Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Resumen

Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).

Resumen

Diferenciación y compromiso de la célula eritroide proceden a través de la activación de una red transcripcional restringida linaje orquestada por un grupo de destino de la célula determinar y factores de maduración. Nos propusimos previamente para definir el conjunto mínimo de factores necesarios para instruir el desarrollo de glóbulos rojos con linaje directo la reprogramación de fibroblastos en inducido progenitores/los precursores eritroides (iEPs). Hemos demostrado que la sobreexpresión de Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc (GTLM) pueden rápidamente convertir murinas y humanas fibroblastos directamente al iEPs que se asemejan a las células eritroides de bona fide en términos de morfología, fenotipo, y expresión génica. Pretendemos que el iEPs proporcionará una valiosa herramienta para estudiar la regulación sino la eritropoyesis y de la célula. Aquí describimos el proceso gradual de conversión de fibroblastos de ratón cola punta en iEPs mediante transcripción basada en el factor directo linaje reprogramación (DLR). En este ejemplo, realizamos la reprogramación de fibroblastos de ratones de seguimiento del linaje eritroide que expresan la proteína amarilla fluorescente (YFP) bajo el control del promotor del gene (EpoR) receptor eritropoyetina, lo que permite la visualización de células eritroides inducción de destino sobre la reprogramación. Siguiendo este protocolo, pueden ser reprogramados fibroblastos en iEPs dentro de cinco a ocho días.

Mientras que todavía pueden introducirse mejoras al proceso, mostramos que GTLM-mediada reprogramación es un proceso rápido y directo, produciendo células con propiedades de buena fe las células progenitoras y precursoras eritroides.

Introducción

Glóbulos rojos (gr) son esenciales en todos los vertebrados y conforman el 84% de todas las células del cuerpo humano¹. De embrión a la vida adulta, nuestra salud es altamente dependiente de la exacta regulación de la homeostasis de la RBC. La continua producción de glóbulos rojos maduros en todo el desarrollo en la edad adulta se conoce como eritropoyesis. Un desafío importante en la investigación de la eritropoyesis es definir los principales reguladores que orquestan el desarrollo de la RBC y el interruptor entre eritropoyesis primitiva y definitiva. Reprogramación de linaje directo de progenitores eritroides presenta una oportunidad para entiendo eritroides desarrollo in vivo.

Linaje directo reprogramación (DLR), también conocido como transdiferenciación, es el proceso de reprogramación de un tipo de célula directamente a otro, evitando pluripotenciales y progenitoras multipotentes etapas. DLR hasta el momento se ha utilizado para producir numerosos tipos de células incluyendo nervios², hematopoyética^3,4,5, hepática⁶ y nefrótico⁷, las células progenitoras. Para los biólogos del desarrollo, DLR se ha convertido en una herramienta importante para interrogar aspectos de linaje compromiso y procesos de diferenciación terminal^8,9. DLR puede complementar y reemplazar parcialmente en vivo estudios de mecanismos de comprensión del destino celular factores determinantes durante el desarrollo. El protocolo DLR para reprogramación de progenitores eritroides que se describe en este artículo proporciona el campo un método gratuito para estudios del desarrollo de la eritropoyesis.

Previamente hemos demostrado que la sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a progenitores eritroides inducida (iEPs) ¹⁰. las células eritroides GTLM el reprogramado mucho se asemejan a bona fide primitivo eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo y gene expresión¹⁰. Así iEPs tienen una capacidad de proliferación limitada y madurar a eritrocitos nucleados similares a los producidos transitoriamente en el embrión antes del inicio de la eritropoyesis definitiva. Al hacer cambios en las condiciones de reprogramación (p. ej., mutaciones de punto en reprogramación factores o la adición de otros factores), uno puede entender cómo esto conduce a cambios en la diferenciación y desarrollo eritroide. Por ejemplo demostramos que además de Klf1 o Myb al cóctel GTLM cambia el patrón de expresión de la globina de predominantemente embrionario (primitivos) para principalmente adultos (definitivo). Este hallazgo corrobora la validez de la utilización de DLR como una herramienta para la definición de factores de desarrollo en la eritropoyesis.

Aquí, describimos el proceso de generar iEPs de fibroblastos de punta de cola de ratón (TTF). En nuestros resultados representativos, se realizó la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expresan la proteína amarilla fluorescente (eYFP) desde el locus Rosa26 en todas las células que han expresado el receptor de eritropoyetina, lo que permite la fácil visualización del compromiso del linaje eritroide. Usando este método, YFP (EpoR +) las células positivas están presentes tan pronto como cinco días después de la transducción de señales. Este protocolo, por lo tanto, ofrece una técnica rápida y robusta para la generación de progenitores eritroides en vitro.

Protocolo

1. establecimiento y mantenimiento de cola de ratón primaria punta culturas del fibroblasto

1. Preparar platos de cubierta de gelatina (se recomienda un plato de 10 cm para una cola) que cubre la superficie con 0.1% gelatina e incubando los platos para unos 20 min a 37 ° C. Aspire la solución de gelatina del plato y deje que se seque durante al menos 2 h.
2. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Quitar la cola con las tijeras, corte en la base de la cola. Poner la cola en suero salino de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) con 2% de suero bovino fetal (FBS) hasta que esté listo para usar.
   Nota: Para mejores resultados, colas deben ser tomadas de ratones alrededor de 6 a 8 semanas de edad. Pueden tomar colas de ratones mayores de 8 semanas de edad, sin embargo, como la edad de los ratones, la capacidad de proliferación de los fibroblastos y la eficiencia de reprogramación disminución de¹¹.
3. Realizar todos los pasos posteriores de este protocolo en una campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles. Preparar una solución de tripsina diluido de 0.02% tripsina-EDTA en DPBS y añadir 5 mL en un plato de 10 cm sin recubrimiento.
4. Lavar la cola, primero en etanol al 70%, entonces en DPBS. En un plato, colocar la cola plana y usar pinzas para sujetar en su lugar. Hacer una incisión en la cola a lo largo de su eje longitudinal desde la base hasta la punta.
5. Sujete la cola con un par de pinzas y manténgalo verticalmente. Utilizando un segundo par de pinzas, agarre la piel al lado de la incisión en la base de la cola y piel vuelta. Hacerlo en ambos lados de la incisión hasta que la piel se puede pelar apagado tirando hacia abajo hacia la punta de la cola.
6. Sujete la cola pelada con pinzas sobre el plato que contiene la solución de tripsina y cortar la cola en trozos largos de aproximadamente 1 cm. Con las piezas de la cola en la solución de tripsina, use tijeras para fragmentar los pedazos en trozos más pequeños. Incubar las piezas de la cola en la solución de tripsina a 37 ° C durante 10 minutos.
   Nota: Las piezas de los más pequeñas son preferidas para dar a cada pieza un elevada área superficial al cociente del volumen.
7. Saciar la tripsina con 2 volúmenes de medio de expansión (FEX) de fibroblastos (alta glucosa Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con 15% SFB, 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales (AANE) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina).
8. Recoger todo el contenido del plato en un tubo de 50 mL y centrifugar a 350 × g por 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender los fragmentos de la cola en 10 mL de medio fresco de FEX.
9. Fragmentos de la cola en medio de la transferencia a un plato cubierto de gelatina e incubar a 37 ° C en 5% CO₂ y 4% O₂, añadiendo medio fresco de FEX cada 2 días.
   Nota: Después de cinco a siete días, fragmentos de la cola han unido en la parte inferior del plato y se observan fibroblastos alejándose de ellos.
10. Una vez que los racimos de los fibroblastos se han manchado, agite suavemente el plato para desplazar piezas de cola y aspire el medio y todos los fragmentos de hueso dejando los fibroblastos conectados a la placa. Agregar nuevo medio FEX y los fibroblastos de la cultura hasta el confluente.
11. Para asegurar la no contaminación de los fibroblastos de progenitores hematopoyéticos, disociar las células de la placa con tripsina-EDTA de x 1 por 5 minutos y recoger las células. Agotan las células expresan marcadores hematopoyéticos (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 y Ter-119) utilizando un sistema de separación magnética¹⁰.

2. retrovirus producción

1. Semilla células empaquetado retroviral en aproximadamente 2,5 × 10⁴ células/cm² (2,0 × 10⁶ células por un plato de 10 cm) sobre un plato de cultivo de tejidos tratados (por vacío-gas plasma) y la cultura durante la noche en alta glucosa DMEM con 10% FBS, 10 mM sodio Piruvato y 100 U/mL penicilina/estreptomicina a 37 ° C y 5% CO₂.
2. A la mañana siguiente, tomar el medio DMEM sin aditivos con la mitad el volumen utilizado a la cultura durante la noche (5 mL para un plato de 10 cm). En la tarde, comprobar que las células son 70-80% confluente y comienzan la transfección.
3. Para cada factor de reprogramación, Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc, preparar una mezcla 2:1 de la expresión vector (pMX) y ayudante (que contiene los genes gag y pol). Para un plato de 10 cm de los fibroblastos, use 6 μg de vector de la expresión y 3 μg de vector de ayudante en un volumen final de 100 μl de medio DMEM.
4. Para cada factor de reprogramación, preparar 300 μL de temperatura (RT) DMEM en un tubo estéril de poliestireno y con cuidado añadir 27 μl de reactivo de transfección comercial.
   Nota: El reactivo de transfección se debe traer a RT antes de su uso y debe agregarse directamente en el medio como las propiedades electrostáticas del compuesto pueden pegarse a la pared de plástico del tubo.
5. Añadir la mezcla de plásmido en el tubo que contiene el reactivo de transfección, vortex brevemente e incubar la mezcla de ADN de reactivo de transfección durante 15 min a TA. brevemente vórtice la mezcla y añadir gota a gota a las células de empaquetado retroviral que la transfección mezcla de reactivo-DNA se extiende uniformemente sobre la cultura e incubar a 37 ° C durante la noche.
6. 24 h después de la transfección, tomar el medio DMEM con 20% FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. 48 h después de la transfección, recoger el sobrenadante y filtrar con un filtro de jeringa de tamaño de poro de 0,22 μm.
   Nota: Sobrenadante Viral puede ser congelado a-80 ° C y mantenerse hasta que la necesite, aunque transducción es más eficiente si se utiliza fresco sobrenadante viral.

3. GTLM transducción y cosecha de la iEP

1. Semilla de la cola punta de fibroblastos en el 1 × 10⁴ células/cm² en 0.1% gelatina cubierto primero platos en medio FEX e incubar a 37 ° C durante 24 h.
2. Al día siguiente, prepare una mezcla de transducción como sigue.
   1. Agregar 1 volumen de sobrenadante viral para cada factor de reprogramación con 4 μg/mL de reactivo de infección retroviral (40%) a 6 volúmenes de medio FEX (60%).
   2. Para un plato de 10 cm de los fibroblastos, añadir 1 mL de cada sobrenadante viral (virus x 4 = 4 mL) suplementado con 4 μg/mL de reactivo de infección retroviral a 6 mL de medio FEX, dando un total de 10 mL de una mezcla de transducción.
3. Aspire medio FEX de la cultura del fibroblasto y sustituirla por la mezcla de la transducción de señales. Incubar la transducción por 4 h a 37 ° C en condiciones hipóxicas (5% CO₂ y de 4% O₂).
4. Aspirar la mezcla de transducción y reemplazarlo con medio fresco de reprogramación (medio libre de suero expansión (SFEM), 100 U/mLPenicillin/estreptomicina, 100 ng/mL Factor murino de células madre (mSCF), 10 ng/mL murino interleucina-3 (IL3), 2 recombinante humano U/mL Eritropoyetina (hrEPO) y 100 nM dexametasona).
5. Incubar durante estancias 8 37 ° C en condiciones hipóxicas, añadiendo medio fresco reprogramación cada 2 días. Después de cinco a ocho días, reprogramación exitosa dará racimos de células que se han separado de la placa.
6. Para recoger células reprogramadas para el análisis, suavemente pipeta hacia arriba y hacia abajo para recoger directamente en el plato. Para cosechar untransduced fibroblastos para la comparación, disociar las células de la placa utilizando 1 x tripsina-EDTA y recoger.

Resultados

Aquí presentamos un protocolo reproducible para la producción de iEPs de fibroblastos adultos usando transcripción factor-driven DLR. Evaluamos la reprogramación celular mediante citometría de flujo, formando Colonia ensayos y gen análisis de expresión. Para ayudar en la visualización de la conversión a destino de la célula eritroide, realizamos la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expre...

Discusión

La sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a iEPs¹⁰. Las células eritroides reprogramado mucho se asemejó a bona fide eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo, genes y capacidad formadora de colonias. Este hallazgo corrobora el fundamento de la utili...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01	Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30243.01	Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)	Stem Cell Technologies	9650	Reprogramming media
Fetal Bovine Serum HyClone	GE Life Sciences	SH30071.03HI	Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)	Ge Life Sciences	SV30010	Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)	Thermo Fisher	11140050	SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)	GE Life Sciences	SH30042.01	Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)	Peprotech	250-03	Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3	Peprotech	213-13	Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)	Peprotech	100-64	Added to reprogramming media
Dexamethasone	Sigma	50-02-2	Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin	Sigma	9000-70-8	Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride	Sigma	3/9/3513	Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Ge Life Sciences	SH30850.03	Used for washing steps
Polybrene	Merck	TR-1003-G	Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm	Merck	SLGP033RS	Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe	Becton Dickinson	SKU: 307736	Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish	Corning	430167	Cell culture
6-well plate	Falcon	10799541	Cell culture
Jeweler Forceps #5	Sklar	66-7642	Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors	Sklar	23-1149	Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-224	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells	ATCC	CRL-3215	retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)	Novus Biologicals	NBP2-29540	retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1	Cloned in-lab
pMX-Tal1	Cloned in-lab
pMX-Lmo2	Cloned in-lab
pMX-cMyc	Cloned in-lab
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