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要約

ここで紹介は私達のプロトコルによる生産の赤芽球系前駆細胞 (投資事業組合) 転写因子駆動を用いたマウス アダルト繊維芽細胞からダイレクトリプログラミング系統 (DLR)。

要約

赤芽球系細胞と分化細胞の運命を決定する、要因の成熟のグループによって仕組まれた血統制限の転写ネットワークの活性化を続行します。以前誘導赤芽球前駆細胞/前駆体 (投資事業組合) に線維芽細胞のプログラムし直す直接系統を使用した赤血球の開発を指示するために必要な要因の最小限のセットを定義に着手しました。Gata1、過剰発現を示したTal1、 Lmo2、およびC-myc (GTLM) が急速に変換マウスおよびひと線維芽細胞直接投資事業組合形態の観点から善意の赤芽球系細胞のように表現型、遺伝子発現。組合が赤血球や細胞の運命制御を研究する非常に貴重なツールを提供する予定です。ここで我々 は投資事業組合経由で転写因子駆動直接系統 (DLR) のリプログラミングにマウス尾先端線維芽細胞を変換する段階的なプロセスをについて説明します。この例では赤芽球系細胞の可視化を有効にする、エリスロポエチン受容体遺伝子 (EpoR) プロモーターの制御下の黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を表す赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行う運命誘導リプログラミングに。このプロトコルでは、次は、この線維芽細胞を 5 ~ 8 日以内投資事業組合に書き換えることができます。

改善はプロセスにまだ行うことができます、ことを示すリプログラミング GTLM を介した迅速かつ直接プロセスbona fideのプロパティを持つセルの赤芽球系前駆細胞および前駆細胞を降伏します。

概要

赤い血球 (赤血球) はすべての脊椎動物に欠かせない、人間の体の1のすべてのセルの 84% を占めています。胚は大人の生活に、私たちの健康は RBC の恒常性の厳密な規則に依存です。大人になって開発全体を通して成熟した赤血球の継続的な生産は、赤血球と呼ばれます。赤血球の研究の主要な課題は、RBC 開発とプリミティブと決定的な赤血球間のスイッチの組み合わせによって、マスターのレギュレータを定義することです。直接系統の赤芽球系前駆細胞のリプログラミング赤芽球開発の生体をさらに理解する機会を示します。

直接系統のリプログラミング、分化転換としても知られている (DLR) は、リプログラミング多能性細胞と多能性前駆段階をバイパスして、別に直接 1 つの細胞型のプロセスです。DLR はこれまで神経2、造血3,4、5、肝6ネフローゼ7、前駆細胞など様々 な細胞タイプを生成する使用されています。発達生物学者の DLR の分化系列決定と分化プロセス8,9尋問側面の重要なツールとなっています。DLR を補完して生体内で研究開発中の要因を決定する細胞の運命のメカニズムの理解を部分的に交換できます。このペーパーで説明した赤芽球前駆細胞をリプログラミングの DLR プロトコルは、赤血球の発達的研究の無料メソッド フィールドを提供します。

我々 は以前 4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、誘導の赤芽球系前駆細胞に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すため十分であることを示しています。(投資事業組合)10.、GTLM 書き換え赤芽球系細胞大きく似ているbona fide原始赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子の表現のための10の面で。こうして組合は増殖能力を限定し、有核赤血球無核赤血球造血の発症前に初期胚における一過性作り出されるそれらのように成熟しました。リプログラミングの条件 (例えば、点突然変異の要因やその他の要因の追加をプログラムし直す) に変更して、どのようにこれは赤芽球発生と分化の変化につながる理解できます。たとえば示しました GTLM カクテルKlf1またはMybの添加が主に胚 (プリミティブ) からグロビン表現パターンを変更主に大人に (明確な)。この発見は、赤血球産生の発達的要因を定義するためのツールとして DLR を使用の妥当性を裏付けます。

ここでは、我々 は、マウス尾先端繊維芽細胞 (TTF) から組合を生成するプロセスを概説します。赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った代表的な実績 (EporCre R26- eYFP) すべてのRosa26軌跡から黄色い蛍光蛋白質 (eYFP) を表現するセル赤血球系統へのコミットメントを簡単に表示できるように、エリスロポエチンの受容体を表明しています。このメソッドを使用して、YFP 正 (EpoR +) 細胞が存在、早ければ 5 日伝達後です。このプロトコルは、したがって、赤芽球系前駆細胞の in vitroの世代の迅速かつ信頼性の高い技術を提供しています。

プロトコル

1. 確立及び維持プライマリ マウス尾先端培養線維芽細胞

  1. 0.1% ゼラチンで表面をカバーし、37 ° C で約 20 分の料理をインキュベート (1 尾 10 cm 皿をお勧めします) ゼラチン コーティングの料理を準備します。お皿からゼラチン溶液を吸引、少なくとも 2 時間乾燥するようにし、なさい。
  2. 頚部転位によってマウスを安楽死させます。尾の根元切断ハサミ尾を削除します。ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で尻尾 2% ウシ胎児血清 (FBS) を使用する準備ができるまで入れて下さい。
    注: 最良の結果をツインテール取られるべきマウスから年齢の約 6 〜 8 週間。ツインテールは、マウスの年齢、繊維芽細胞の増殖能力と減少11をリプログラミング効率として 8 週齢、しかしより古いマウスから取ることができます。
  3. 無菌条件下でティッシュ文化フードのこのプロトコルのすべての後続の手順を実行します。0.02% トリプシン-EDTA DPBS の希薄トリプシン溶液を調製し、ノンコート 10 cm 皿に 5 mL を追加します。
  4. 最初 70% エタノール, し、DPBS で尾を洗います。皿尾がフラットに配置し、場所でそれを保持する鉗子を使用します。尾翼をベースからその縦軸に沿って先端に切開を行います。
  5. 1 組の鉗子で尾をつかみ、それを垂直に保持します。鉗子の 2 番目のペアを使用して、尾の基部に切開の横に皮膚をつかんで戻って皮をむきます。尾の先端に向かって下向きに引っ張って、むけて皮膚まで切開の両方の側でこれを行います。
  6. トリプシン溶液を含む料理をピンセットで皮をむいた尾をホールドし、約 1 cm の長さの作品に尻尾をカットします。トリプシン溶液で尻尾部分と小さな断片に作品を断片化するのにはさみを使用します。10 分の 37 ° C でトリプシン溶液でテールピースを孵化させなさい。
    注: より小さい作品は、各部分の容積の比率に高い表面積を提供するために適しています。
  7. 線維芽細胞の拡張 (FEX) 媒体の 2 つの容積を使用してトリプシンを消す (高グルコース ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 15 %fbs、2 mM L グルタミン、非本質的なアミノ酸 (NEAA)、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン)。
  8. 50 mL チューブに 4 ° C で 5 分間 350 × gで遠心する料理の内容全体を収集します。上清を吸引し、新鮮な FEX 中の 10 mL で尾フラグメントを再懸濁します。
  9. ゼラチン コーティングの皿に中尾フラグメントを転送し、37 ° c 5% CO2と 4% O2、追加する新鮮な FEX 媒体ごとに 2 日間で孵化させなさい。
    注: 5 ~ 7 日後お皿の下部に添付している尾断片と線維芽細胞はそれらから遠ざかっていると見なすことができます。
  10. 線維芽細胞のクラスターが取り囲み、尻尾の部分を取り除くし、媒体とプレートに接続されている線維芽細胞を残してすべての骨片を吸引する皿を軽く振る。FEX の新しい媒体を追加し、合流まで、線維芽細胞を培養します。
  11. 造血前駆細胞、線維芽細胞の汚染がないことを確認、5 分の 1 x トリプシン-EDTA を用いた平板から細胞を分離し、細胞を収集します。造血のマーカーを発現する細胞の枯渇 (CD117、CD5、CD45R (B220) CD11b、アンチ-グラム-1 (Ly-6 G/C)、7-4、テル 119 番) 磁気分離システム10を使用します。

2. レトロ ウイルス生産

  1. レトロ包装約 2.5 × 104セル/cm2 (2.0 × 106セル 10 cm の皿のために) (で真空ガス プラズマ) 組織培養処理料理と 10% と高グルコース DMEM で一晩培養細胞を播く FBS、10 mM ナトリウムピルビン酸、および 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン 37 ° C および 5% の CO2。
  2. 次の朝、半分のボリュームが一晩培養に使用 (10 cm 皿 5 mL) を使用して添加物なしで媒体を DMEM に変更します。午後で、セルが 70-80% の合流と、トランスフェクションを開始を確認します。
  3. それぞれのリプログラミング因子Gata1、 Tal1、 Lmo2、 C-myc、発現ベクター (pMX) とヘルパー ベクトル (ギャグと pol 遺伝子を含む) の 2:1 の混合物を準備します。線維芽細胞の 10 cm 皿、発現ベクターの 6 μ g、DMEM 培地に 100 μ L の最終巻でヘルパー ベクトルの 3 μ g を使用します。
  4. リプログラミングする要因、生殖不能のポリスチレン管で部屋の温度 (RT) DMEM の 300 μ L を準備し、慎重に商業トランスフェクション試薬の 27 μ L を追加します。
    注: トランスフェクション試薬使用前に RT にもたらされる必要があり、化合物の帯電はチューブのプラスチック製の壁に固執するそれを作ることができる、媒体に直接追加する必要があります。
  5. トランスフェクション試薬を含むチューブ、簡潔に渦にプラスミド ミックスを追加、インキュベートした簡潔に渦混合物で 15 分のトランスフェクション試薬・ DNA の混合物と滴下レトロ包装のセルにそれを追加して、トランスフェクション試薬・ DNA ミックス文化に均等に広がっているし、37 ° C で一晩インキュベートします。
  6. トランスフェクション後、24 h 20 %dmem 培地に変更 FBS と 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン。トランスフェクション後、48 h は上澄みを収集し、0.22 μ m 孔サイズのシリンジ フィルターを介してフィルターします。
    注: ウイルス上清できます-80 ° c の凍結し、伝達がより効率的な新鮮なウイルス上清を使用する場合、必要になるまでを続けた。

3. GTLM 伝達と iEP の収穫

  1. 種子尾先端 1 × 104セル/cm2で線維芽細胞 0.1% ゼラチン プレコート FEX 中皿し、24 h の 37 ° C で孵化させなさい。
  2. 次の日は、次のとおり伝達の混合物を準備します。
    1. FEX 中 (60%) の 6 巻にレトロ ウイルス感染試薬 (40%) の 4 μ G/ml を添加したそれぞれのリプログラミング因子のウイルス上清の 1 ボリュームを追加します。
    2. 線維芽細胞の 10 cm 皿、各ウイルス上清 1 mL を追加 (4 × ウイルス = 4 mL) 10 mL 伝達混合物の合計を与える 4 μ g/mL レトロ ウイルス感染症、FEX 中 6 mL に試薬を添加しました。
  3. 線維芽細胞培養から FEX 中を吸引し、伝達の混合物と置き換えます。低酸素の条件 (5% CO2および 4% O2) 37 ° C で 4 時間伝達を孵化させなさい。
  4. 伝達の混合物を吸引し、新鮮なリプログラミング媒体に置き換える (拡張の無血清培地 (論文)、100 U/mLPenicillin/ストレプトマイシン、100 ng/mL マウス幹細胞因子 (mSCF)、10 ng/mL マウス インターロイキン-3 (IL3)、2 U/mL 人間組換えエリスロポエチン (hrEPO)、および 100 nM デキサメタゾン)。
  5. 8 過ごしましたリプログラミング培 2 日ごとの追加、低酸素条件で 37 ° C の孵化させなさい。5 から 8 日後成功の書き換えプレートから切断したセルのクラスターが得られます。
  6. 解析プログラムし直された細胞を収集するには、お皿から直接それらを収穫するための上下ピペット優しく。比較のため untransduced 線維芽細胞を収穫、1 x トリプシン-EDTA を用いた平板から細胞を分離し、収集します。

結果

大人の線維芽細胞の転写因子ドリブン DLR を使用してから組合の生産のための再現可能なプロトコルをご紹介します。フローサイトメトリー、コロニー形成の試金、および遺伝子を使用して細胞のリプログラミングを評価する発現解析。赤芽球系細胞の運命への転換の可視化を支援するために赤芽球系の系譜トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った (

ディスカッション

4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、組合10に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すための十分なです。プログラムし直された赤芽球系細胞には、 bona fide赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子発現及びコロニー形成能の面で大きく類似していた。こ?...

開示事項

著者はレポートに利害の対立があります。

謝辞

レトロ ウイルス ライブラリを生成するために使用するプラスミドの多くを提供するクローニングとハーヴェイ Lodish (ホワイト ヘッド研究所)、イブ王とグレゴリー ・ ハイド (ホワイト ヘッド研究所、ケンブリッジ、MA) に感謝します。IEP 生産の説明での役割、Kavitha シヴァとソフィー Singbrant (分子医学、遺伝子治療、ルンド大学)、ヨーラン カールソンと Shamit Soneji (分子血液学の部門、ルンド大学) に感謝します。認め、ジュリアン ・ Pulecio (再生医療センター、バルセロナ医研究公園)、ビオレッタ レーヨン エストラーダ (ロックフェラー大学、ニューヨーク)、カール ・ スタッフ ・感謝も申し上げます (セント ・ ヴィンセント ・医学研究所とセントヴィンセントの病院、メルボルン大学の部門)、スペイン ・ ラヤ (研究や高度な研究、バルセロナのカタロニア語機関) とビジェイ G. Sankaran (ブロード研究所の技術とハーバード、ケンブリッジのマサチューセッツ大学) この作品へ以前の貢献。この作品は、(j. f.); にラグナル協会財団によって支えられました。スウェーデン研究評議会 (に j. f.)。Stiftelsen オルレ Engkvist Byggmästare (に j. f.)。スウェーデン (j. f.); に戦略的研究財団Åke ウヰーベルグ財団 (に j. f.)。(j. f.) に助成金統合マリー キュリー。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM without sodium pyruvateGE Life SciencesSH30022.01Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvateGE Life SciencesSH30243.01Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)Stem Cell Technologies9650Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyCloneGE Life SciencesSH30071.03HIGrowth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)Ge Life SciencesSV30010Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)Thermo Fisher11140050SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)GE Life SciencesSH30042.01Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)Peprotech250-03Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3Peprotech213-13Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)Peprotech100-64Added to reprogramming media
DexamethasoneSigma50-02-2  Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skinSigma9000-70-8 Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochlorideSigma3/9/3513Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Ge Life SciencesSH30850.03Used for washing steps
PolybreneMerckTR-1003-GInfection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection ReagentPromegaE2311Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µmMerckSLGP033RSUsed for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic SyringeBecton DickinsonSKU: 307736Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture DishCorning430167Cell culture
6-well plateFalcon10799541Cell culture
Jeweler Forceps #5Sklar66-7642Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris ScissorsSklar23-1149Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouseMiltenyi Biotec130-090-858For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotec130-091-224For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cellsATCCCRL-3215retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco) Novus BiologicalsNBP2-29540retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1Cloned in-lab
pMX-Tal1Cloned in-lab
pMX-Lmo2Cloned in-lab
pMX-cMycCloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software Cytospin analysis software

参考文献

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142 Gata1 Tal1 Lmo2 C myc

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