En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo

Resumen

Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.

Resumen

La generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) es un rasgo distintivo de los procesos inflamatorios, pero en exceso, el estrés oxidativo está ampliamente implicado en diversas patologías como cáncer, aterosclerosis y diabetes. Previamente hemos demostrado que la disfunción del factor Nuclear (derivados del eritroide 2)-como 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como célula proteína derivada Keap 11señalización vía conduce al desequilibrio extremo de ROS durante cutáneo cicatrización en la diabetes. Puesto que los niveles ROS son un importante indicador de la progresión de la cicatrización de heridas, técnicas de cuantificación específicas y precisas son valiosas. Diversos estudios en vitro para medir ROS en las células y los tejidos han sido descritas; sin embargo, sólo proporcionan una medición acumulativa individual por muestra. Más recientemente, han permitido el desarrollo de indicadores basados en la proteína y de modalidades de imágenes únicos análisis espaciotemporal. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂) es un derivado luminol que puede utilizar para tanto en vivo como en vitro quimioluminiscente detección de ROS generados por la oxidasa NAPDH. L-012 emite una señal más fuerte que otras sondas fluorescentes y se ha demostrado para ser sensible y confiable para la detección de ROS. La aplicabilidad de lapso de tiempo de L-012-facilitó la proyección de imagen proporciona información valiosa sobre los procesos inflamatorios mientras reduce la necesidad de sacrificio y en general reduciendo el número de animales de estudio. Aquí, describimos un protocolo utilizando L-012-facilitado en vivo la proyección de imagen para cuantificar el estrés oxidativo en un modelo de cicatrización de la herida excisional con ratones diabéticos de Nrf2/Keap1 localmente disfuncional.

Introducción

Metabolitos de oxígeno generados por procesos inflamatorios contribuyen a varias cascadas de señales así como alteraciones destructivas de componentes celulares¹. Utilización de técnicas sensibles y específicas para medir ROS es crítica para el estudio de procesos inflamatorios y caracterización de los efectos del estrés oxidativo. Proyección de imagen in vivo es valioso debido a su capacidad para proporcionar datos dinámicos espaciales y temporales en tejido vivo. L-012 es una sintético sonda quimioluminiscente que es altamente sensible para los aniones superóxido y produce una mayor intensidad de luz que otras sondas fluorescentes en las células, tejidos y sangre entera^{1,2,3, 4}. se ha empleado con éxito para obtener imágenes en vivo en modelos murinos para estudiar varias enfermedades inflamatorias, como artritis y colitis^5,6. Aún no se ha empleado en una herida cutánea establecida modelo de curación. Medición de ROS generados es igualmente pertinente para evaluar la progresión de la cicatrización en condiciones diferentes. La sensibilidad y el carácter no invasivo de este método es una técnica prometedora para el estudio de la cicatrización de heridas a través de modelos murinos.

Nrf2 es un importante factor de la respuesta antioxidante y un factor transcripcional con especificidad para el elemento de respuesta antioxidante (es) común a las regiones promotoras de varios antioxidantes enzimas⁸. En ausencia de estrés oxidativo, el Nrf2 es secuestrado en el citoplasma por Keap1, que posteriormente causa su ubiquitinación y degradación. Desequilibrio de la vía Nrf2/Keap1 se ha implicado en la homeostasis redox inadecuado y retraso de la cicatrización de heridas en el ajuste del aumento del estrés oxidativo⁹. Previamente hemos demostrado que la supresión de Keap1 estimula la actividad creciente de Nrf2 y promueve el rescate de herida cutánea patológica curación en diabético hiere a⁹.

Aquí se describe un protocolo que utiliza bioluminiscencia L-012-asistido para medir los niveles de ROS en un modelo de curación herida cutánea por escisión, que es fundamental para destacar la asociación entre el ROS y la cicatrización de la proyección de imagen. Esta técnica muestra en tiempo real cambios en carga oxidativa dentro de las heridas y periferia inmediata. Además, este método permite una evaluación rápida de las intervenciones y mecanismos manejo de redox afectan. Aquí utilizamos un modelo de Keap1 caída para la restauración de la homeostasis redox para evaluar la aplicabilidad de nuestra estrategia. Ya que nuestra técnica es no invasiva y las heridas son inalteradas, el mismo animal puede utilizarse para mayores análisis confirmatorios a partir de lisados de histología o celular.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de la New York University School of Medicine. Todos los ratones se encuentran detrás de una barrera y todo el personal use equipo de protección personal.

1. día 0: Preparación de un modelo murino de cicatrización de la herida Excisional

1. Anestesiar ratones diabéticos de (Lepr^db/db), de 8 – 12 semanas, con inhalatorios isoflurano 2%. Confirmar que cada ratón ha sido adecuadamente anestesiado mediante la prueba de pie almohadilla pizca. Aplicar lubricante ocular estéril para cada ojo para evitar la irritación por sequedad. Los investigadores deben seguir las directrices de su personal veterinario institucional cuando anestesiar animales con isoflurano.
2. Los ratones de pesar y registrar el peso de cada ratón. Confirme el estado diabético de animales mediante el registro de la glucosa en la sangre de cada animal mediante un glucómetro.
3. Desinfectar equipo procedimiento de anestesia y espacio de trabajo. Eliminar el vello dorsal de los ratones con un cortapelos, seguido de la aplicación de loción de eliminación del pelo para limpiar el exceso de pelo lejos. Use toallitas de alcohol para limpiar la piel expuesta, dos veces y deje que se seque.
4. Crear dos heridas de espesor total de 10 mm que se extiende a través del panniculus carnosus utilizando punzones de biopsia estéril 10 mm según un bien establecido por escisión de cicatrización técnica^7,8. Utilizar guantes estériles para todas las cirugías de sobrevivencia. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos en bolsas antes de la cirugía y abierto sólo en el campo quirúrgico.
5. Las heridas abiertas utilizando una hoja de silicona espesor 0,5 mm con recortes circulares de 10 mm y fije los stents en lugar de la tablilla interrumpe las suturas de seda 4-0.
6. Después de la cirugía, quitar animales de anestesia y colocar el cojín para facilitar la recuperación adecuada de calefacción. De la nota, si disminuye la temperatura corporal de animales durante el procedimiento, el animal puede moverse a la almohada antes para reducir al mínimo pérdida de calor corporal bajo anestesia. Monitorear los animales hasta que se despierta y móviles.
7. Una vez recuperado, volver los animales a jaulas individuales, con alimentos y agua (Asegúrese de que es algo de comida en el piso de la jaula para el enriquecimiento de postoperatorio). Proveer toallas de papel triturado material de nidificación como adicional durante 2 semanas. No casa de animales que han sido sometidos a cirugía con otros animales, para evitar las interacciones adversas y cambios en el estado de cicatrización de la herida.
8. Para el alivio del dolor postoperatorio, inyectar ratones por vía subcutánea con buprenorfina en 0,1 mg/kg de peso corporal dos veces al día, empezando inmediatamente después del procedimiento, durante 3 días.

2. día 1: Preparación de Keap1 siRNA

Nota: Preparar todos los tratamientos dentro de un gabinete de bioseguridad.

1. Preparar la dilución de siRNA combinando 37.5 μl de medio de suero reducido con 12,5 μl de 20 μm Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo.
2. Preparar liposomas dilución mediante la combinación de 25 μl de medio de suero reducido con 25 μl de mezcla de liposomas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Añadir 50 μl de la dilución de siRNA a 50 μl liposomas dilución gota a gota (volumen 1:1) y mezclar suavemente.
4. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
5. Añadir 50 μl de gel de metilcelulosa al 2% en agua y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
6. Tratar a cada animal con un si absurdoNS (control) o siKeap1 (experimental). Aplicar el gel en la parte superior de la herida. Envolver el torso del animal con apósito de película transparente para mantener gel en su lugar, mantener las extremidades para mantener movilidad gratis.

3. día 3: Preparación de solución de L-012

Nota: Preparar todos los reactivos en un gabinete de bioseguridad.

1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, preparar L-012 de 1 X PBS a una concentración de 0,5 mg/100 mL.
2. Vórtice manualmente el tubo de microcentrífuga. El L-012 no se disuelve completamente en el PBS, sin embargo debe ser uniformemente suspendido en el líquido. De la nota, no trate de disolver L-012 en agua para evitar la inquietante equilibrio de electrólito fisiológica después de la inyección.
3. Transferir la solución en una jeringa de 1 mL con una aguja de 27 G.
   Nota: Asegúrese de proteger la solución de L-012 de la luz.

4. día 3: En Vivo la proyección de imagen de las heridas diabéticas

1. Anestesiar ratones con inhalatorios isoflurano 2%. Los investigadores deben seguir las directrices de su personal veterinario institucional cuando anestesiar animales con isoflurano. Confirmar que cada ratón ha sido adecuadamente anestesiado mediante la prueba de pie almohadilla pizca. Aplicar lubricante ocular estéril para cada ojo para evitar la irritación por sequedad.
2. Suavemente Retire el apósito de película transparente de los ratones sin molestar a las heridas.
3. Coloque el ratón en la cámara de imágenes en sus respectivos órdenes. Para mantener los niveles adecuados de la₂ O en la cámara, establezca la entrada de sistema de proyección de imagen y los niveles de inducción cámara O₂ a 1.0 L/min.
4. Imagen de los ratones de bioluminiscencia y fotografía al inicio antes de la inyección del compuesto L-012.
5. Limpie el abdomen con toallitas de alcohol y dejar para secar. Realizar una inyección intraperitoneal de solución L-012 en 5 mg por peso 200 g, utilizando una aguja calibre 27. Por ejemplo, un ratón de 20 g de peso debe recibir 0,5 mg de L-012.
6. Inmediatamente después de la inyección de L-012, volver a colocar los ratones en sus respectivos lugares en la cámara de proyección de imagen. Imagen de los ratones en el transcurso de 60 minutos, durante 1 minuto a intervalos de 4 minutos. La herida de 10 mm se define como la región de interés para determinar el nivel de ROS.
7. Después de la cirugía, quitar animales de anestesia y colocar el cojín para facilitar la recuperación adecuada de calefacción. Monitorear los animales hasta que se despierta y móviles.
8. Una vez recuperado, volver los animales a jaulas individuales, manteniendo el mismo ambiente de enriquecimiento postoperatorias descrito en 1.6. No casa de animales que han sido sometidos a cirugía con otros animales, para evitar las interacciones adversas y cambios en el estado de cicatrización de la herida.

Resultados

Tres días después de crear heridas bilaterales según un modelo establecido herida excisional (figura 1A), ratones diabéticos se colocan en la cámara de proyección de imagen. Una fotografía inicial y una medida de la bioluminiscencia se toman antes de la inyección de L-012 para tener en cuenta para la señal de fondo (figura 1B). Después de la inyección intraperitoneal con la solución de L-012, los ratones se reposicion...

Discusión

Técnicas comunes para la medición de ROS han sido limitadas por protocolos complejos que requieren la extracción de tejido o técnicas invasivas. En los últimos años, se han reportado mediciones del estrés oxidativo sobre la base de modalidades de imágenes innovadoras, permitiendo evaluaciones spatiotemporal^9,10,11. L-012 tiene varias ventajas como sonda quimioluminiscente luminol, lucigenina y MCLA¹

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer