In Vivo Bildgebung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Murine Wunde Modell

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine nicht-invasive in Vivo imaging-Protokoll, das schlanke und kostengünstige, Verwendung von L-012, eine Chemolumineszenz Luminol-Analog, zu visualisieren und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzielte eine excisional Wunde Mausmodell zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Die Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist ein Markenzeichen von entzündlichen Prozessen, aber im Übermaß, oxidativer Stress ist weit verbreitet in verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose und Diabetes beteiligt. Wir haben zuvor gezeigt, dass Dysfunktion des nuklearen Faktors (2 erythroiden abgeleitet)-wie 2 (Nrf2) / Kelch-ähnliche erythroiden Zelle abgeleitete Protein 1 (Keap-1) Signalisierung Weg führt zu extremen ROS Ungleichgewicht bei kutanen Wundheilung bei Diabetes. Da ROS Ebenen ein wichtiger Indikator für den Verlauf sind der Wundheilung, sind spezifische und genaue Quantifizierung Techniken wertvoll. Mehrere in-vitro- Tests, ROS in Zellen und Geweben zu messen sind beschrieben worden; Sie liefern jedoch nur eine kumulative Einzelmessung pro Probe. Vor kurzem haben die Entwicklung von Protein-basierten Indikatoren und bildgebender Verfahren für einzigartige räumlich-zeitliche Analysen erlaubt. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂) ist ein Luminol-Derivat, das für in Vivo und in Vitro Chemolumineszenz verwendet werden kann Erkennung von ROS von NAPDH Oxidase generiert. L-012 strahlt ein stärkeres Signal als andere fluoreszierenden Sonden und hat gezeigt, dass sowohl empfindlich und zuverlässig für die Erkennung von ROS. Die Zeit verfallen Anwendbarkeit des L-012-erleichtert Imaging liefert wertvolle Informationen über entzündliche Prozesse reduzieren die Notwendigkeit für Opfer und insgesamt senken die Zahl der Studie Tiere. Hier beschreiben wir ein Protokoll, die Verwendung von L-012-erleichtert, in Vivo imaging um zu oxidativen Stress in einem Modell der excisional Wundheilung mit diabetischen Mäusen mit lokal dysfunktionalen Nrf2/Keap1 zu quantifizieren.

Einleitung

Sauerstoff-Metabolite erzeugt durch entzündliche Prozesse tragen zu verschiedenen Signalisierung Kaskaden sowie destruktiven Änderung der zellulären Komponenten¹. Sensitiver und spezifischer Techniken zur Messung der ROS ist entscheidend für entzündliche Prozesse zu studieren und zu charakterisieren die Effekte von oxidativem Stress. In-Vivo Bildgebung ist wertvoll wegen seiner Fähigkeit, dynamische räumliche und zeitliche Angaben im lebenden Gewebe. L-012 ist eine synthetische Chemilumineszenz-Sonde, die ist sehr empfindlich für Superoxid-Anionen und erzeugt eine höhere Lichtintensität als andere fluoreszierenden Sonden in Zellen, Geweben und Vollblut^{1,2,3, 4}. es hat mehrere entzündliche Erkrankungen, wie Arthritis und Kolitis^5,6studieren erfolgreich für die in-Vivo Bildgebung in murinen Modellen eingesetzt. Es ist noch nicht in einer etablierten kutanen Wundheilung Modell eingesetzt werden. Messung von ROS erzeugt ist ebenso relevant für den Verlauf der Wundheilung unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Die Empfindlichkeit und die nicht-invasive Natur dieser Methode macht es eine vielversprechende Technik für Wundheilung in murinen Modellen zu studieren.

Nrf2 ist eine wichtige Triebfeder der antioxidativen Reaktion und ein transcriptional Faktor mit Spezifität für die Antioxidant Response-Element (sind) für den Projektträger Regionen mehrere antioxidative Enzyme⁸. In Ermangelung von oxidativem Stress ist Nrf2 im Zytoplasma von Keap1, abgesondert, wodurch anschließend seine Ubiquitination und Abbau. Ungleichgewicht des Nrf2/Keap1-Signalwegs hat in ungeeigneten Redox-Homöostase und verzögerte Wundheilung in der Umgebung von erhöhtem oxidativen Stress⁹verwickelt. Wir haben bereits gezeigt, dass die Unterdrückung der Keap1 erhöhten Nrf2-Aktivität anregt und fördert Rettung der pathologischen kutanen Wundheilung in diabetischen Wunden⁹.

Hier beschreiben wir eine Protokoll, die nutzt L-012-gestützte Biolumineszenz imaging um zu ROS Ebenen in einem excisional kutanen Wunde heilende Modell zu messen, die kritisch für die Hervorhebung der Assoziation zwischen ROS und Wundheilung ist. Diese Technik zeigt Änderungen in Echtzeit oxidativen Belastung innerhalb von Wunden und unmittelbaren Peripherie. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode zur schnellen Beurteilung der Interventionen und Mechanismen dieser Affekt Redox Handhabung. Hier verwenden wir ein Modell des Keap1 Zuschlag für die Wiederherstellung des Redox-Homöostase, um die Anwendbarkeit unserer Strategie zu bewerten. Da unsere Technik nicht-invasiv ist und Wunden ungestört sind, kann das gleiche Tier für weitere bestätigende Analysen auf der Grundlage der Histologie oder Zelle Lysates verwendet werden.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der New York University School of Medicine genehmigt. Alle Mäuse sind hinter einer Schranke untergebracht und alle Mitarbeiter tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung.

1. Tag 0: Vorbereitung der Mausmodell der Excisional Wundheilung

1. Diabetiker (Lepr^Db/Db) Mäuse, im Alter von 8 – 12 Wochen, mit inhalativer 2 % Isofluran zu betäuben. Bestätigen Sie, dass jede Maus hat richtig betäubt worden mit dem Fuß Pad Pinch-Test. Gelten Sie okuläre steriles Gleitmittel für jedes Auge, Reizung von Trockenheit zu verhindern. Forscher sollten ihre institutionellen Tierärzten Richtlinien befolgen, wenn Tiere mit Isofluran zu betäuben.
2. Wiegen Sie die Mäuse und zeichnen Sie das Körpergewicht des jede Maus auf. Bestätigen Sie den diabetischen Status der Tiere durch die Aufnahme des Blutzuckers jedes Tieres mit einem Blutzuckermessgerät.
3. Prozedurale Arbeitsbereich und Anästhesie Ausrüstung zu desinfizieren. Entfernen Sie dorsalen Haare der Mäuse mit einem Haarschneidegerät gefolgt von der Anwendung von Haarwasser entfernen, entfernt überschüssige Haare zu wischen. Verwenden Sie Alkoholtupfer, um die Haut zweimal reinigen und trocknen lassen.
4. Erstellen Sie zwei 10 mm voll-dicke Wunden, die sich durch die Verwendung von sterilen 10 mm Biopsie Schläge nach einem etablierten excisional Wundheilung Technik^7,8Panniculus Carnosus. Verwenden Sie sterile Handschuhe für alle überleben Chirurgie. Autoklav alle chirurgischen Instrumente in Säcken vor der Operation und nur in das OP-Feld öffnen.
5. Schiene die Wunden öffnen Sie mit einem 0,5 mm dicken Silikon-Blatt mit 10 mm kreisförmigen Ausschnitte und sichern die Stents im Ort mit unterbrochen seidene Fäden 4-0.
6. Nach der Operation, Tiere aus der Narkose zu entfernen und auf Heizkissen um ordnungsgemäße Verwertung zu erleichtern. Der Hinweis tierische Körpertemperatur sinkt während des Verfahrens kann das Tier in das Heizkissen früher verschoben werden Körper Wärmeverlust unter Narkose zu minimieren. Überwachen Sie die Tiere, bis sie wach und mobil sind.
7. Einmal vollständig erholt, wieder Tiere zu einzelnen Käfigen, mit Nahrung und Wasser (stellen Sie sicher, dass etwas zu Essen auf dem Boden des Käfigs für postoperative Bereicherung ist). Handtücher Papierschnitzel als zusätzliche Nistmaterial für 2 Wochen. Tiere, die mit anderen Tieren, um unerwünschte Interaktionen und Änderungen an heilenden Status Wunde zu verhindern operiert wurden nicht Haus.
8. Injizieren Sie für postoperative Schmerzlinderung Mäusen subkutan mit Buprenorphin bei 0,1 mg/kg Körpergewicht zweimal täglich ab sofort nach dem Verfahren, für 3 Tage.

2. Tag 1: Vorbereitung der Keap1 siRNA

Hinweis: Bereiten Sie alle Behandlungen innerhalb eines Biosafety Kabinett.

1. Bereiten Sie SiRNA Verdünnung durch die Kombination von 37,5 µL reduzierte Serum-Medium mit 12,5 µL von 20 µM Keap1 SiRNA (SiKeap1) (250 Pmol) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis.
2. Bereiten Sie Liposomen-Verdünnung durch die Kombination von 25 µL reduzierte Serum Medium mit 25 µL Liposomen-Mix in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch vor.
3. 50 µL Liposomen Verdünnung tropfenweise (1:1-Volume) 50 µL der SiRNA Verdünnung hinzu, und mischen Sie vorsichtig.
4. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
5. 50 µL 2 % Methylcellulose Gel in Wasser hinzufügen und Mischen von Pipettieren rauf und runter.
6. Jedes Tier mit entweder ein Unsinn SiNS (Kontrolle) zu behandeln oder SiKeap1 (experimentell). Tragen Sie das Gel an die Spitze der Wunde. Wickeln Sie das Tier Torso mit Klarsichtfolie Dressing, Gel, beizubehalten halten die Gliedmaßen frei, um die Beweglichkeit zu erhalten.

3. Tag 3: Vorbereitung der L-012 Lösung

Hinweis: Bereiten Sie alle Reagenzien in eine biologische Kabinett.

1. Bereiten Sie in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch L-012 mit 1 X PBS-Puffer in einer Konzentration von 0,5 mg/100 mL.
2. Manuell den Microcentrifuge Schlauch Wirbel. Die L-012 löst vollständig in die PBS, sich nicht aber es gleichmäßig in der Flüssigkeit ausgesetzt werden sollte. Beachten ist versuchen Sie nicht, L-012 in Wasser zur Vermeidung von störenden physiologische Elektrolythaushalt nach der Injektion zu lösen.
3. Übertragen Sie die Lösung in eine 1 mL Spritze mit einer Nadel 27 G.
   Hinweis: Achten Sie darauf, die L-012 Lösung vor Licht zu schützen.

4. Tag 3: In-Vivo Bildgebung diabetische Wunden

1. Mäuse mit inhalativer 2 % Isofluran zu betäuben. Forscher sollten ihre institutionellen Tierärzten Richtlinien befolgen, wenn Tiere mit Isofluran zu betäuben. Bestätigen Sie, dass jede Maus hat richtig betäubt worden mit dem Fuß Pad Pinch-Test. Gelten Sie okuläre steriles Gleitmittel für jedes Auge, Reizung von Trockenheit zu verhindern.
2. Entfernen Sie vorsichtig die Klarsichtfolie Dressing von den Mäusen ohne zu stören die Wunden.
3. Legen Sie die Mäuse in der bildgebenden Kammer in ihrer jeweiligen Bestellungen. Um richtige O₂ Ebenen in der Kammer zu halten, imaging System-Zufluss und Induktion Kammer O₂ Ebenen bis 1,0 L/min eingestellt.
4. Bild die Mäuse für die Biolumineszenz und Foto bei Studienbeginn vor der Injektion der L-012 Verbindung.
5. Den Bauch mit Alkoholtupfer abwischen und trocknen lassen. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion der L-012 Lösung auf 5 mg pro 200 g Körpergewicht mit einer 27-Gauge-Nadel. Beispielsweise sollte eine Maus mit einem Gewicht von 20 g 0,5 mg des L-012 erhalten.
6. Unmittelbar nach der Injektion L-012 legen die Mäuse wieder an den jeweiligen Standorten in der bildgebenden Kammer. Bild der Mäuse im Laufe von 60 Minuten, 1 Minute im 4-Minuten-Takt. Definieren Sie die 10-mm-Wunde als die Region von Interesse für die Bemessung von ROS.
7. Nach der Operation, Tiere aus der Narkose zu entfernen und auf Heizkissen um ordnungsgemäße Verwertung zu erleichtern. Überwachen Sie die Tiere, bis sie wach und mobil sind.
8. Einmal vollständig erholt, wieder Tiere in einzelne Käfige, die gleichen postoperativen Bereicherung Umwelt zuvor in 1.6 beschrieben. Tiere, die mit anderen Tieren, um unerwünschte Interaktionen und Änderungen an heilenden Status Wunde zu verhindern operiert wurden nicht Haus.

Ergebnisse

In der bildgebenden Kammer befinden sich drei Tage nach dem Erstellen der bilateralen Wunden nach einem etablierten excisional Wunde Modell (Abbildung 1A), diabetische Mäusen. Eine erste Foto und ein Maß für die Biolumineszenz sind vor der Injektion des L-012 ergriffen, um Hintergrundsignal (Abbildung 1 b) zu berücksichtigen. Nach intraperitonealer Injektion mit der L-012-Lösung, die Mäuse werden neu positioniert, in der Ka...

Diskussion

Gängige Techniken zur Messung von ROS haben durch komplexe Protokolle erfordern Gewebe Extraktion oder ähnlich invasive Techniken beschränkt wurde. In den letzten Jahren wurden Messungen von oxidativem Stress auf der Grundlage innovativer bildgebender Verfahren, wodurch für räumlich-zeitliche Einschätzungen^9,10,11beschrieben. L-012 hat mehrere Vorteile als Chemilumineszenz Sonde relativ Luminol, Lucigenin und MCLA

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer