Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

Özet

Biz bir non-invaziv vivo içinde aerodinamik ve maliyet-etkin, protokolü Imaging görselleştirmek ve reaktif oksijen türlerine (ROS) bir fare excisional yara modelinde oluşturulan ölçmek için L-012, bir chemiluminescent luminol-analog, kullanan açıklar.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS) nesil iltihabi süreçleri özelliğidir ama fazla, oksidatif stres yaygın kanser, ateroskleroz ve diyabet gibi çeşitli patolojileri içinde karıştığı. Daha önce nükleer faktör (2 erythroid elde edilen) bu disfonksiyon göstermiştir-2 (Nrf2) hangi tarihlerde / yol açar aşırı ROS dengesizlik kutanöz sırasında sinyal Kelch benzeri erythroid protein 1 (Keap1) hücre kaynaklı yara diyabet şifa. ROS düzeyleri yara iyileşme progresyon önemli bir göstergesi olduğundan, özel ve doğru miktar teknikleri değerlidir. ROS hücre ve dokulara ölçmek için birkaç vitro deneyleri tarif var; Ancak, onlar sadece örnek başına tek bir toplu ölçüm sağlar. Daha yakın zamanlarda, protein bazlı göstergeleri ve görüntüleme yöntemleri benzersiz kronolojik zamanmekansal analizleri için izin. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂) içinde vivo ve in vitro chemiluminescent için kullanılabilir bir luminol türevi olan NAPDH oksidaz tarafından oluşturulan ROS tespiti. L-012 Diğer Floresan problar daha güçlü sinyale yayar ve hassas ve güvenilir ROS algılama olduğu gösterilmiştir. L-012-kolaylaştırdı görüntüleme zaman atlamalı uygulanabilirliği ise kurban gereksinimini azaltma ve genel olarak çalışma hayvan sayısını azaltarak iltihabi süreçleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, L-012-kolaylaştırdı vivo içinde yerel olarak işlevsel olmayan Nrf2/Keap1 ile diyabetik fare kullanarak excisional yara iyileşmesi bir modeldir oksidatif stres ölçmek için Imaging kullanan bir iletişim kuralı açıklar.

Giriş

Oksijen metabolitleri inflamatuar işlemler üretilen çeşitli sinyal cascades hem de hücresel bileşenleri¹yıkıcı İLETİMLERİNİZE katkıda. ROS ölçmek için hassas ve belirli teknikler kullanan iltihabi süreçleri eğitim ve oksidatif stresin etkilerini karakterize için önemlidir. Vivo görüntüleme canlı dokuya dinamik uzamsal ve zamansal veri sağlamak yeteneği nedeniyle değerlidir. Süperoksit anyon için son derece hassas ve Diğer Floresan problar hücre, doku ve tam kan^1,2,3, daha yüksek bir ışık şiddeti üreten bir sentetik chemiluminescent sonda L-012 olduğunu ⁴. bu başarıyla vivo içinde görüntüleme fare modelleri için çeşitli inflamatuar hastalıklar, artrit ve kolit^5,6dahil olmak üzere çalışmaya istihdam edilmiştir. Modeli şifa kurulan bir kutanöz yarada istihdam edilecek henüz. Oluşturulan ROS ölçümü farklı koşullar altında yara iyileşmesi ilerlemeyi değerlendirmek aynı derecede uygundur. Duyarlılık ve bu yöntemin invaziv olmayan doğa arasında fare modelleri yara iyileşmesi için umut verici bir yüntem yapar.

Nrf2 antioksidan yanıt ve bir transkripsiyon faktörü antioksidan yanıt öğesi (vardır) birçok antioksidan enzimler⁸organizatörü bölgelerinde yaygın için özgüllük ile büyük bir sürücüdür. Oksidatif stres, yokluğunda Nrf2 sitoplazma içinde daha sonra onun ubiquitination ve düşmesine neden olan Keap1 tarafından münzevi. Nrf2/Keap1 yolu dengesizlik uygunsuz redoks homeostazı ve artmış oksidatif stres⁹ayarında gecikmiş yara iyileşmesi karıştığı olmuştur. Biz daha önce Keap1 bastırılması artan Nrf2 etkinliği uyarır ve teşvik göstermiştir diyabetik içinde patolojik kutanöz yara iyileşme Kurtarma yarası⁹.

Burada L-012-destekli bioluminescence ROS ile yara iyileşmesi arasındaki ilişkiyi vurgulamak için önemlidir excisional kutanöz yara iyileşme modelinde ROS düzeyleri ölçmek için Imaging kullanan bir iletişim kuralı açıklar. Bu teknik oksidatif yük yaralar ve acil çevre içinde gerçek zamanlı değişiklikleri gösterir. Ayrıca, bu yöntem hızlı değerlendirme müdahaleler ve mekanizmaları için bu etkiler redoks işleme sağlar. Burada biz bir modelini Keap1 nakavt redoks homeostazı restorasyonu için stratejimiz uygulanabilirliğini değerlendirmek için kullanın. Bizim non-invaziv bir tekniktir ve yaralar rahatsız oldukları için aynı hayvan histolojisi veya hücre lysates temelinde daha fazla doğrulama analizleri için kullanılabilir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, New York Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır. Tüm fareler bir engel yer alan ve tüm personel uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.

1. gün 0: Excisional yara iyileşmesi fare modeli hazırlanması

1. İnhalational % 2 isoflurane ile 8-12 hafta yaşlı diyabetik (Lepr^db/db) fareler anestezi. Her fare düzgün Ayak pedi çimdik testi kullanılarak anestezi olduğunu doğrulayın. Steril oküler yağ tahriş kimden kuruluğu önlemek için her göz için geçerlidir. Araştırmacılar isoflurane kullanarak hayvanlar anesthetizing zaman onların kurumsal hayvan hastalıklarıyla ilgili personelinin yönergeleri takip etmelidir.
2. Fareler tartmak ve vücut ağırlığı her fare ile kayıt. Her hayvan bir şeker ölçüm kullanarak kan şekeri kaydederek hayvanlar diyabetik durumunu doğrulayın.
3. Yordam çalışma alanı ve anestezi ekipman dezenfekte. Bir saç düzeltici kullanarak fare dorsal tüylerden uzak kıllarında silmek için uygulama saç Temizleme losyonu tarafından takip. İki kez maruz kalan cilt temizlemek için alkol mendil kullanın ve kurumasını bekleyin.
4. Steril 10 mm biyopsi yumruk tekniği^7,8şifa köklü bir excisional yara göre kullanarak panniculus carnosus aracılığıyla uzanan iki 10 mm tam-kalınlık yaralar oluşturmak. Steril eldiven tüm survival cerrahi için kullanın. Otoklav tüm cerrahi aletler cerrahi ve cerrahi alan sadece açıkta önce torbalarda.
5. Yaraları ile 10 mm dairesel kesik bir 0,5 mm kalın silikon sayfasını kullanarak açın ve kullanım yeri olarak restenoz güvenli ateli 4-0 ipek sütür kesildi.
6. Aşağıdaki cerrahi, hayvanlar anesteziden çıkarın ve uygun kurtarma kolaylaştırmak için yastık Isıtma üzerinde yerleştirin. Hayvan vücut ısısı işlem sırasında azalýrsa belirtmek gerekirse hayvan ısıtma yastığını daha önce anestezi altında vücut ısı kaybını en aza indirmek için taşınmış olabilir. Uyanık ve mobil kadar hayvanları izlemek.
7. Sonra tamamen iyileşti, hayvanlar bireysel kafesleri, yiyecek ve su (ameliyat sonrası zenginleştirme için kafes katında yiyecek bir şeyler olduğundan emin olun) içeren dönün. Rendelenmiş kağıt havlu 2 hafta kadar ek iç içe geçmiş malzeme sağlamak. Cerrahi olumsuz etkileşim ve yara iyileşme durumu değişiklikleri önlemek için diğer hayvanlarla geçiren hayvanlar ev değil.
8. Ameliyat sonrası ağrı yardım için fareler subkutan buprenorfin 0.1 mg/kg vücut ağırlığı ile günde iki kez, 3 gündür yordamın hemen ardından başlayan enjekte et.

2. gün 1: Keap1 siRNA hazırlanması

Not: tüm tedaviler bir Biyogüvenlik kabini içinde hazırlamak.

1. SiRNA seyreltme 12.5 µL (250 pmol) 20 µM Keap1 siRNA (sıKeap1) ile düşük serum orta 37,5 µL birleştirerek buz bir 1.5 mL microcentrifuge Tüp hazırlayın.
2. Lipozom seyreltme lipozom Mix bir 1.5 mL microcentrifuge tüp 25 µL düşük serum orta 25 µL birleştirerek hazırlayın.
3. SiRNA seyreltme 50 µL 50 µL lipozom seyreltme için dropwise (1:1 cilt) ekleyin ve karışımı yavaşça.
4. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya.
5. % 2 methylcellulose jel 50 µL su ekleyin ve karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting.
6. Her hayvan ya da bir saçmalık siNS (kontrol) ile tedavi siKeap1 (deneysel). Jel yara uygulamak. Hayvanın gövde jel, bacaklarda hareketlilik korumak ücretsiz tutmak tutmak için şeffaf film soyunma ile sarın.

3. gün 3: L-012 çözüm hazırlanması

Not: tüm reaktifler bir Biyogüvenlik kabini içinde hazırlamak.

1. 1.5 mL microcentrifuge Tüp, bir konsantrasyon 0,5 mg/100 mL 1 X PBS L-012 hazırlayın.
2. El ile microcentrifuge tüp girdap. Eşit olarak sıvı içinde askıya ancak L-012 tamamen PBS çözülmez yok. Not, enjeksiyon takip rahatsız edici fizyolojik elektrolit denge önlemek için L-012 suda çözülür girişiminde bulunmaz.
3. Çözüm 27 G iğne kullanarak 1 mL şırınga aktarın.
   Not: L-012 çözüm ışıktan korumak emin olun.

4. gün 3: Vivo içinde görüntüleme, diyabetik yaralar

1. İnhalational % 2 isoflurane ile fareler anestezi. Araştırmacılar isoflurane kullanarak hayvanlar anesthetizing zaman onların kurumsal hayvan hastalıklarıyla ilgili personelinin yönergeleri takip etmelidir. Her fare düzgün Ayak pedi çimdik testi kullanılarak anestezi olduğunu doğrulayın. Steril oküler yağ tahriş kimden kuruluğu önlemek için her göz için geçerlidir.
2. Yavaşça şeffaf film soyunma fareler yaralar bozmadan çıkarın.
3. Fareler kendi siparişlerini görüntüleme odasında yerleştirin. Uygun O₂ düzeyleri odasında korumak için 1.0 L/dak için görüntüleme sistemi girişi ve indüksiyon odası O₂ düzeyleri ayarlayın.
4. Fareler bioluminescence ve temel L-012 bileşik enjeksiyon önce fotoğrafa için görüntü.
5. Karın alkol mendil ile silin ve kurumasını sağlar. Mayi iğne 27'lik iğne kullanarak 200 g vücut ağırlığı başına 5 mg L-012 çözümün gerçekleştirin. Örneğin, 20 gr ağırlığında bir fare 0.5 mg L-012 almanız gerekir.
6. Hemen ardından L-012 enjeksiyon geri yerlerde onların anılan sıraya göre görüntüleme odasında fareler yer. Fareler 4 dakika aralıklarla 1 dakika 60 dakika boyunca görüntü. 10 mm yara faiz ROS düzeyini belirlemek için bölge tanımlamak için kullanılır.
7. Aşağıdaki cerrahi, hayvanlar anesteziden çıkarın ve uygun kurtarma kolaylaştırmak için yastık Isıtma üzerinde yerleştirin. Uyanık ve mobil kadar hayvanları izlemek.
8. Bir zamanlar tamamen iyileşti, bireysel kafesleri, daha önce açıklanan 1,6 aynı ameliyat sonrası zenginleştirme ortamı korumak için dönüş hayvanlar. Cerrahi olumsuz etkileşim ve yara iyileşme durumu değişiklikleri önlemek için diğer hayvanlarla geçiren hayvanlar ev değil.

Sonuçlar

Göre kurulan excisional yara modeli (Şekil 1A), ikili yaralar oluşturduktan sonra üç gün diyabetik fare görüntüleme odasında konumlandırılır. Bir ilk fotoğrafı ve bir ölçü bioluminescence L-012 enjeksiyon önce arka plan sinyal (Şekil 1B) için hesap için alınır. Mayi enjeksiyonu ile L-012 çözüm, fareler odasında konumlandırılır ve bioluminescence nerede ROS algılandığında yara alanlarında görü...

Tartışmalar

ROS ölçmek için ortak teknikleri doku çekme ya da benzer şekilde invaziv teknikler gerektiren karmaşık iletişim kuralları tarafından sınırlı sahip. Son yıllarda, böylece kronolojik zamanmekansal değerlendirmeler^9,10,11izin yenilikçi görüntüleme yöntemleri temelinde ölçümleri oksidatif stres bildirilmiştir. L-012 chemiluminescent bir sonda luminol, lucigenin ve FREDY27^1,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer