In Vivo Imagerie des espèces réactives de l’oxygène dans un murin plaie modèle

Résumé

Nous décrivons une non invasif en vivo imagerie protocole c’est facile et économique, utilisant L-012, un analogue de luminol chimiluminescence, de visualiser et de quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) générés dans un modèle murin excisionnelle enroulé.

Résumé

La génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est une caractéristique des processus inflammatoires, mais en excès, stress oxydatif est largement impliqué dans diverses pathologies comme le cancer, l’athérosclérose et le diabète. Nous avons déjà montré que la dysfonction du facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes)-comme 2 (Nrf2) / érythroïdes Kelch-comme culture cellulaire protéines 1 (Keap1) signalisation voie conduit à extrême déséquilibre ROS lors cutanée la cicatrisation chez les diabétiques. Étant donné que les niveaux ROS sont un indicateur important de la progression de la cicatrisation des plaies, des techniques de quantification précises et exactes sont précieux. Plusieurs essais in vitro pour mesurer des ROS dans les cellules et les tissus ont été décrites ; Toutefois, ils fournissent uniquement une seule mesure cumulative par échantillon. Plus récemment, ont permis le développement d’indicateurs de base de protéines et de modalités d’imagerie unique analyse spatio-temporelle. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂) est un dérivé de luminol qui peut servir à la fois in vivo et in vitro par chimiluminescence détection de ROS générées par l’oxydase de NADPH. L-012 émet un signal plus fort que les autres sondes fluorescentes et s’est avéré être sensible et fiable pour la détection de ROS. L’applicabilité de laps de temps de L-012-facilité d’imagerie fournit des renseignements précieux sur les processus inflammatoires tout en réduisant la nécessité pour le sacrifice et dans l’ensemble le nombre d’animaux de l’étude. Nous décrivons ici un protocole utilisant L-012-facilité in vivo d’imagerie afin de quantifier le stress oxydatif dans un modèle de cicatrisation excisionnelle utilisant des souris diabétiques avec localement dysfonctionnel Nrf2/Keap1.

Introduction

Métabolites d’oxygène générés par le biais de processus inflammatoires contribuent à différentes cascades de signalisation ainsi qu’altération destructive des composants cellulaires¹. Utilisant des techniques sensibles et spécifiques pour mesurer le ROS est essentiel pour l’étude des processus inflammatoires et de caractériser les effets du stress oxydatif. L’imagerie in vivo est précieux en raison de sa capacité à fournir des données dynamiques spatiales et temporelles dans les tissus vivants. L-012 est une sonde chimioluminescente synthétique qui est hautement sensible pour les anions superoxydes et produit une intensité lumineuse plus élevée que les autres sondes fluorescentes dans les cellules, de tissus et de sang total^{1,2,3, 4}. il a été avec succès employé pour l’imagerie in vivo dans des modèles murins pour étudier plusieurs maladies inflammatoires, y compris l’arthrite et la colite^5,6. Il n’a pas encore devant être utilisés dans une modèle de cicatrisation cutanée établie. Mesure de ROS généré est également pertinent évaluer la progression de la cicatrisation des plaies dans des conditions différentes. La sensibilité et le caractère non invasif de cette méthode en fait une technique prometteuse pour étudier la cicatrisation dans les modèles murins.

Nrf2 est un facteur déterminant de la réponse de l’antioxydant et un facteur de transcription avec une spécificité pour l’élément de réponse antioxydante (ARE) commun pour les régions promotrices de plusieurs d’enzymes antioxydantes⁸. En l’absence de stress oxydatif, Nrf2 est séquestré dans le cytoplasme par Keap1, ce qui provoque par la suite son ubiquitination et la dégradation. Déséquilibre de la voie Nrf2/Keap1 a été impliquée dans l’homéostasie redox inapproprié et cicatrisation retardée dans le cadre d’une augmentation du stress oxydatif,⁹. Nous avons déjà montré que la suppression de Keap1 stimule l’augmentation de l’activité Nrf2 et favorise des plaies de sauvetage de la guérison des plaies cutanées pathologiques chez les diabétiques⁹.

Nous décrivons ici un protocole qui utilise L-012 a contribué bioluminescence d’imagerie pour mesurer les concentrations ROS dans un modèle de guérison excisionnelle plaie cutanée, ce qui est essentiel pour mettre en évidence l’association entre les BR et la cicatrisation des plaies. Cette technique montre des changements en temps réel fardeau oxydant dans les plaies et de la périphérie immédiate. En outre, cette méthode permet pour une évaluation rapide des interventions et des mécanismes de cette manipulation de redox affect. Ici, nous utilisons un modèle de knockdown Keap1 pour la restauration de l’homéostasie redox pour évaluer l’applicabilité de notre stratégie. Parce que notre technique est non invasive et blessures sont intacts, le même animal peut être utilisé pour approfondir les analyses confirmatoires sur la base de lysats histologie ou de la cellule.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de New York University School of Medicine. Toutes les souris sont logés derrière une barrière et tout le personnel de porte un équipement de protection individuelle approprié.

1. jour 0 : La préparation d’un modèle murin de cicatrisation excisionnelle

1. Anesthésier les souris diabétiques de (Lepr^db/db), âgés de 8 à 12 semaines, à l’inhalation isoflurane de 2 %. Confirmer que chaque souris a été correctement anesthésiés en utilisant le test du pincement pad pied. Appliquer un lubrifiant oculaire stérile à chaque œil pour éviter les irritations de la sécheresse. Chercheurs devraient suivre les directives de leur personnel vétérinaire institutionnels lorsque anesthésier les animaux l’isoflurane.
2. Pesez les souris et consignez le poids corporel de chaque souris. Confirmer l’état diabétique des animaux en enregistrant le glucose dans le sang de chaque animal à l’aide d’un glucomètre.
3. Une désinfection procédure équipement workspace et anesthésie. Enlever les poils dorsaux des souris à l’aide d’une tondeuse à cheveux, suivi par l’application de la lotion d’enlèvement de cheveux pour essuyer les cheveux trop loin. Utilisez des lingettes d’alcool pour nettoyer la peau exposée, deux fois et laisser pour sécher.
4. Créer deux plaies de pleine épaisseur 10 mm, qui s’étend à travers la panniculus carnosus à l’aide de poinçons de biopsie stérile 10 mm selon un technique^7,8cicatrisation excisionnelle bien établi. Utiliser des gants stériles pour la chirurgie de survie tous. Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans des sacs avant chirurgie et ouvert que dans le champ opératoire.
5. Les plaies ouverte à l’aide d’une feuille de silicone épaisseur 0,5 mm avec découpes circulaires de 10 mm et fixer les stents en place à l’aide de l’attelle interrompu sutures soie 4-0.
6. Après une chirurgie, exclure les animaux de l’anesthésie et placer sur le coussin pour faciliter la récupération correcte chauffant. À noter, si la température de corps animal diminue au cours de la procédure, l’animal peut-être être déplacé pour le coussin chauffant plus tôt afin de minimiser la perte de chaleur corporelle sous anesthésie. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu’ils sont éveillés et mobiles.
7. Une fois complètement rétabli, revenir animaux en cages individuelles, contenant de nourriture et eau (s’assurer que de la nourriture est sur le plancher de la cage pour l’enrichissement post-opératoire). Fournir des serviettes de papier déchiqueté d’autres matériaux de nidification pendant 2 semaines. Maison pas les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale avec d’autres animaux, afin d’éviter des interactions indésirables et les modifications de statut guérison de blessure.
8. Pour soulager la douleur postopératoire, injecter des souris par voie sous-cutanée avec la buprénorphine à 0,1 mg/kg de poids corporel deux fois par jour, commençant immédiatement après la procédure, pendant 3 jours.

2. jour 1 : Préparation du siRNA Keap1

NOTE : Préparer tous les traitements à l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique.

1. Préparer la dilution de siARN en combinant 37,5 µL de milieu de sérum réduit avec 12,5 µL de 20 µM Keap1 siARN (siKeap1) (250 pmol) dans un tube de microtubes de 1,5 mL sur la glace.
2. Préparer la dilution de liposome en combinant 25 µL de milieu de sérum réduit à 25 µL du mélange de liposome dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
3. Ajouter 50 µL de la dilution de siARN dans 50 µL liposome dilution goutte à goutte (volume 1:1) et mélanger doucement.
4. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
5. Ajouter 50 µL de gel de méthylcellulose 2 % dans l’eau et mélanger doucement en pipettant également de haut en bas.
6. Traiter chaque animal avec soit un is de non-sensNS (contrôle) ou TRKeap1 (expérimental). Appliquez le gel sur la partie supérieure de la plaie. Enrouler du torse de l’animal avec la vinaigrette de film transparent pour garder le gel en place, maintenir les membres libres de maintenir la mobilité.

3. jour 3 : Préparation de la Solution L-012

NOTE : Préparer tous les réactifs dans une coffret de biosécurité.

1. Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, préparer L-012 dans 1 X PBS à une concentration de 0,5 mg/100 mL.
2. Manuellement le tube de microcentrifuge vortex. Le L-012 ne pas complètement se dissout dans le PBS, mais il devrait être suspendu uniformément dans le liquide. À noter, ne pas tenter de dissoudre L-012 dans l’eau pour éviter l’inquiétante équilibre physiologique électrolyte après injection.
3. Transvaser la solution dans une seringue de 1 mL à l’aide d’une aiguille de 27 G.
   Remarque : Veillez à protéger la solution de L-012 de lumière.

4. jour 3 : In Vivo imagerie des plaies diabétiques

1. Anesthésier la souris à l’isoflurane par inhalation de 2 %. Chercheurs devraient suivre les directives de leur personnel vétérinaire institutionnels lorsque anesthésier les animaux l’isoflurane. Confirmer que chaque souris a été correctement anesthésiés en utilisant le test du pincement pad pied. Appliquer un lubrifiant oculaire stérile à chaque œil pour éviter les irritations de la sécheresse.
2. Retirez délicatement le pansement transparent film des souris sans déranger les blessures.
3. Placez les souris dans la chambre d’imagerie dans leurs ordres respectifs. Pour maintenir des niveaux de₂ O appropriés dans la chambre, définir l’entrée de système d’imagerie et les niveaux de₂ chambre O induction à 1,0 L/min.
4. Les souris pour bioluminescence et photographie au départ avant injection de L-012 composé de l’image.
5. Essuyez l’abdomen avec des lingettes d’alcool et laisser pour sécher. Effectuer une injection intrapéritonéale de la solution de L-012 à 5 mg par poids de 200 g à l’aide d’une aiguille de calibre 27. Par exemple, une souris pesant 20 g devraient recevoir 0,5 mg de L-012.
6. Immédiatement après l’injection de L-012, replacez les souris dans leur emplacement respectif dans la salle d’imagerie. L’image des souris au cours de 60 minutes, pendant 1 minute à intervalles de 4 minutes. Définir la plaie 10 mm dans la région d’intérêt pour déterminer le niveau de ROS.
7. Après une chirurgie, exclure les animaux de l’anesthésie et placer sur le coussin pour faciliter la récupération correcte chauffant. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu’ils sont éveillés et mobiles.
8. Une fois complètement rétabli, revenir animaux en cages individuelles, maintenance de l’environnement d’enrichissement post-opératoire même décrit précédemment au point 1.6. Maison pas les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale avec d’autres animaux, afin d’éviter des interactions indésirables et les modifications de statut guérison de blessure.

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Résultats

Trois jours après la création des plaies bilatéraux selon un modèle établi plaie excisionnelle (Figure 1 a), les souris diabétiques sont placés dans la salle d’imagerie. Une photographie initiale et une mesure de bioluminescence sont prises avant l’injection de L-012 pour tenir compte des signaux de fond (Figure 1 b). Suite à une injection intrapéritonéale avec la solution de L-012, les souris sont repositionnés da...

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Discussion

Les techniques courantes de mesure de ROS ont été limités par des protocoles complexes nécessitant une extraction de tissu ou de la même façon des techniques invasives. Ces dernières années, les mesures du stress oxydatif ont été signalés sur la base de modalités d’imagerie innovantes, permettant ainsi à des évaluations spatio-temporelles^9,10,11. L-012 présente plusieurs avantages comme une sonde chimioluminesce...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer