حدت من البروتوكولات المعقدة التي تتطلب استخراج الأنسجة أو تقنيات الغازية وبالمثل. في السنوات الأخيرة، أبلغ عن قياسات للأكسدة على أساس أساليب التصوير المبتكرة، مما يسمح لتقييمات الزمانية المكانية9،،من1011. وقد L...

Disclosures

وعلينا لا الكشف للتقرير.

Acknowledgements

ونحن ممتنون "جوهر التصوير السريري" في "كلية الطب في جامعة نيويورك"، بخاصة بفضل اريستيزابال أورلاندو ويوسف الزعيم وادغيري. الأساسية مورد مشترك يدعمه جزئيا 5P30CA016087 لورا وإسحاق بيرلموتر السرطان مركز دعم المنح المعاهد الوطنية للصحة/NCI و NIBIB الطبية تكنولوجيا الموارد مركز منح المعاهد الوطنية للصحة P41 EB017183. هذا العمل كان تدعمها الرابطة الأمريكية لمرض السكري "الطريق لوقف مرض السكري" إلى العاصمة [منحة رقم 1-16-آيس-08] وجامعة نيويورك تطبق صندوق دعم البحوث للعلاقات العامة

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J miceJackson Laboratories000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)Sigma Aldrich 665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings3M88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentLife Technologies 11668027
Keap1 Stealth siRNAThermofisher Scientific1299001
Silencer negative control Thermofisher Scientific AM4635
Opti-MEM Reduced SerumThermoFisher Scientific11058021
DPBSThermoFisher Scientific14040133
Methyl-cellulose Sigma Aldrich9004-67-5
L-012Wako Chemicals120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System PerkinElmer

References

  1. Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
  2. Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
  3. Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
  4. Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
  5. Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
  6. Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
  7. Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
  8. Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
  9. Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
  10. Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
  11. Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
  12. Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
  13. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
  14. Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
  15. Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved