Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델

요약

우리는 비-침략 적 vivo에서 이미징 프로토콜을 간소 하 고 비용 효율적인, L-012, chemiluminescent luminol 아날로그, 시각화 하 고 계량 상처 excisional 마우스 모델에서 생성 된 반응성 산소 종 (선생님)을 활용 하 여 설명 합니다.

초록

반응성 산소 종 (ROS)의 발생, 염증 성 프로세스의 특징 이지만 널리 초과, 산화 스트레스는 암, 동맥 경화, 당뇨병 등 다양 한 병 리 연루. 우리 핵 요인 (erythroid 파생 2)의 그 역 기능으로 나타났습니다 이전-2 (Nrf2) 같은 Kelch 같은 erythroid 세포 유래 단백질 1 (Keap1) 신호 통로 피부 동안 극단적인 선생님 불균형에 이르게 상처 당뇨병에 치유 /. 선생님 수준 상처 치유의 진행의 중요 한 지시자 이기 때문에, 구체적이 고 정확한 정량화 기술 가치가 있습니다. 세포와 조직에서 선생님을 측정 하기 위해 여러 생체 외에서 분석 설명 되었습니다; 그러나, 그들은 단지 샘플 당 단일 누적 측정을 제공합니다. 더 최근에, 단백질 기반 지표 및 이미징 modalities의 개발은 독특한 spatiotemporal 분석에 대 한 수 있다. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂)은 luminol 파생 모두 vivo에서 그리고 생체 외에서 chemiluminescent에 사용할 수 있는 NAPDH 산화 효소에 의해 생성 된 선생님의 탐지. L-012 다른 형광 프로브 보다 더 강한 신호를 방출 하 고 과민 하 고 선생님을 탐지 하기 위한 신뢰할 수 있는 것을 보여줘 왔다. 시간 경과 적용 L 012 촉진 이미징의 희생에 대 한 필요성을 줄이고 전반적인 연구 동물의 수를 감소 하는 동안 염증 성 프로세스에 대 한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 여기, 우리는 프로토콜 L 012 촉진 하는 비보에 이미징 excisional 상처 치유 로컬 역 기능 Nrf2/Keap1와 당뇨병 쥐를 사용 하 여 모델에서 산화 스트레스 척도를 활용 하 여 설명 합니다.

서문

염증 성 프로세스를 통해 생성 된 산소 대사 산물 세포 구성 요소¹의 파괴적인 변경 뿐만 아니라 다양 한 신호 폭포에 기여 한다. 선생님을 측정에 과민 하 고 특정 기술을 활용 하는 것이 염증 성 프로세스를 공부 및 산화 스트레스의 효과 대 한 중요 합니다. Vivo에서 화상 진 찰은 조직 생활에에서 동적 공간 및 시간 데이터를 제공 하는 기능 때문에 중요 합니다. L-012는 superoxide 음이온에 대 한 매우 민감한 이며 생산 하는 세포, 조직, 및 전 혈^1,2,3, 에서 다른 형광 프로브 보다 높은 빛의 강도 합성 chemiluminescent 조사 ⁴. 그것은 성공적으로 고용 되었다 vivo에서 화상 진 찰 murine 모델에 대 한 여러 염증 성 질환, 관절염, colitis^5,6을 포함 하 여 공부 하. 그것은 아직 설립된 피부 상처 치유 모델에에서 채택 한다. 생성 된 선생님의 측정은 동등 하 게 다른 조건 하에서 상처 치유의 진행 평가 관련이 있다. 이 방법의 비 침 투 적인 자연과 감도 네요 murine 모델에 걸쳐 상처 치유를 공부 하는 유망 기술.

Nrf2 항 산화 반응과 transcriptional 요소 여러 항 산화 효소⁸의 발기인 지구에 공통 항 산화 반응 요소 (는)에 대 한 특이성의 주요 드라이버입니다. 산화 스트레스의 부재, Nrf2는 세포질에 연속적으로 그것의 ubiquitination 및 저하를 일으키는 원인이 되는 Keap1에 의해 격리 됩니다. Nrf2/Keap1 통로의 불균형 부적절 한 산화 환 원 항상성 및 산화 스트레스를 증가⁹의 설정에서 지연된 상처 치유에 연루 되었습니다. 우리가 나타났습니다 이전 Keap1의 Nrf2 활동 증가 자극 하 고 촉진 당뇨병 pathologic 피부 상처 치유의 구조⁹상처.

여기는 L 012를 이용한 생물 발광 excisional 피부 상처 치유 모델 선생님과 상처 치유 사이 협회를 강조를 위해 중요 하다는 선생님 수준을 측정에 이미징 사용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 기술은 산화 부담 상처와 즉각적인 주변 내에서 실시간으로 변화를 보여 줍니다. 또한,이 방법은 신속한 개입 및 메커니즘의 평가 대 한 그 영향을 산화 환 원 처리 수 있습니다. 여기 사용 Keap1 최저 모델 산화 환 원 항상성의 복원에 대 한 우리의 전략의 적용 가능성을 평가 합니다. 우리의 기술은 비 침략 적 이며 상처를 방해 하지 않습니다, 때문에 같은 동물 조직학 또는 세포 lysates 기초 더 확실 한 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 뉴욕 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다. 모든 마우스는 장벽 뒤에 지 내게 하 고 모든 직원이 적절 한 개인 보호 장비를 착용.

1. 일 0: Excisional 상처 치유의 Murine 모델의 준비

1. 당뇨병 (Lepr^db/db) 쥐, 8-12 주, inhalational 2 %isoflurane 세 anesthetize 각 마우스는 되었습니다 제대로 취 발 패드 핀치 테스트를 사용 하 여 확인 합니다. 건조에서 자극을 방지 하기 위해 각 눈에 메 마른 눈 윤 활 유를 적용 됩니다. 연구원은 isoflurane를 사용 하 여 동물을 마비 하는 때 그들의 기관 수의 직원의 지침을 따라야 한다.
2. 쥐의 무게 고 각 마우스의 몸 무게를 기록 합니다. glucometer을 사용 하 여 각 동물의 혈액 포도 당을 기록 하 여 동물의 당뇨병 상태를 확인 합니다.
3. 절차 작업 영역 및 마 취 장비를 소독. 헤어 트리머를 사용 하 여 마우스의 지 느 러 미를 제거 뒤에 멀리 초과 머리를 닦아 머리 제거 로션의 응용 프로그램. 알코올 잎사귀를 사용 하 여 두 번, 노출 된 피부를 청소 하 고 건조를 허용 합니다.
4. 두 개의 10 m m 전체 두께 상처 치유 기법^7,8확고 excisional 상처에 따라 살 균 10 m m 생 검 펀치를 사용 하 여 panniculus carnosus를 통해 확장을 만듭니다. 멸 균 글러브를 사용 하 여 모든 생존 수술에 대 한. 오토 클레이 브 수술과 수술 필드에만 오픈 전에 가방에 모든 수술 기구.
5. 부 목 상처는 10 m m 원형 배 기판을 가진 0.5 m m 두꺼운 실리콘 시트를 사용 하 여 열고 보안 장소를 사용 하 여 스 텐트 4-0 비단 봉합 중단.
6. 다음 수술, 마 취에서 동물을 제거 하 고 적절 한 복구를 용이 하 게 하는 패드를가 열에 놓습니다. 메모의 절차 동안, 동물 체온 감소 하는 경우 동물 이동할 수 있습니다가 열 패드를 이전 마 취 몸 열 손실을 최소화 하기 위해. 깨어 및 모바일 때까지 동물을 모니터링 합니다.
7. 일단 완 치, 개별 감 금 소, 음식 및 물 (수술 농축에 대 한 감 금 소의 바닥에는 어떤 음식을 확인)에 동물을 반환 합니다. 2 주 동안 추가 중첩 물자 났습니다 종이 타 올을 제공 합니다. 불리 한 상호 작용 및 상처 치유 상태에 변화를 방지 하기 위해 다른 동물 들과 함께 수술을 받은 동물을 집 하지 마십시오.
8. 수술 후 통증 완화를 위해 주사 마우스 피하 buprenorphine 0.1 mg/kg의 몸 무게에서 함께 하루에 두 번, 3 일에 대 한 절차에 따라 즉시 시작.

2. 주 1: Keap1 siRNA의 준비

참고: 캐비닛 biosafety 안에 모든 치료를 준비 합니다.

1. 얼음에 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 감소 된 혈 청 매체의 37.5 µ L 12.5 µ L 20 µ M Keap1 siRNA (siKeap1)의 (250 pmol)와 결합 하 여 siRNA 희석을 준비 합니다.
2. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 liposome 믹스의 25 µ L로 감소 된 혈 청 매체의 25 µ L를 결합 하 여 liposome 희석을 준비 합니다.
3. 50 µ L liposome 희석 dropwise (1:1 볼륨)에 siRNA 희석의 50 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
4. 실 온에서 20 분 동안 품 어.
5. 물에 2% 스 젤의 50 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.
6. 난센스 시NS (제어)와 함께 각 동물을 치료 또는 시Keap(실험적인) 1. 상처의 정상에 젤을 적용 합니다. 투명 필름 드레싱 유지 하 젤, 이동성을 유지 하기 위해 무료로 사지를 유지 동물의 몸통을 감싸 줍니다.

3. 주 3: L-012 솔루션의 준비

참고: 캐비닛 biosafety에 모든 시 약을 준비 합니다.

1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 0.5 mg/100 mL의 농도에서 1 X PBS에 L-012을 준비 합니다.
2. 수동으로 소용돌이 microcentrifuge 튜브입니다. 그러나 L-012 않습니다 하지 완전히 용 해는 PBS에 액체에 균등 하 게 중단 되어야 합니다. 메모의 해산 다음 주입 방해 생리 전해질 균형을 피하기 위해 물에 L-012 시도 하지 마십시오.
3. 27 G 바늘을 사용 하 여 1 mL 주사기로 솔루션을 전송 합니다.
   참고: 빛에서 L-012 솔루션을 보호 해야 합니다.

4. 주 3: Vivo에서 화상 진 찰 당뇨병 상처의

1. Inhalational 2 %isoflurane 마우스 anesthetize 연구원은 isoflurane를 사용 하 여 동물을 마비 하는 때 그들의 기관 수의 직원의 지침을 따라야 한다. 각 마우스는 되었습니다 제대로 취 발 패드 핀치 테스트를 사용 하 여 확인 합니다. 건조에서 자극을 방지 하기 위해 각 눈에 메 마른 눈 윤 활 유를 적용 됩니다.
2. 부드럽게 상처를 방해 하지 않고 쥐에서 투명 필름 드레싱을 제거 합니다.
3. 그들의 각각 명령에 이미징 챔버에는 마우스를 놓습니다. 챔버에 적절 한 O₂ 수준을 유지 하려면 1.0 L/분 이미징 시스템 유입 및 유도 챔버 O₂ 레벨을 설정 합니다.
4. 생물 발광와 L-012 화합물의 주입 하기 전에 기준선에서 사진에 대 한 마우스를 이미지.
5. 알코올 잎사귀와 복 부를 닦 고 건조 허용. 5 mg 200 g 몸 무게 27-게이지 바늘을 사용 하 여 당에 L-012 해결책의 복 주사를 수행 합니다. 예를 들어 마우스 무게 20 g L-012의 0.5 mg을 받아야 한다.
6. L-012 주입 직후 다시 이미징 약 실에 있는 그들의 각각 위치에에서 쥐를 놓습니다. 4 분 간격으로 1 분간 60 분 동안 쥐를 이미지. 선생님의 수준 결정에 대 한 관심의 영역으로 10 mm 상처를 정의 합니다.
7. 다음 수술, 마 취에서 동물을 제거 하 고 적절 한 복구를 용이 하 게 하는 패드를가 열에 놓습니다. 깨어 및 모바일 때까지 동물을 모니터링 합니다.
8. 일단 완 치, 1.6에서 설명한 동일한 수술 농축 환경 유지, 개별 연습장에 동물을 반환 합니다. 불리 한 상호 작용 및 상처 치유 상태에 변화를 방지 하기 위해 다른 동물 들과 함께 수술을 받은 동물을 집 하지 마십시오.

결과

설립된 excisional 상처 모델 (그림 1A), 양자 상처를 만든 후 3 일 당뇨병 쥐 이미징 챔버에 배치 됩니다. 초기 사진 그리고 생물 발광의 측정 L-012의 주입 하기 전에 배경 신호 (그림 1B)에 대 한 계정에 찍힌다. L-012 솔루션 복 주입, 따라 쥐 챔버에 재배치 됩니다 및 생물 발광 선생님 탐지 되는 상처의 영역에서 시각화 (

토론

선생님을 측정 하기 위한 일반적인 기법 조직 추출 또는 침략 적 기술이 필요로 하는 복잡 한 프로토콜에 의해 제한 되어 있다. 최근 몇 년 동안, 산화 스트레스의 측정 spatiotemporal 평가^9,,1011에 대 한 수 있도록 혁신적인 이미징 형식에 근거 하 여 보고 되었습니다. L-012는 luminol, lucigenin, 및 MCLA^1,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer