توجيه نسب إعادة برمجة الماوس الكبار تنتجها الخلايا الليفية لموروث محمر

Summary

هنا نقدم لدينا بروتوكول لإنتاج فعل المباشر المتكفل محمر (المقدمة) من الماوس الليفية الكبار استخدام النسخ التي يحركها عامل النسب إعادة برمجة (DLR).

Abstract

الالتزام خلية محمر والتمايز المضي قدما من خلال تفعيل شبكة النسخي مقيدة بالنسب مدبرة من قبل مجموعة من مصير الخلية تحديد ونضج العوامل. ونحن المبينة سابقا لتحديد الحد الأدنى لعدد من العوامل اللازمة لإرشاد وتطوير خلايا الدم الحمراء باستخدام النسب المباشر إعادة برمجة الخلايا الليفية في محمر المستحث المتكفل/السلائف (المقدمة). لقد أظهرنا أن overexpression من Gata1، Tal1، Lmo2، و جيم-حركة (جتلم) يمكن سرعة تحويل موريني والبشرية الليفية مباشرة إلى المقدمة التي تشبه الخلايا محمر حسن النية من حيث التشكل، النمط الظاهري، والتعبير الجيني. ونحن نعتزم أن المقدمة ستوفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة اللائحة مصير تكون الكريات الحمر والخلية. هنا يصف لنا عملية تدريجية لتحويل ذيل موريني نصيحة الليفية في المقدمة عن طريق النسخ يحركها عامل مباشرة نسب إعادة برمجة (DLR). في هذا المثال، نقوم بإعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران محمر تتبع النسب التي تعبر عن البروتين نيون أصفر (يفب) تحت سيطرة المروج الجينات (ابور) مستقبلات ارثروبويتين، تمكين التصور خلية محمر مصير الحث على إعادة برمجة. وفي أعقاب هذا البروتوكول، يمكن أن تعاد برمجتها الليفية في المقدمة في غضون خمسة إلى ثمانية أيام.

بينما لا يزال يمكن إدخال تحسينات على العملية، ونحن تبين أن جتلم بوساطة إعادة برمجة عملية سريعة ومباشرة، مما أسفر عن الخلايا التي تحتوي على خصائص من حسن النية الخلايا السلف والسلائف محمر.

Introduction

خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) ضرورية في جميع الفقاريات ويشكلون نسبة 84 في المائة من كافة الخلايا من الهيئات البشرية¹. من الجنينية إلى حياة الكبار، صحتنا تعتمد اعتماداً كبيرا على التنظيم الدقيق للتوازن ربك. من المعروف استمرار الإنتاج لكرات الدم الحمراء الناضجة في جميع أنحاء التنمية في مرحلة البلوغ تكون الكريات الحمر. تحديا رئيسيا في تكون الكريات الحمر للبحث هو تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية التي تنسق التنمية ربك والتبديل بين البدائية ونهائية تكون الكريات الحمر. النسب المباشر إعادة برمجة المتكفل محمر فرصة لزيادة فهم التنمية محمر في فيفو.

النسب المباشر برمجة (DLR)، المعروفة أيضا باسم ترانسديفيرينتييشن، هو عملية إعادة برمجة واحدة من نوع الخلية مباشرة إلى آخر، تجاوز pluripotent ومراحل السلف مولتيبوتينت. وقد استخدمت حتى الآن DLR لإنتاج العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك العصبية²و المكونة للدم^3،،من⁴⁵، والكبد⁶ والكلوية⁷، خلايا السلف. لعلماء الأحياء التنموي، أصبح DLR أداة هامة لاستجواب جوانب الالتزام بالنسب والتمايز المحطة الطرفية عمليات^8،9. يمكن تكمل DLR واستبدال جزئيا في فيفو دراسات لفهم آليات لمصير الخلية العوامل المحددة أثناء التطوير. وينص البروتوكول DLR لإعادة برمجة لموروث محمر المبينة في هذه الورقة الحقل طريقة مجانية للدراسات التنموية لتكون الكريات الحمر.

وقد أثبتنا سابقا أن overexpression كوكتيل أربعة معامل، GATA1، TAL1، LMO2، و ج-حركة (جتلم)، كافية لإعادة برمجة الليفية مورين والبشرية على السواء مباشرة إلى فروعه محمر المستحث (المقدمة) ¹⁰-الخلايا محمر "جتلم" برمجة يشابه إلى حد كبير حسن النية محمر البدائية موروث من حيث التعبير مورفولوجيا والنمط الظاهري والجيني¹⁰. وهكذا المقدمة قد حدت من قدرة الانتشار وناضجة للكريات الحمراء المنواه مماثلة لتلك التي تنتجها عابر في الجنين المبكر قبل بداية نهائي تكون الكريات الحمر. عن طريق إجراء تغييرات في شروط إعادة برمجة (مثل الطفرات في إعادة برمجة العوامل أو إضافة عوامل أخرى)، يمكننا أن نفهم كيف يؤدي ذلك إلى تغييرات في التنمية محمر والتمايز. ونحن على سبيل المثال أظهرت أن Klf1 أو Myb بالإضافة إلى كوكتيل جتلم تغيير نمط التعبير جلوبين من الدرجة الأولى الجنينية (البدائية) للكبار أساسا (نهائي). وهذا الاستنتاج يؤكد صلاحية استخدام DLR كأداة لتحديد العوامل التنموية في تكون الكريات الحمر.

هنا، فإننا مخطط عملية توليد المقدمة من ذيل الماوس نصيحة الليفية (الصناديق الاستئمانية). في نتائج تمثيلية، أجرينا إعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران تتبع النسب محمر (ابور-لجنة المساواة العرقية R26-ايفب) الذي يعرب عن البروتين نيون أصفر (ايفب) من محور Rosa26 في جميع الخلايا التي أعرب عن مستقبلات ارثروبويتين، السماح للتصور من السهل الالتزام بنسب محمر. باستخدام هذا الأسلوب، يفب الإيجابية (+ ابور) خلايا موجودة لها في أقرب وقت بعد توصيل خمسة أيام. ويوفر هذا البروتوكول، ولذلك، تقنية سريعة وقوية لتوليد محمر فروعه في المختبر.

Protocol

1-إنشاء وصيانة ذيل الماوس الأساسي تلميح الثقافات تنتجها الخلايا الليفية

1. إعداد أطباق الجيلاتين المغلفة (يوصي طبق 10 سم للذيل واحد) التي تغطي السطح مع الجيلاتين 0.1% وحضانة الأطباق لمدة 20 دقيقة تقريبا في 37 درجة مئوية. نضح الحل الجيلاتين من الطبق والسماح لها الجاف ح 2 على الأقل.
2. Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم. قم بإزالة الذيل مع مقص، قص عند قاعدة الذيل. وضع الذيل في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) بنسبة 2% مصل بقرى الجنين (FBS) حتى جاهزة للاستخدام.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، ذيول ينبغي أن تؤخذ من الفئران حوالي 6 إلى 8 أسابيع من العمر. يمكن أن تؤخذ ذيول من الفئران أقدم من 8 أسابيع عمر، ومع ذلك، كسن الفئران، والقدرة على الانتشار الخلايا الليفية وكفاءة إعادة برمجة انخفاض¹¹.
3. تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة من هذا البروتوكول في غطاء زراعة الأنسجة تحت ظروف معقمة. تعد حلاً التربسين مخفف 0.02% التربسين-يدتا في دببس وإضافة 5 مل في طبق غير مصقول 10 سم.
4. أغسل الذيل، أولاً في الإيثانول 70%، ثم في دببس. في طبق، مكان الذيل مسطح واستخدام الملقط لأنه عقد في المكان. إجراء شق في الذيل على طول محورها الطولي من القاعدة إلى الحافة.
5. فهم الذيل مع زوج واحد من الملقط وأنه عقد عمودياً. استخدام زوج ثاني من الملقط، قبضة الجلد بجوار الشق في القاعدة الذيل وقشر مرة أخرى. القيام بذلك في كلا الجانبين من الشق حتى يمكن خلع الجلد عن طريق سحب أسفل تجاه طرف الذيل.
6. اضغط الذيل مقشرة مع الملقط على الطبق الذي يحتوي على الحل التربسين وقطع الذيل إلى حوالي 1 سم قطع طويلة. مع قطع ذيل في حل التربسين، استخدام مقص لتفتيت القطع إلى أجزاء أصغر. احتضان قطعة الذيل في حل التربسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: يفضل أصغر القطع بغية توفير كل قطعة مساحة سطحية عالية لنسبة الحجم.
7. آرو التربسين استخدام وحدات التخزين 2 متوسطة التوسع (FEX) تنتجها الخلايا الليفية (عالية-الجلوكوز دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 15% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين والأحماض الأمينية الأساسية عدم (نيا) 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين).
8. جمع محتويات الطبق في أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية وريسوسبيند أجزاء الذيل في 10 مل من جديد FEX المتوسطة.
9. نقل أجزاء الذيل في المتوسط إلى طبق المغلفة بالجيلاتين واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO₂ و 4% س₂، إضافة جديدة FEX المتوسطة كل يومين.
   ملاحظة: بعد خمسة إلى سبعة أيام، شظايا الذيل قد تعلق في الجزء السفلي من الطبق ويمكن رؤية الليفية تتحرك بعيداً عنها.
10. متى تم اكتشاف مجموعات من الخلايا الليفية، بلطف يهز الطبق إزاحة قطعة الذيل ونضح على المديين المتوسط وجميع أجزاء العظام ترك الليفية تعلق على اللوحة. إضافة جديد FEX المتوسطة والثقافة الليفية حتى روافد.
11. لضمان لا تلوث الليفية بفروعه المكونة للدم، فصل الخلايا من لوحة باستخدام 1 x التربسين-يدتا لمدة 5 دقائق وجمع الخلايا. المستنفدة للخلايا معربا عن علامات المكونة للدم (CD117، CD5، CD45R (B220)، CD11b، ومكافحة-غرام-1 (Ly-ز 6/ج)، 7-4، ومكررا ثانيا-119) باستخدام نظام فصل مغناطيسي¹⁰.

2-لفي الإنتاج

1. بذور الخلايا التغليف للفيروس في حوالي 2.5 × 10⁴ خلايا/سم² (2.0 × 10⁶ خلايا لطبق 10 سم) طبق تعامل زراعة الأنسجة (بفراغ-الغاز البلازما) والثقافة بين عشية وضحاها في دميم عالية-الجلوكوز مع 10% FBS، 10 مم الصوديوم بيروفات، و 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين CO 37 درجة مئوية و 5%₂.
2. في صباح اليوم التالي، تغيير المتوسطة دميم مع أي إضافات استخدام نصف حجم استخدامها للثقافة بين عشية وضحاها (5 مل لطبق 10 سم). في فترة ما بعد الظهر، تحقق من أن الخلايا هي روافد 70-80% وتبدأ في تعداء.
3. لكل عامل من عوامل إعادة برمجة، Gata1، Tal1، Lmo2، و حركة ج، وإعداد خليط 2:1 ناقل التعبير (بمكس) وناقلات مساعد (التي تحتوي على جينات هفوة وبول). لطبق 10 سم الخلايا الليفية، استخدام 6 ميكروغرام من ناقلات التعبير و 3 ميكروغرام لناقل مساعد في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر في المتوسط دميم.
4. لكل عامل من عوامل إعادة برمجة، إعداد 300 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة (RT) دميم في أنبوب البوليستيرين عقيمة وإضافة 27 ميليلتر من كاشف تعداء التجارية بعناية.
   ملاحظة: ينبغي أن تعرض RT قبل استخدام الكاشف تعداء ويجب إضافة مباشرة في المتوسط كما يمكن أن تجعل خصائص الالكتروستاتيكي المجمع من التمسك بجدار الأنبوبة البلاستيكية.
5. إضافة مزيج بلازميد في أنبوب يحتوي على كاشف تعداء، دوامة بإيجاز واحتضان خليط كاشف-الحمض النووي تعداء لمدة 15 دقيقة في "الرايت بإيجاز" دوامة الخليط وإضافة دروبويسي إلى الخلايا التغليف للفيروس حيث تعداء مزيج الحمض النووي كاشف تنتشر بشكل متساو على الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
6. 24 ساعة بعد تعداء، تغيير المتوسطة دميم مع 20% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100/ستربتوميسين. ح 48 بعد تعداء، جمع المادة طافية وتصفيته من خلال عامل تصفية حقنه حجم المسام 0.22 ميكرومتر.
   ملاحظة: يمكن المجمدة إلى-80 درجة مئوية سوبيرناتانتس الفيروسية وأبقى حتى المطلوبة، على الرغم من أن نقل أكثر كفاءة إذا تم استخدام المادة طافية الفيروسية الطازجة.

3-جتلم توصيل والحصاد iEP

1. أطباق في المتوسط FEX البذور الذيل تلميح الليفية في 1 × 10⁴ خلايا/سم² على 0.1% الجيلاتين المغلفة مسبقاً واحتضانها في 37 درجة مئوية ح 24.
2. وفي اليوم التالي إعداد خليط توصيل كما يلي.
   1. إضافة المجلد 1 من المادة طافية الفيروسية لكل عامل من عوامل إعادة برمجة وتستكمل مع 4 ميكروغرام/مل من كاشف (40 ٪) من الإصابة بالفيروس إلى 6 مجلدات من FEX المتوسطة (60%).
   2. بالنسبة لطبق 10 سم الخلايا الليفية، إضافة 1 مل من كل المادة طافية الفيروسية (4 × الفيروسات = 4 مل) تستكمل مع 4 ميكروغرام/مل من كاشف عدوى الفيروس إلى 6 مل من FEX المتوسطة، أي ما مجموعة 10 مل توصيل خليط.
3. نضح FEX المتوسطة من ثقافة تنتجها الخلايا الليفية واستبداله بخليط توصيل. احتضان توصيل ح 4 في 37 درجة مئوية في ظروف التاكسج (5% CO₂ و 4% س₂).
4. نضح الخليط توصيل واستبداله بالمتوسطة إعادة برمجة جديدة (توسيع خالية من المصل المتوسطة (سفيم)، 100 يو/ملبينيسيلين/ستربتوميسين، 100 نانوغرام/مليلتر مورين "الخلايا الجذعية عامل" (سوف)، 10 نانوغرام/مل مورين انترلوكين-3 (IL3)، 2 يو/مليلتر الإنسان المؤتلف الاريثروبويتين (هريبو)، و 100 نانومتر الديكساميتازون).
5. احتضانها ديسات 8 37 درجة مئوية في ظروف التاكسج، مضيفاً المتوسطة إعادة برمجة جديدة كل يومين. بعد خمسة إلى ثمانية أيام، سوف تسفر إعادة برمجة ناجحة عن مجموعات من الخلايا التي قد فصل من اللوحة.
6. جمع الخلايا أعيدت برمجتها للتحليل، بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً حصادها مباشرة من الطبق. حصاد أونترانسدوسيد الليفية للمقارنة، فصل الخلايا من لوحة باستخدام 1 x التربسين-يدتا وجمع.

النتائج

وهنا يقدم بروتوكول استنساخه لإنتاج المقدمة من الكبار الليفية استخدام النسخ DLR يحركها عامل. نقوم بتقييم الخلية إعادة برمجة استخدام التدفق الخلوي وتشكيل مستعمرة فحوصات والجينات تحليل التعبير. وللمساعدة في تصور التحويل إلى مصير الخلية محمر، أجرينا إعادة برمجة في الخلايا ?...

Discussion

Overexpression كوكتيل أربعة معامل، GATA1، TAL1، LMO2، و ج-حركة (جتلم)، غير كافية لإعادة برمجة الخلايا الليفية مورين والبشرية مباشرة إلى المقدمة¹⁰. الخلايا محمر أعيدت برمجتها تشبه إلى حد كبير حسن النية محمر موروث من حيث مورفولوجي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01	Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30243.01	Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)	Stem Cell Technologies	9650	Reprogramming media
Fetal Bovine Serum HyClone	GE Life Sciences	SH30071.03HI	Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)	Ge Life Sciences	SV30010	Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)	Thermo Fisher	11140050	SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)	GE Life Sciences	SH30042.01	Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)	Peprotech	250-03	Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3	Peprotech	213-13	Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)	Peprotech	100-64	Added to reprogramming media
Dexamethasone	Sigma	50-02-2	Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin	Sigma	9000-70-8	Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride	Sigma	3/9/3513	Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Ge Life Sciences	SH30850.03	Used for washing steps
Polybrene	Merck	TR-1003-G	Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm	Merck	SLGP033RS	Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe	Becton Dickinson	SKU: 307736	Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish	Corning	430167	Cell culture
6-well plate	Falcon	10799541	Cell culture
Jeweler Forceps #5	Sklar	66-7642	Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors	Sklar	23-1149	Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-224	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells	ATCC	CRL-3215	retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)	Novus Biologicals	NBP2-29540	retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1	Cloned in-lab
pMX-Tal1	Cloned in-lab
pMX-Lmo2	Cloned in-lab
pMX-cMyc	Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software			Cytospin analysis software