Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

Resumo

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Resumo

A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é uma característica dos processos inflamatórios, mas em excesso, estresse oxidativo é amplamente envolvido em várias patologias como câncer, aterosclerose e diabetes. Mostramos anteriormente que a disfunção do fator Nuclear (eritroide-derivado 2)-tipo 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como derivado de células proteína 1 (Keap1) sinalização percurso leva ao extremo desequilíbrio ROS durante cutânea cicatrização em diabetes. Desde que os níveis ROS são um importante indicador da progressão da cicatrização, técnicas de quantificação específica e precisos são valiosas. Têm sido descritos vários ensaios em vitro para medir ROS em células e tecidos; no entanto, eles apenas fornecem uma única medida cumulativa por amostra. Mais recentemente, o desenvolvimento de indicadores baseados em proteína e as modalidades de imagem permitiram análises spatiotemporal exclusivas. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂) é um derivado de luminol que pode ser usado tanto em vivo e em vitro quimioluminescente deteção de ROS gerado pelo oxidase NAPDH. L-012 emite um sinal mais forte do que outras sondas fluorescentes e tem se mostrado sensível e confiável para a detecção de ROS. A aplicabilidade de lapso de tempo de L-012-facilitou a imagem fornece informações valiosas sobre processos inflamatórios, reduzindo a necessidade de sacrifício e globalmente, reduzindo o número de animais de estudo. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando L-012-facilitado na vivo por imagens para quantificar o estresse oxidativo em um modelo de cicatrização de feridas excisional usando ratos diabéticos com localmente disfuncional Nrf2/Keap1.

Introdução

Metabólitos de oxigênio gerados através de processos inflamatórios contribuam para diversas cascatas de sinalização, bem como alteração destrutiva de componentes celulares¹. Utilizando técnicas sensíveis e específicas para medir ROS é crítico para estudar processos inflamatórios e caracterizar os efeitos do estresse oxidativo. Imagem latente na vivo é valioso devido à sua capacidade para fornecer dados de dinâmicos espaciais e temporais em tecido vivo. L-012 é uma sonda quimioluminescente sintética que é altamente sensível para ânions superóxido e produz uma intensidade de luz mais elevada do que outras sondas fluorescentes em células, tecidos e sangue total^{1,2,3, 4}. tem sido empregado com sucesso para a imagem latente na vivo em modelos murino para estudar várias doenças inflamatórias, incluindo artrite e colite^5,6. Ainda tem que ser empregado numa ferida cutânea estabelecida modelo de cura. Medição de ROS gerado é igualmente relevante para avaliar a progressão da cicatrização de feridas em condições diferentes. A sensibilidade e a natureza não-invasiva deste método torna uma técnica promissora para estudar a cicatrização de feridas em modelos murino.

Nrf2 é um grande condutor da resposta antioxidante e um fator transcricional com especificidade para o elemento de resposta antioxidante (são) comum às regiões promotor de várias enzimas de antioxidante⁸. Na ausência de estresse oxidativo, Nrf2 é sequestrado no citoplasma por Keap1, que posteriormente provoca sua ubiquitination e degradação. Desequilíbrio da via Nrf2/Keap1 tem sido implicado na homeostase redox inapropriado e posterior cicatrização no cenário de maior estresse oxidativo⁹. Anteriormente mostramos que a supressão de Keap1 estimula o aumento da atividade Nrf2 e promove resgate da cicatrização de feridas cutâneas patológica no diabético feridas⁹.

Aqui descrevemos um protocolo que utiliza bioluminescência L-012-assistida de imagem para medir os níveis ROS em um modelo de cura ferida cutânea excisional, que é fundamental para destacar a associação entre ROS e cicatrização de feridas. Esta técnica demonstra alterações em tempo real em carga oxidativa dentro feridas e periferia imediata. Além disso, este método permite rápida avaliação de intervenções e mecanismos de manipulação de redox que afetam. Aqui usamos um modelo de Keap1 nocaute para a restauração da homeostase redox para avaliar a aplicabilidade da nossa estratégia. Porque nossa técnica é não-invasivo e feridas são imperturbadas, o mesmo animal pode ser usado para mais confirmação análises com base em lysates histologia ou célula.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da New York University School of Medicine. Todos os ratos estão alojados atrás de uma barreira e todo o pessoal usa equipamento de protecção adequado.

1. dia 0: Preparação do modelo murino de cicatrização Excisional

1. Anestesia o diabéticos ratos (Lepr^db/db), com idades entre 8 a 12 semanas, com isoflurano inalatório de 2%. Confirme que cada rato tem sido devidamente anestesiado utilizando o teste do beliscão pé almofada. Aplique lubrificante ocular esterilizada para cada olho para evitar a irritação do ressecamento. Pesquisadores devem seguir as orientações do seu pessoal veterinário institucional ao anestesiar animais utilizando isoflurano.
2. Pesar os ratos e registar o peso corporal de cada rato. Confirme o estado diabético de animais gravando a glicose no sangue de cada animal utilizando um glicosímetro.
3. Desinfecte o equipamento de anestesia e espaço de trabalho processual. Remover os pelos dorsais dos ratos usando uma máquina de cortar cabelo, seguido pela aplicação de loção de cabelo remoção limpe o excesso de pelos fora. Utilize toalhetes com álcool para limpar a pele exposta, duas vezes e deixe para secar.
4. Crie duas feridas de espessura total de 10 mm estendendo-se através da carnosus panículo usando socos de biópsia estéril de 10 mm de acordo com uma ferida excisional bem-estabelecida cura técnica^7,8. Use luvas estéreis para todas as cirurgias de sobrevivência. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos em sacos antes da cirurgia e aberto apenas no campo cirúrgico.
5. As feridas abrir usando uma folha de silicone grossa de 0,5 mm com recortes circulares de 10 mm e fixe os stents no lugar usando o splint interrompido suturas de seda 4-0.
6. Seguir cirurgia, remover os animais da anestesia e coloque no aquecimento pad para facilitar a recuperação adequada. Digno de nota, se a temperatura do corpo do animal diminui durante o procedimento, o animal pode ser transportado para a almofada de aquecimento mais cedo para minimizar a perda de calor do corpo sob anestesia. Monitore os animais até que estejam acordados e móveis.
7. Depois de totalmente recuperado, volte os animais para gaiolas individuais, contendo alimentos e água (certifique-se de que comida está no chão da gaiola para enriquecimento no pós-operatório). Fornece toalhas de papel picado adicional material de nidificação por 2 semanas. Não faz casa animais que se submeteram à cirurgia com outros animais, para evitar interações adversas e alterações de status de cura de feridas.
8. Para alívio da dor pós-operatória, injete ratos por via subcutânea com buprenorfina em 0,1 mg/kg de peso corporal duas vezes por dia, começando imediatamente após o procedimento, durante 3 dias.

2. dia 1: Preparação de siRNA Keap1

Nota: Prepare todos os tratamentos dentro de um armário de biossegurança.

1. Prepare-se diluição de siRNA combinando 37,5 µ l de meio de soro reduzida com 12,5 µ l de 20 µM Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL no gelo.
2. Prepare a diluição de lipossoma combinando 25 µ l de meio de soro reduzida com 25 µ l de mistura de lipossomas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
3. Adicionar 50 µ l da diluição de siRNA para 50 µ l lipossoma diluição gota a gota (volume de 1:1) e misture suavemente.
4. Incube durante 20 minutos em temperatura ambiente.
5. Adicionar 50 µ l de gel de metilcelulose 2% em água e misture suavemente pipetando para cima e para baixo.
6. Tratar cada animal com um si de bobagemNS (controle) ou siKeap1 (experimental). Aplique o gel para o topo da ferida. Envolva o tronco do animal com curativo de filme transparente para manter o gel no local, mantendo os membros livres para manter a mobilidade.

3. dia 3: Preparação da solução L-012

Nota: Prepare todos os reagentes em um armário de biossegurança.

1. Em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga, prepare L-012 em 1X PBS numa concentração de 0,5 mg/100 mL.
2. Manualmente o vórtice do tubo de microcentrifugadora. O L-012 não completamente se dissolve na PBS, porém deve ser uniformemente suspensa no líquido. Digno de nota, não tente dissolver L-012 na água para evitar perturbador fisiológica de eletrólitos depois da injeção.
3. Transferi a solução para uma seringa de 1 mL, utilizando uma agulha de 27G.
   Nota: Certifique-se de proteger a solução de L-012 de luz.

4. dia 3: In Vivo Imaging de feridas diabéticas

1. ANESTHETIZE ratos com isoflurano inalatório de 2%. Pesquisadores devem seguir as orientações do seu pessoal veterinário institucional ao anestesiar animais utilizando isoflurano. Confirme que cada rato tem sido devidamente anestesiado utilizando o teste do beliscão pé almofada. Aplique lubrificante ocular esterilizada para cada olho para evitar a irritação do ressecamento.
2. Suavemente retire o curativo de filme transparente os ratos sem perturbar as feridas.
3. Coloque os ratos no hemiciclo de imagens em seus respectivos pedidos. Para manter níveis adequados de₂ O na câmara, defina a entrada de sistema de imagem e os níveis de₂ indução câmara O a 1,0 L/min.
4. Os ratos de bioluminescência e fotografia na linha de base antes da injeção do composto L-012 da imagem.
5. Limpe o abdômen com toalhetes com álcool e deixe para secar. Realize uma injeção intraperitoneal da solução de L-012 de 5 mg por peso de 200 g, utilizando uma agulha de calibre 27. Por exemplo, um mouse com 20 g deve receber 0,5 mg de L-012.
6. Imediatamente após a injeção de L-012, coloque os ratos em seus respectivos locais na câmara de imagens. Os ratos da imagem ao longo de 60 minutos, durante 1 minuto com intervalos de 4 minutos. Defina a ferida de 10 mm como a região de interesse para a determinação do nível de ROS.
7. Seguir cirurgia, remover os animais da anestesia e coloque no aquecimento pad para facilitar a recuperação adequada. Monitore os animais até que estejam acordados e móveis.
8. Depois de totalmente recuperado, volte os animais para gaiolas individuais, mantendo o mesmo ambiente de enriquecimento pós-operatória descrito anteriormente no 1.6. Não faz casa animais que se submeteram à cirurgia com outros animais, para evitar interações adversas e alterações de status de cura de feridas.

Resultados

Três dias depois de criar feridas bilaterais de acordo com um modelo estabelecido ferida excisional (figura 1A), ratos diabéticos estão posicionados na câmara de imagens. Uma fotografia inicial e uma medida de bioluminescência são tomadas antes da injeção de L-012 a conta para o sinal de fundo (figura 1B). Após injeção intraperitoneal com a solução de L-012, os ratos são reposicionados na câmara e bioluminescência...

Discussão

Técnicas comuns de medição ROS tem sido limitadas pela protocolos complexos que requerem a extração do tecido ou da mesma forma técnicas invasivas. Nos últimos anos, as medidas de estresse oxidativo têm sido relatadas com base nas modalidades de imagem inovadoras, permitindo assim que para avaliações spatiotemporal^9,10,11. L-012 tem várias vantagens, como uma sonda quimioluminescente relativo MCLA¹

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer