אין ויוו הדמיה של מינים חמצן תגובתי ב מאתר פצע מודל

Summary

אנו מתארים יישום לא פולשנית ויוו הדמיה פרוטוקול מאופין בעיצוב חסכוני, ניצול L-012, chemiluminescent הלומינול-אנלוגי, כדי להמחיש ולכמת מינים חמצן תגובתי (ROS) שנוצר במודל של עכברים excisional פצע.

Abstract

הדור של מינים חמצן תגובתי (ROS) מהווה סימן היכר של תהליכים דלקתיים, אך עודף, סטרס חמצוני הוא נרחב בהפרות פתולוגיות שונות כגון סרטן, טרשת עורקים, סכרת. אנחנו בעבר הראו כי תפקוד של הגורם הגרעיני (נגזר erythroid 2)-אוהב 2 (Nrf2) / כמו Kelch erythroid תא, נגזר חלבון 1 (אותו1) איתות לשביל מוביל לחוסר איזון ROS קיצוני במהלך עורית פצע ריפוי סוכרת. מאז רמות ROS הן אינדיקטור חשוב של התקדמות של ריפוי הפצע, כימות ספציפי ומדויק בטכניקות הם בעלי ערך. תוארו מספר במבחנה מבחני למדוד ROS ב תאים ורקמות; עם זאת, הם רק מספקים מידה מצטברות יחיד עבור דגימה. לאחרונה, הפיתוח של מחוונים מבוססי חלבונים ושל שיטות הדמיה אפשרו עבור ניתוחים ייתכן ייחודי. L-012 (C₁₃H₈ClN₄נאו₂) היא נגזרת הלומינול יכול לשמש הן בתוך vivo והן במבחנה chemiluminescent זיהוי של ROS שנוצר על ידי אוקסידאז NAPDH. L-012 פולטת אות חזק יותר מאשר אחרים הגששים פלורסנט, הוכח להיות רגיש וגם אמינה לגילוי ROS. זמן לשגות תחולתה של L-012-ידי הדמיה מספק מידע חשוב אודות תהליכים דלקתיים תוך כדי הקטנת הצורך להקריב, הכולל הפחתת מספר חיות מחקר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ניצול L-012-ידי ויוו הדמיה לכמת סטרס חמצוני במודל של ריפוי הפצע excisional שימוש בעכברים סוכרתיים עם Nrf2 לא מתפקדת באופן מקומי/Keap1.

Introduction

מטבוליטים החמצן שנוצר באמצעות תהליכים דלקתיים לתרום cascades איתות שונים, כמו גם שינוי ההרסני של מרכיבי התא¹. ניצול טכניקות רגישות וספציפיות למדוד ROS חיוני ללמוד תהליכים דלקתיים, אפיון השפעת סטרס חמצוני. דימות in vivo יקר בשל יכולתה לספק נתונים יכולות דינמיות ברקמת החיים. L-012 שווה בדיקה chemiluminescent סינתטי, כי היא רגישה מאוד עבור אניונים סופראוקסיד מייצרת עוצמת אור גבוה יותר מאשר אחרים הגששים פלואורסצנט תאים, רקמות, ו דם^{1,2,3, 4}. זה כבר בהצלחה מועסקים עבור הדמיה ויוו במודלים מאתר ללמוד מספר מחלות דלקתיות, כולל דלקת מפרקים ו קוליטיס^5,6. זה טרם ישתלב פציעה עורית הוקמה ריפוי מודל. מדידה של ROS שנוצר רלוונטי באותה מידה להעריך את ההתקדמות של ריפוי הפצע בתנאים שונים. הרגישות ואת הטבע לא פולשנית של שיטה זו הופכת טכניקה המבטיחים לימוד ריפוי הפצע על פני דגמים מאתר.

Nrf2 הוא מנהל התקן הגדולות של תגובת חמצון, גורם תעתיק עם ירידה לפרטים לרכיב נוגד חמצון תגובה (הם) נפוצה באזורים המקדם של אנזימים נוגדי חמצון מספר⁸. בהיעדרו של סטרס חמצוני, Nrf2 הוא מבודד בציטופלסמה על-ידי Keap1, מה שגורם לאחר מכן שלה ubiquitination והשפלה. חוסר איזון של הנתיב Nrf2/Keap1 היה מעורב חמצון-חיזור בלתי הולם הומאוסטזה ומתת ריפוי הפצע מושהית בסביבה של לחץ חימצוני מוגבר⁹. אנחנו בעבר הראו כי דיכוי Keap1 מעוררת פעילות Nrf2 מוגברת מקדם הצלה של ריפוי פצעים עורית פיפטות ב סוכרת פצעים⁹.

כאן נתאר פרוטוקול אשר מנצל ביולומינסנציה L 012-בסיוע הדמיה כדי למדוד רמות ROS במודל הפצע עורית excisional הריפוי, אשר הוא קריטי עבור הדגשת הקשר בין ROS לבין ריפוי הפצע. טכניקה זו מדגים שינויים בזמן אמת עומס חמצוני בתוך הפצעים ואת הפריפריה הקרובה. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת להערכה מהירה של התערבויות ומנגנונים טיפול חמצון-חיזור זה משפיע. כאן אנו משתמשים מודל של נוקאאוט אותו1 לשיקום חמצון-חיזור הומאוסטזיס כדי להעריך את הישימות של האסטרטגיה שלנו. מכיוון הטכניקה שלנו אינה פולשנית הפצעים הם ללא הפרעה, אותה חיה יכול לשמש עבור נוסף מאשרות ניתוחים על בסיס היסטולוגיה או תא lysates.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של ניו יורק הספר לרפואה של אוניברסיטת. כל העכברים שוכנות מאחורי מחסום, כל אנשי הצוות ללבוש ציוד מגן אישי המתאים.

1. יום 0: הכנת מודל מאתר של ריפוי הפצע Excisional

1. עזים ומתנגד בעכברים סוכרתיים (Lepr^db/db), בגילאי 8-12 שבועות, עם inhalational איזופלוריין 2%. ודא כי כל עכבר יש כבר כראוי ומורדמת באמצעות מבחן קמצוץ כרית כף הרגל. חומר סיכה עינית סטרילי חלות על כל עין כדי למנוע גירוי של יובש. חוקרים פעל על פי הנחיות הצוות הוטרינרי מוסדיים שלהם כאשר מאלחש בעלי החיים באמצעות איזופלוריין.
2. שוקל העכברים ולהקליט את משקל הגוף של כל עכבר. לאשר את מצב הסוכרת של בעלי חיים ע י הקלטת את הגלוקוז בדם של כל בעל חיים באמצעות של סוכר.
3. לחטא סביבת פרוצדורלי וציוד ההרדמה. להסיר שיער הגבי של העכברים באמצעות מכונת תספורת לשיער, ואחריו היישום של קרם להסרת שיער לנגב שיער עודף משם. השתמש מגבונים אלכוהוליים כדי לנקות את העור חשוף, פעמיים, אפשר להתייבש.
4. צור שני פצעים מלא-עובי 10 מ מ, הרחבת דרך carnosus panniculus באמצעות אגרופים ביופסיה סטרילי 10 מ מ לפי פצע excisional ומבוססת ריפוי טכניקה^7,8. השתמש בכפפות סטריליות עבור כל ניתוח הישרדות. אוטוקלב כל מכשירי ניתוח בשקיות לפני הניתוח ופתח רק בתחום כירורגית.
5. סד הפצעים לפתוח באמצעות גיליון סיליקון בעובי 0.5 מ מ עם מגזרות עגול 10 מ מ ולהבטיח סטנטים את המקום באמצעות קטע התפרים משי 4-0.
6. הניתוח שלהלן, חיות להסיר מן ההרדמה ומניחים על חימום pad כדי לאפשר התאוששות נאותה. ראוי לציין, אם טמפרטורת הגוף החי מקטין במהלך ההליך, החיה עשויות להיות מועברות אל משטח חימום מוקדם יותר כדי למזער את איבוד חום הגוף תחת הרדמה. נטר את החיות עד שהם ער, ניידים.
7. לאחר החלימו לחלוטין, לחזור חיות בכלובים בודדים, המכיל מזון ומים (להבטיח שאוכל כמה הוא על רצפת הכלוב העשרה לאחר הניתוח). מספקים מגבות נייר גרוס נוספים חומר קינון עבור 2 שבועות. לא בית חיות אשר עברו ניתוח עם חיות אחרות, כדי למנוע אינטראקציות שליליות ושינויים פצע את מצב ריפוי.
8. לשיכוך כאבים לאחר הניתוח, להזריק עכברים subcutaneously. הבופרנורפין ב 0.1 mg/kg של משקל גוף פעמיים ביום, החל מיד לאחר ההליך, במשך 3 ימים.

2. יום 1: הכנת Keap1 siRNA

הערה: להכין את כל הטיפולים בתוך ארון אבטחה.

1. להכין siRNA דילול על ידי שילוב 37.5 µL של מדיום מופחת סרום עם 12.5 µL של siRNA Keap1 20 מיקרומטר (סיאותו1) (250 pmol) צינור microcentrifuge 1.5 mL על קרח.
2. הכן ליפוזום דילול על ידי שילוב של 25 µL של מדיום מופחת סרום עם 25 µL של ליפוזום לערבב פנימה צינור microcentrifuge 1.5 mL.
3. להוסיף 50 µL של דילול siRNA דילול ליפוזום µL 50 dropwise (כרך 1:1) ומערבבים בעדינות.
4. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
5. מוסיפים 50 µL של 2% methylcellulose ג'ל במים ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
6. מתייחסים כל חיה עם גם שטויות סיאס (בקרה) או סיאותו1 (ניסיוני). הג'ל חלות על החלק העליון של הפצע. לעטוף את פלג הגוף העליון של החיה עם רוטב סרט שקוף כדי לשמור ג'ל במקום, שמירה על הגפיים חינם לשמור על ניידות.

3. יום 3: הכנת פתרון L-012

הערה: להכין כל ריאגנטים ב אבטחה ארון.

1. צינור microcentrifuge 1.5 mL, להכין את L-012 ב- PBS X 1-ריכוז של 0.5 מ"ג/100 מ"ל.
2. באופן ידני מערבולת הצינור microcentrifuge. L-012 לא נמסים לחלוטין לתוך מגניב, אולם צריך להיות מושעים באופן שווה בתוך הנוזל. ראוי לציין, אל תנסו לפזר L-012 במים כדי להימנע מטרידה הפיזיולוגיות אלקטרוליט מאוזן לאחר ההזרקה.
3. להעביר את הפתרון לתוך מזרק 1 מ"ל באמצעות מחט 27 גרם.
   הערה: הקפד על הפתרון L-012 מפני אור.

4. יום 3: In Vivo הדמיה של פצעי סוכרת

1. עזים ומתנגד עכברים עם inhalational איזופלוריין 2%. חוקרים פעל על פי הנחיות הצוות הוטרינרי מוסדיים שלהם כאשר מאלחש בעלי החיים באמצעות איזופלוריין. ודא כי כל עכבר יש כבר כראוי ומורדמת באמצעות מבחן קמצוץ כרית כף הרגל. חומר סיכה עינית סטרילי חלות על כל עין כדי למנוע גירוי של יובש.
2. הסר בעדינות את הרוטב סרט שקוף מן העכברים מבלי להפריע את הפצעים.
3. הצב העכברים בבית הבליעה הדמיה בהזמנות שלהם בהתאמה. כדי לשמור על רמות₂ O נכונה בבית הבליעה, הגדר מהזרימה מערכת הדמיה ואת רמות₂ קאמרית O אינדוקציה 1.0 L/min.
4. תמונה העכברים ביולומינסנציה ואת התמונה בנקודת ההתחלה לפני הזרקת תרכובת L-012.
5. לנגב את הבטן עם מגבונים אלכוהוליים ולאפשר להתייבש. לבצע זריקה בקרום הבטן של הפתרון L-012 ב 5 מ ג 200 גרם משקל הגוף באמצעות מחט 27-מד. לדוגמה, לעכבר השוקל 20 גרם אמור לקבל 0.5 מ ג של L-012.
6. מיד לאחר הזריקה L-012, מקום העכברים בחזרה במקומות המתאימים שלהם בבית הבליעה הדמיה. תמונה העכברים במשך 60 דקות, במשך דקה אחת במרווחים של-4 דקות. הגדר את הפצע. 10-מ מ אזור עניין לקביעת רמת ROS.
7. הניתוח שלהלן, חיות להסיר מן ההרדמה ומניחים על חימום pad כדי לאפשר התאוששות נאותה. נטר את החיות עד שהם ער, ניידים.
8. לאחר החלימו לחלוטין, לחזור חיות בכלובים בודדים, שמירה על הסביבה העשרה שלאחר הניתוח באותו שתואר קודם לכן ב- 1.6. לא בית חיות אשר עברו ניתוח עם חיות אחרות, כדי למנוע אינטראקציות שליליות ושינויים פצע את מצב ריפוי.

תוצאות

שלושה ימים לאחר יצירת פצעים דו צדדיים על פי מודל הפצע excisional הוקמה (איור 1 א'), בעכברים סוכרתיים ממוקמים בבית הבליעה הדמיה. תצלום הראשונית ואת מידת ביולומינסנציה נלקחים לפני הזרקה של L-012 על רקע אות (איור 1B). בעקבות הזרקת בקרום הבטן עם הפתרון L-01...

Discussion

טכניקות נפוצות למדידת ROS מוגבלות פרוטוקולים מורכבים הדורשים שאיבת רקמות או בדומה לכך טכניקות פולשניות. בשנים האחרונות, מדידות של סטרס חמצוני דווחו על בסיס שיטות הדמיה חדשניות, ובכך לאפשר הערכות ייתכן^9,10,11. L-012 יש מספר יתרונות כמו בדיקה chemil...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer