В естественных условиях Визуализация реактивнооксигенных видов мышиных раны модель

Резюме

Мы описываем неинвазивные в vivo imaging протокол, рационального и экономически эффективным, используя L-012, хемилюминесцентный люминол аналоговый, визуализировать и количественно реактивнооксигенных видов (ров) сгенерирована модель мыши эксцизионная раны.

Аннотация

Поколение реактивнооксигенных видов (ров) является отличительной чертой воспалительных процессов, но в избытке, оксидативный стресс широко вовлечено в различных патологий, таких как рак, атеросклерозом и диабетом. Ранее мы показали, что дисфункция ядерного фактора (эритроидные производные 2)-как 2 (Nrf2) / Кельха как эритроидные клетки производные протеин 1 (1Keap) сигнальный путь ведет к крайней ROS дисбаланс во время кожный заживление ран при сахарном диабете. Поскольку уровень рос являются важным показателем прогрессии заживления ран, конкретной и точной количественной оценки методов являются ценными. Были описаны несколько в vitro анализов для измерения рос в клетках и тканях; Однако они только обеспечивают единый накопительный измерения на сэмпл. Совсем недавно разработка показателей на основе белков и визуализации условия позволили уникальных пространственно-временных анализов. L-012 (C₁₃H₈ClN₄НАО₂) является производной люминол, может использоваться как в естественных условиях , так и в пробирке хемилюминесцентный обнаружения ROS, порожденных оксидазы NAPDH. L-012 излучает сильный сигнал, чем другие флуоресцентных зондов и было показано, быть конфиденциальной и надежной для обнаружения рос. Применимость промежуток времени L-012-способствовали изображений обеспечивает ценную информацию о воспалительных процессах, уменьшая потребность в жертву и общего сокращения числа исследования животных. Здесь мы описываем протокол, используя L-012-содействие в vivo imaging для количественного определения окислительный стресс в модели эксцизионная заживления ран с помощью диабетических мышей с локально неблагополучных Nrf2/Keap1.

Введение

Метаболитов кислорода, порожденных через воспалительных процессов вклад различных сигнальных каскадов, а также деструктивные изменения клеточных компонентов¹. Использование чувствительных и конкретные методы для измерения ROS имеет решающее значение для изучения воспалительных процессов и характеризующих последствия оксидативного стресса. В естественных условиях изображений является ценным из-за его способность обеспечивать динамические пространственные и временные данные в живых тканях. L-012 является синтетическим хемилюминесцентный зонд, который является весьма чувствительной для супероксид анионов и производит более высокие интенсивности света, чем другие флуоресцентных зондов в клетках, тканях и цельной крови^{1,2,3, 4}. он успешно работал в vivo образов в мышиных моделях изучить несколько воспалительных заболеваний, в том числе артриты и колите^5,6. Он еще использоваться в установленных кожный модель ранозаживляющее. Измерение Рось создан столь же важное значение для оценки прогрессирование заживление ран при различных условиях. Чувствительность и неинвазивный характер этого метода делает его перспективным технику для изучения заживления ран через мышиных моделях.

Nrf2 является основной движущей силой реакции антиоксидантной и transcriptional фактор со спецификой для элемента реагирования антиоксидант (являются), общие для регионов промоутер нескольких антиоксидантные ферменты⁸. В отсутствие оксидативного стресса Nrf2 поглощенных в цитоплазме, Keap1, который впоследствии вызывает его ubiquitination и деградации. Дисбаланс путь Nrf2/Keap1 был вовлечен в неуместным редокс гомеостаза и замедленного заживления ран в параметре Увеличение окислительного стресса⁹. Ранее мы показали, что подавление Keap1 стимулирует повышение активности Nrf2 и способствует спасения патологического кожный заживления ран в диабетической раны⁹.

Здесь мы описываем протокол, который использует L-012-помощь биолюминесценции imaging для измерения уровней рос в эксцизионная кожные раны исцеления модель, которая имеет решающее значение для подчеркнув связь между рос и заживление ран. Эта техника демонстрирует реального времени изменения окислительного бремени внутри раны и немедленного периферии. Кроме того этот метод позволяет для быстрой оценки мероприятий и механизмов, что влияет на окислительно-восстановительной обработки. Здесь мы используем модель Keap1 сногсшибательно для восстановления гомеостаза редокс оценить применимость нашей стратегии. Потому что наша техника является неинвазивным и раны спокойно, то же самое животное может использоваться для дальнейшего подтверждающего анализа на основе гистология или ячейки лизатов.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета из Нью-Йорка школы медицины университета. Все мыши размещаются за барьером и всего персонала носить надлежащие средства личной защиты.

1. день 0: Подготовка мышиных модели эксцизионная заживление ран

1. Анестезировать диабетических мышей (Lepr^db/дБ), в возрасте 8-12 недель, с ингаляционных 2% изофлюрановая. Убедитесь, правильно что наркоз каждая мышь с помощью ног колодки щепотку теста. Стерильные глазные смазки применяются для каждого глаза, чтобы предотвратить раздражение от сухости. Исследователи должны следовать их институциональных ветеринарного персонала руководящие принципы, когда обезболивающим животных с помощью изофлюрановая.
2. Взвешивание мышей и запишите вес тела каждой мыши. Подтвердите состояние диабетической животных путем записи уровня глюкозы в крови каждого животного, используя глюкометр.
3. Дезинфекция процедурного рабочей области и наркозное оборудование. Удалять спинной волосы мышей с помощью машинки, последующим применением лосьон для удаления волос обтереть вне избыток волос. Использование алкоголя салфетки для чистки открытые участки кожи, дважды и дайте высохнуть.
4. Создайте две раны полный толщина 10 мм, проходящий через carnosus подкожной, используя стерильные 10 мм биопсии пробойники согласно устоявшейся эксцизионная ранозаживляющее техника^7,8. Используйте стерильные перчатки для всех выживания хирургии. Автоклав всех хирургических инструментов в мешках до хирургии и открытым только в операционном поле.
5. Шина раны с помощью листа 0,5 мм толщиной силикона с 10 мм круглые вырезами и закрепите стентов в место с помощью прервана 4-0 шелковыми швами.
6. После операции, удаление животных из наркоза и место на грелку для облегчения надлежащего восстановления. Следует отметить если во время процедуры, снижается температура тела животного животного могут быть перемещены в грелку ранее свести к минимуму потери тепла тела под наркозом. Мониторинг животных до тех пор, пока они просыпаются и мобильных.
7. После того, как полностью восстановился, возвращение животных в отдельных клетках, содержащих продуктов питания и воды (убедитесь, что еду на пол клетки для послеоперационного обогащения). Обеспечивают измельченной бумаги полотенца как дополнительное раскроя материал для 2 недели. Не дом животных, которые подверглись операции с другими животными, для предотвращения отрицательных взаимодействий и изменения к ране исцеления статус.
8. Для послеоперационного обезболивания придать мышей подкожно с бупренорфина на 0,1 мг/кг массы тела два раза в день, начиная сразу после процедуры, за 3 дня.

2. день 1: Подготовка Keap1 интерферирующей РНК

Примечание: Подготовьте все процедуры внутри биобезопасности кабинета.

1. Подготовьте siRNA разрежения, объединяя 37,5 мкл сокращение сыворотке среды с 12,5 мкл 20 мкм Keap1 интерферирующей РНК (siKeap1) (250 пмоль) в трубу microcentrifuge 1,5 мл на льду.
2. Подготовьте липосом разрежения, объединяя 25 мкл сокращение сыворотке среды с 25 мкл липосом смеси в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
3. 50 мкл siRNA разбавления до 50 мкл прикапывают разрежения липосомы (тома 1:1) и осторожно перемешать.
4. Инкубируйте 20 минут при комнатной температуре.
5. Добавьте 50 мкл метилцеллюлоза гель 2% в воде и аккуратно перемешать, закупорить вверх и вниз.
6. Лечить каждого животного с либо нонсенс СиNS (управления) или СиKeap1 (экспериментальная). Нанести гель на вершину раны. Оберните туловища животного с прозрачной пленки соусом держать гель на месте, сохраняя конечностей, бесплатно для поддержания мобильности.

3. день 3: Подготовка L-012 раствора

Примечание: Подготовьте все реагенты в биобезопасности кабинета.

1. В пробки microcentrifuge 1,5 мл Подготовьте L-012 в 1 X PBS на концентрации 0.5 мг/100 мл.
2. Вручную вихрь пробки microcentrifuge. L-012 полностью не растворяются в PBS, однако оно должно быть равномерно приостановлено в жидкости. Следует отметить не пытайтесь распустить L-012 в воде, чтобы избежать тревожные физиологического электролитного баланса, после инъекции.
3. Передача решения в 1 мл шприц с помощью иглы 27 G.
   Примечание: Не забудьте защитить решения L-012 от света.

4. день 3: В Vivo изображений диабетических ран

1. Анестезировать мышей с ингаляционных 2% изофлюрановая. Исследователи должны следовать их институциональных ветеринарного персонала руководящие принципы, когда обезболивающим животных с помощью изофлюрановая. Убедитесь, правильно что наркоз каждая мышь с помощью ног колодки щепотку теста. Стерильные глазные смазки применяются для каждого глаза, чтобы предотвратить раздражение от сухости.
2. Аккуратно снимите повязку прозрачная пленка от мышей не нарушая раны.
3. Место мыши в тепловизионной камере в их соответствующих приказов. Для поддержания надлежащего уровня₂ O в камере, установите тепловизионные системы приток и₂ уровней камеры O индукции до 1,0 Л/мин.
4. Изображения мышей биолюминесценции и фотографии в базовых перед инъекцией L-012 соединения.
5. Протрите живота с алкоголем салфетки и дайте высохнуть. Выполните внутрибрюшинной инъекции L-012 раствора на 5 мг / 200 г веса тела с помощью иглы 27-го калибра. Например мышь, весом 20 g должен получить 0,5 мг L-012.
6. Сразу же после инъекции L-012, место мышей обратно в их соответствующих местах в тепловизионной камере. Изображения мышей в течение 60 минут, за 1 минуту на 4 минутными интервалами. Определите 10-мм раны как региона, представляющих интерес для определения уровня рос.
7. После операции, удаление животных из наркоза и место на грелку для облегчения надлежащего восстановления. Мониторинг животных до тех пор, пока они просыпаются и мобильных.
8. После того, как полностью восстановился, возвращение животных в отдельных клетках, сохранение той же послеоперационные обогащения среды, ранее описанных в 1.6. Не дом животных, которые подверглись операции с другими животными, для предотвращения отрицательных взаимодействий и изменения к ране исцеления статус.

Результаты

Через три дня после создания двусторонних раны согласно установленным эксцизионная рану модели (рис. 1а), диабетических мышей расположены в тепловизионной камере. Первоначальный фотографию и измерения биолюминесценции взяты перед инъекцией L-012 для уч...

Обсуждение

Общие методы для измерения ROS была ограничена сложных протоколов, требующих извлечения тканей или аналогичным образом инвазивные методы. В последние годы на основе новаторских механизмов обработки изображений, тем самым позволяя пространственно-временных оценок^9,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm)	Sigma Aldrich	665581
3M Tegaderm Transparent Film Dressings	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668027
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencer negative control	Thermofisher Scientific	AM4635
Opti-MEM Reduced Serum	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Methyl-cellulose	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System	PerkinElmer