리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

요약

생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).

초록

Erythroid 셀 헌신 및 분화 세포 운명 결정 및 성숙 요인의 그룹에 의해 조율 된 혈통 제한 transcriptional 네트워크의 활성화를 통해 진행 됩니다. 우리는 직접 혈통 유도 erythroid 창시자/선구자 (Iep)으로 섬유 아 세포의 프로그래밍을 사용 하 여 적혈구 개발 지시에 필요한 요인의 최소 집합을 정의 하려면 이전 밖으로 설정. 우리 보여 그 overexpression Gata1의 Tal1, Lmo2및 c-Myc (GTLM) 수 변환 murine와 인간의 섬유 아 세포 직접 Iep 유사한 형태학, 측면에서 보 나 fide erythroid 셀을 빠르게 표현 형, 그리고 유전자 발현입니다. 우리는 Iep 적혈구와 세포 운명 조절 연구에 귀중 한 도구를 제공할 것입니다 것입니다. 여기는 Iep 통해 전사 요소 기반 직접 혈통 (DLR) 프로그래밍 murine 꼬리 팁 fibroblasts 변환의 단계적 과정에 설명 합니다. 이 예제에서 erythroid 셀의 시각화 수 있도록 리스로 수용 체 유전자 (EpoR) 발기인의 통제 노란 형광 성 단백질 (YFP)을 나타내는 erythroid 계보 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 프로그래밍에 따라 운명 감 응 작용입니다. 이 프로토콜에 따라 5 ~ 8 일 이내 fibroblasts Iep에 재설정 수 있습니다.

개선 과정에 아직도 할 수 있다, 우리 표시 프로그래밍 GTLM 중재 하는 것이 신속 하 고 직접적인 프로세스는 저조한 진실 fide 의 속성을 가진 셀 erythroid 조상 및 선구자 세포.

서문

적혈구 (Rbc)는 모든 척추 동물에 필수적인 고 인체¹의 모든 셀의 84%. 성인 생활에 배아에서 우리의 건강 높은 RBC 항상성의 정확한 규칙에 따라 달라 집니다. 성인으로 개발에 걸쳐 성숙한 RBCs의 지속적인 생산 적혈구로 알려져 있다. 적혈구 연구의 주요 과제 RBC 개발 및 원시적이 고 확실 한 적혈구 사이 스위치 조정 마스터 레 귤 레이 터를 정의 하는 것입니다. 직접 혈통 erythroid 창시자의 프로그래밍 erythroid 개발 비보를 더욱 이해 하는 기회를 선물 한다.

직접 혈통 프로그래밍 (DLR), transdifferentiation, 일컬어 프로그래밍 한 셀 형식을 직접으로, 만능 multipotent 조상 단계를 우회 하는 프로세스입니다. DLR은 지금까지 신경²조 혈^3,,45, 간장⁶ , 신⁷, 조상 세포를 포함 하 여 수많은 셀 유형을 일으킬 사용 되었습니다. 발달 생물학에 대 한 DLR 혈통 헌신과 터미널 차별화 프로세스^8,9의 질의 측면에 대 한 중요 한 도구가 되고있다. DLR 보완 하 고 vivo에서 연구 개발 하는 동안 요소를 결정 하는 세포 운명의 이해 메커니즘에 대 한 부분적으로 대체할 수 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 erythroid 창시자에 프로그래밍에 대 한 DLR 프로토콜 필드에 게 적혈구의 개발 연구에 대 한 무료 방법의 제공 한다.

우리는 이전 4-팩터 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2, 및 c-MYC (GTLM), erythroid 유도 창시자에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 한지 증명 하고있다 (Iep) ¹⁰. erythroid는 GTLM 재설정 셀 크게 닮은 형태, 표현 형, 그리고 유전자 식¹⁰면에서 보 나 타고 난 기본 erythroid 창시자. 따라서 Iep 확산 수 용량을 제한 하 고 뚜렷이 확실 한 적혈구의 발병 하기 전에 초기 배아에서 생산 된 것과 유사한 nucleated 적혈구 성숙. 재활 조건 (예를 들어, 요소 또는 다른 요소의 추가 프로그래밍에서 점 돌연변이)에서 변경 하 여, 하나는이 erythroid 개발 및 차별화에 변화를 리드 하는 방법을 이해할 수 있다. 우리는 예를 표시 GTLM 칵테일에 Klf1 또는 Myb 의 추가 주로 배아 (기본)에서 globin 식 패턴 변경 주로 성인 (최종). 이 이는 적혈구에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구로 DLR을 사용 하 여 유효성을 뒷받침.

여기, 우리 iEPs를 마우스 꼬리 팁 섬유 아 세포 (TTF)에서 생성 하는 과정을 설명 합니다. 우리의 대표 결과에 우리 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍을 수행 (Epor-Cre R26-eYFP) 세포는 모든 Rosa26 소재 시에서 노란 형광 성 단백질 (eYFP)를 표현 erythroid 계보에 헌신의 쉽게 시각화 수 있도록 리스로 수용 체를 표현 했다. 이 메서드를 사용 하 여 셀 (EpoR +) YFP 긍정적인 존재 하는 변환 후 5 일입니다. 이 프로토콜을 따라서, erythroid 창시자에서 생체 외에서의 세대에 대 한 신속 하 고 강력한 기술을 제공합니다.

프로토콜

1. 설립 및 기본 마우스 꼬리의 유지 보수 팁 섬유 문화

1. 0.1% 젤라틴으로 표면을 커버 하 고 37 ° c.에서 약 20 분 동안 요리를 배양 하 여 젤라틴 코팅 요리 (한 꼬리 10 cm 접시 추천)를 준비 접시에서 젤라틴 솔루션을 발음 하 고 적어도 2 시간 동안 건조 하 있습니다.
2. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사. 꼬리의 기지에서 절단가 위 꼬리를 제거 합니다. 사용할 준비가 될 때까지 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)에서 꼬리를 넣어.
   참고: 최상의 결과 얻으려면 꼬리 취해야 한다 쥐에서 나이의 약 6 ~ 8 주. 그러나 꼬리는 쥐 쥐 나이는 섬유 아 세포의 확산 능력과 감소¹¹프로그래밍의 효율성으로 나이,,의 8 주 이상에서 가져올 수 있습니다.
3. 무 균 조건 하에서 조직 문화 후드에이 프로토콜의 모든 이후 단계를 수행 합니다. 0.02 %DPBS 트립 신-EDTA의 희석된 trypsin 솔루션을 준비 하 고 코팅된 10 cm 접시에 5 mL을 추가.
4. 70% 에탄올, 다음 DPBS 먼저 꼬리를 씻어. 한 접시에는 꼬리를 평면 놓고 집게를 사용 하 여 제자리에. 끝에 기지에서 세로 축 따라 꼬리에 절 개를 확인 합니다.
5. 한 쌍의 집게와 꼬리를 잡고를 수직으로 잡고. 집게의 두 번째 쌍을 사용 하 여, 꼬리의 기지에 절 개 옆에 피부를 다시 껍질. 이렇게 절 개의 양쪽에는 꼬리의 끝을 향해 아래쪽으로 당겨 피부를 벗 수 때까지.
6. 벗 겨 꼬리 집게와 트립 신 솔루션이 포함 된 요리 위에 고 약 1 cm 긴 조각으로 꼬리를 잘라. 트립 신 솔루션에서 꼬리 조각으로 더 작은 조각으로 조각 조각에 위를 사용 합니다. 10 분 동안 37 ° C에서 trypsin 용액에 꼬리 조각 품 어.
   참고: 작은 조각 각 볼륨 비율 높은 표면적을 제공 하기 위해 선호 됩니다.
7. 구와 확장 (FEX) 매체의 2 개를 사용 하 여 트립 신을 끄다 (높은 포도 당 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 15 %FBS, 2 mM L-글루타민, 비 필수 아미노산 (NEAA) 및 100 U/mL 페니실린/스).
8. 50 mL 튜브와 4 ° c.에서 5 분 동안 350 × g 에서 원심 분리기로 접시의 전체 내용을 수집합니다 상쾌한 발음 하 고 신선한 FEX 매체의 10 mL에 꼬리 조각 resuspend.
9. 젤라틴 코팅 접시 중간에 꼬리 조각 전송 및 5% CO₂ 와 4% O₂를 2 일 마다 신선한 FEX 매체 추가에서 37 ° C에서 품 어.
   참고: 5 ~ 7 일 후, 꼬리 조각 연결 된 접시의 바닥에 그리고 그들을 멀어 섬유 아 세포를 볼 수 있습니다.
10. 섬유 아 세포의 송이 발견, 일단 부드럽게 꼬리 조각 꺼내와 발음 매체와 접시에 부착 된 섬유 아 세포를 떠나는 모든 뼈 조각이 접시를 흔들. 새로운 FEX 매체를 추가 하 고 합칠 때까지 섬유 아 세포 문화.
11. 을 보장 하기 위해 조 혈 창시자에 의해 섬유 아 세포의 오염 없이 5 분에 대 한 1 x 트립 신-EDTA를 사용 하 여 접시에서 세포를 분리 하 고 세포를 수집 합니다. 조 혈 마커를 표현 하는 셀에 대 한 고갈 (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, 안티-Gr-1 (Ly-6 G/C), 7-4, 그리고 Ter-119) 자기 분리 시스템¹⁰를 사용 하 여.

2. 레트로 바이러스 생산

1. 약 2.5 × 10⁴ 셀/cm² (2.0 × 10⁶ 셀 10 cm 요리에 대 한) 10%로 높은 포도 당 DMEM에서 하룻밤 문화와 조직 문화-(에 의해 처리 진공 가스 플라즈마) 접시에 retroviral 포장 셀 씨 FBS, 10mm 나트륨 Pyruvate, 고 37 ° C, 5% CO₂100 U/mL 페니실린/스.
2. 다음 아침에 변경 매체 DMEM 절반 볼륨 하룻밤 배양 하는 데 사용 (5 mL 10 cm 요리에 대 한)를 사용 하 여 아무 첨가물. 오후에 확인 세포는 70-80% 합칠은 transfection를 시작 합니다.
3. 각 재활 요소 Gata1, Tal1, Lmo2및 c-Myc, 표정 벡터 (pMX) 및 도우미 벡터 (개 그 및 pol 유전자 포함)의 2:1 혼합물 준비. 섬유 아 세포의 10 cm 접시, 표정 벡터의 6 µ g과 DMEM 매체에서 100 µ L의 최종 볼륨에 도우미 벡터의 3 µ g를 사용 하 여.
4. 각 재활 요소에 대 한 살 균 폴리스 티 렌 튜브에서 실 온 (RT) DMEM의 300 µ L를 준비 하 고 신중 하 게 상업 transfection 시 약의 27 µ L를 추가 합니다.
   참고: transfection 시 약 사용 하기 전에 rt 가져와야 한다 하 고 화합물의 정전기 속성 튜브의 플라스틱 벽에 붙어 그것을 만들 수 있는 매체에 직접 추가 해야 합니다.
5. Transfection 시 약 포함 된 튜브, 짧게 소용돌이에 플라스 미드 혼합을 추가 하 고 실시간 짧게 소용돌이 혼합물에 15 분 동안 transfection 시 DNA 혼합물을 품 어 dropwise retroviral 포장 셀에 추가 되도록 transfection는 시 약-DNA 혼합 문화에 걸쳐 균등 하 게 되 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
6. transfection, 후 24 h 20 %DMEM 매체 변경 FBS 및 100 U/mL 페니실린/스. transfection, 후 48 h는 상쾌한을 수집 하 고 0.22 μ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 필터링.
   참고: 바이러스 supernatants-80 ° c 냉동 고 변환 신선한 바이러스 상쾌한 사용 하는 경우 더 효율적 이지만, 필요할 때까지 보관 될 수 있습니다.

3. GTLM 변환 및 iEP 수확

1. 꼬리 팁 1 × 10⁴ 셀/c m² 에서 fibroblasts에 0.1% 젤라틴 미리 코팅 종자 FEX 매체에서 요리를 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
2. 다음 날는 다음과 같이 변환 혼합물을 준비 하 고.
   1. 6 양의 FEX 매체 (60%)에 각 재활 요소 retroviral 감염 시 약 (40%)의 4 µ g/mL와 보완에 대 한 바이러스 성 상쾌한의 1 볼륨을 추가 합니다.
   2. 섬유 아 세포의 10 cm 요리에 대 한 각 바이러스 상쾌한의 1 mL를 추가 (4 × 바이러스 = 4 mL) 10 mL 변환 혼합물의 총 주는 4 µ g/mL FEX 매체의 6 mL를 retroviral 감염 시 약의 보충.
3. 구와 문화에서 FEX 매체를 발음 하 고 변환 혼합 합니다. Hypoxic 조건 (5% CO₂ 와 4% O₂)에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 변환 품 어.
4. 변환 혼합물을 발음 하 고 신선한 재활 매체 (혈 청 무료 확장 매체 (SFEM), 100 U/mLPenicillin/스, 100 ng/mL murine 줄기 세포 요소 (mSCF), 10 ng/mL murine 인터 루 킨-3 (IL3), 2 U/mL 인간 재조합 리스로 (hrEPO), 그리고 100 nM Dexamethasone).
5. 8 daysat hypoxic 조건, 추가 신선한 재활 매체 2 일 마다에서 37 ° C에 품 어. 5 ~ 8 일 후 성공적인 프로그래밍 하는 것은 접시에서 분리 된 셀 클러스터 얻을 것입니다.
6. 수집 분석에 대 한 재설정된 셀, 부드럽게 플라스틱 아래로 접시에서 직접 그들을 수확. 비교를 위해 untransduced fibroblasts 수확, 1 x 트립 신-EDTA를 사용 하 여 접시에서 세포를 분리 하 고 수집 합니다.

결과

여기 성인 섬유 아 세포 전사 인자 기반 DLR을 사용 하 여에서 Iep의 생산을 위한 재현 가능한 프로토콜 선물이. 우리 셀 프로그래밍 cytometry, 식민지 형성 분석 실험, 및 유전자를 사용 하 여 평가 식 분석. Erythroid 셀 운명에 변환의 시각화에 지원 하기 위해 우리는 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 (Epor-Cre R26-eYFP)는 노란 형광 성 단백?...

토론

4 단계 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 및 c-MYC (GTLM), Iep¹⁰에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 하다. 재설정된 erythroid 세포는 크게 진실 fide erythroid 창시자를 형태, 표현 형, 유전자 발현, 그리고 식민지를 형성 하는 능력을 닮았다. 이 조에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01	Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30243.01	Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)	Stem Cell Technologies	9650	Reprogramming media
Fetal Bovine Serum HyClone	GE Life Sciences	SH30071.03HI	Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)	Ge Life Sciences	SV30010	Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)	Thermo Fisher	11140050	SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)	GE Life Sciences	SH30042.01	Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)	Peprotech	250-03	Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3	Peprotech	213-13	Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)	Peprotech	100-64	Added to reprogramming media
Dexamethasone	Sigma	50-02-2	Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin	Sigma	9000-70-8	Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride	Sigma	3/9/3513	Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Ge Life Sciences	SH30850.03	Used for washing steps
Polybrene	Merck	TR-1003-G	Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm	Merck	SLGP033RS	Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe	Becton Dickinson	SKU: 307736	Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish	Corning	430167	Cell culture
6-well plate	Falcon	10799541	Cell culture
Jeweler Forceps #5	Sklar	66-7642	Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors	Sklar	23-1149	Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-224	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells	ATCC	CRL-3215	retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)	Novus Biologicals	NBP2-29540	retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1	Cloned in-lab
pMX-Tal1	Cloned in-lab
pMX-Lmo2	Cloned in-lab
pMX-cMyc	Cloned in-lab
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