成人小鼠成纤维细胞对红细胞生成子细胞的直接线重编程

摘要

在这里, 我们提出了我们的协议, 产生诱导红血球祖细胞 (iep) 从小鼠成纤维细胞使用转录因子驱动的直接谱系重新编程 (dlr)。

摘要

红质细胞的承诺和分化是通过激活由一组细胞命运决定和成熟因素协调而设计的限制血统的转录网络进行的。我们之前的目的是定义所需的最小因素集, 以指导红血球发展使用直接的血统重新编程成诱导红细胞出生前体 (iep)。我们表明, gata1、 tal1、 lmo2和c-myc (gtlm) 的过度表达可以迅速将小鼠和人的成纤维细胞直接转化为形态、表型等类似于真正红血球细胞的 iep。和基因表达。我们意愿 iep 将为研究红细胞生成和细胞命运调节提供一个宝贵的工具。在这里, 我们描述了通过转录因子驱动的直接谱系重新编程 (dlr) 将小鼠尾尖成纤维细胞转化为 iep 的逐步过程。在本例中, 我们对红细胞膜细胞进行重新编程, 这些小鼠在促红细胞生成素受体基因 (epor) 启动子的控制下表达黄色荧光蛋白 (yfp), 从而实现红细胞细胞的可视化命运感应后重新编程。按照这一协议, 成纤维细胞可以在五到八天内重新编程到 iep 中。

虽然这个过程仍然可以改进, 但我们表明, gtlm 介导的重新编程是一个快速而直接的过程, 产生具有真正红血球祖细胞和前体细胞特性的细胞。

引言

红血球 (rbc) 在所有脊椎动物中都是必不可少的, 占人体所有细胞¹的84%。从胚胎到成人的生命, 我们的健康高度依赖于 rbc 稳态的精确调节。在整个成年期的整个发育过程中, 正在进行的成熟红细胞生成被称为促红细胞生成。红细胞生成学研究的一个主要挑战是定义主调节器, 协调红细胞的发展和原始和最终红细胞生成之间的转换。红血球祖细胞的直接谱系重编程为进一步了解红血球在体内的发育提供了一个机会。

直接谱系重新编程 (dlr), 也称为转分化, 是将一种细胞类型直接重新编程到另一种细胞类型的过程, 绕过多能和多能祖细胞阶段。到目前为止, 德国航空和航天公司已被用于生产多种细胞类型, 包括神经^{2、造血3、4}、5、肝病⁶和肾病7、祖细胞^.对于发育生物学家来说, dlr 已成为询问血统承诺和终端分化过程^8,9的重要工具。德国航空和航天公司可以补充和部分取代体内研究, 以了解细胞在发育过程中的命运决定因素的机制。本文所述的 dlr 对红血球祖细胞重新编程的协议为红细胞生成的发育研究提供了一种免费的方法。

我们之前已经证明, 过度表达四因素鸡尾酒gta1、 tal1、 lmo2和c-myc (gtlm), 足以将小鼠和人的成纤维细胞直接重新编程为诱导红细胞祖细胞(iep)¹⁰. glm 重新编程的红血球细胞在形态、表型和基因表达方面与真正的原始红血球祖细胞^非常相似。因此, 一旦确定红细胞生成, 一旦形成, 一旦形成, 一旦形成, 一旦成为红细胞, 一旦成熟到有核的红细胞, 就会成熟到细胞核性红血球。通过改变重新编程条件 (例如,重新编程因素中的点突变或添加其他因素), 人们可以了解这如何导致红血球发育和分化的变化。例如, 我们已经表明, 在 gtlm 鸡尾酒中添加klf1或myb会改变全球蛋白表达模式, 从主要是胚胎 (原始) 转变为主要是成体 (最终)。这一发现证实了使用 dlr 作为定义红细胞生成发育因子的工具的有效性。

在这里, 我们概述了从小鼠尾端成纤维细胞 (ttf) 生成 iep 的过程。在我们具有代表性的结果中, 我们对红血球谱系追踪小鼠 (epro-crer26-eyfp ) 的成纤维细胞进行了重新编程, 这些小鼠在所有细胞中表达了来自rosa26位点的黄色荧光蛋白 (eyfp)。表达了促红细胞生成素受体, 使红血球谱系的承诺容易可视化。利用该方法, yfp 阳性 (epor +) 细胞早在转导后五天就存在。因此, 该协议为体外红细胞祖细胞的生成提供了一种快速而稳健的技术。

研究方案

1. 一次小鼠尾尖成纤维细胞瘤培养的建立与维护

1. 准备明胶涂层菜肴 (建议一个尾巴10厘米的菜品), 用0.1% 的明胶覆盖表面, 并在37°c 孵育约20分钟的菜肴。从菜中吸出明胶溶液, 使其干燥至少2小时。
2. 用颈椎脱位对小鼠进行安乐死。用剪刀取下尾巴, 在尾巴的底部剪断。将尾巴放入 dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dbs) 中, 用2% 的胎儿牛血清 (fbs), 直到准备使用。
   注: 为了获得最佳效果, 应在6至8周左右从小鼠身上取尾巴。然而, 随着小鼠年龄的增长, 成纤维细胞的增殖能力和重新编程的效率降低^{了 11只}, 可以从8周以上的小鼠身上提取尾巴。
3. 在无菌条件下, 在组织培养罩中执行本协议的所有后续步骤。在 dpbs 中加入0.02% 的胰蛋白酶-edta 稀释胰蛋白酶溶液, 并在未涂布的10厘米盘中加入5毫升。
4. 洗尾巴, 首先用70% 乙醇, 然后在 dpbs。在盘子里, 把尾巴平放, 用钳子把它固定在原地。沿其从底部到尖端的纵轴在尾部做一个切口。
5. 用一对钳子抓住尾巴, 垂直按住它。使用第二对钳子, 抓住尾巴底部切口旁边的皮肤, 将其剥开。在切口两侧这样做, 直到皮肤可以通过向下向尾巴尖端拉而剥落。
6. 将去皮的尾巴与钳子放在含有胰蛋白酶溶液的盘子上, 并将尾巴切成大约1厘米长的碎片。与在胰蛋白酶溶液中的尾巴块, 使用剪刀将这些碎片分割成更小的碎片。在37°c 时将胰蛋白酶溶液中的尾块孵化10分钟。
   注: 更小的件是首选, 以便为每一块提供一个高表面积与体积的比例。
7. 使用2卷成纤维细胞扩张 (fex) 培养基 (高糖 dulbecco 修饰鹰培养基 (dmem) 与 15% fbs, 2 mm l-谷氨酰胺, 非必要氨基酸 (neaa) 和 100 uml penicilin/strepitmycin) 抑制胰蛋白酶。
8. 在4°c 下, 以350xg 的速度将菜品的全部内容收集到50毫升的管和离心机中, 时间为5分钟。吸收上清液, 并在新鲜的 fex 培养基10毫升中重新悬浮尾片碎片。
9. 将尾矿中的碎片转移到培养基中, 在37°c 的 5% co 2 和 4% o2 中孵育, 每2天添加新鲜的 fex 培养基.
   注: 五到七天后, 菜的底部附着了尾巴碎片, 可以看到成纤维细胞离开它们。
10. 一旦发现成纤维细胞的集群, 轻轻地摇晃盘子, 将尾巴移开, 并抽吸培养基和所有的骨碎片, 使成纤维细胞附着在盘子上。加入新的 fex 培养基, 培养成纤维细胞, 直到融合。
11. 为确保造血祖细胞不会污染成纤维细胞, 使用1x 色氨酸 edta 将细胞与平板分离 5分钟, 并收集细胞。消耗细胞表示造血标记 (cd117, cd5, cd45r (b220), cd11b, 抗 gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, 和 ter-119) 使用磁选系统¹⁰。

2. 逆转录酶病毒生产

1. 种子逆转录酶包装细胞约 2.5x10 4 细胞 2 ( 2.0x10⁶细胞为10厘米的盘子) 上的组织培养处理 (通过真空气体等离子体) 盘和培养一夜在高血糖 dmem 与 10% fbs, 10 mm 钠丙酮酸, 和 100 uml penicilinm·链霉素在37°c 和 5% co2.
2. 第二天早上, 将培养基改为 dmem, 不含添加剂, 使用夜间培养量的一半 (10 毫升, 10 厘米的菜)。下午, 检查细胞是否融合了 7 0%-8 0%, 并开始转染。
3. 对于每个重新编程因子 gata1、 tal1、 lmo2和c-myc,准备表达载体 (pmx) 和辅助向量 (包含口子和 pol 基因) 的2:1 混合物。对于10厘米长的成纤维细胞, 在 dmem 培养基中使用6微克的表达载体和3微克的辅助向量, 最终体积为100μl。
4. 对于每个重编程因子, 在无菌聚苯乙烯管中制备300μl 室温 (rt) dmem, 并小心添加27μl 的商用转染试剂。
   注: 转染试剂应在使用前带到 rt, 必须直接添加到介质中, 因为化合物的静电特性可以使其粘附在管的塑料壁上。
5. 将质粒混合入经转染反应管中, 简要旋涡, 并在 rt 孵育转染试剂-dna 混合物 15分钟. 将混合物短暂旋涡, 滴入逆转录病毒包装细胞, 使转染反应-dna 混合均匀地分布在培养基上, 并在37°c 下孵育一夜。
6. 转染后 24小时, 用 20% fbs 和 100 uml penicilinm·链霉素将培养基改为 dmem。转染48小时后, 收集上清液, 并通过0.22μm 孔大小的注射器过滤器进行过滤。
   注: 病毒上清液可以冷冻到-80°c, 并保持到必要的, 虽然转导是更有效的, 如果使用新鲜的病毒上清液。

3. gtlm 转导和 iep 收获

1. 在 fex 培养基中的0.1% 明胶预涂盘上, 将尾端成纤维细胞种子为 1x10 4 cells/cm 2, 在37°c 孵育24小时。
2. 第二天, 准备一个转导混合物, 如下所示。
   1. 在每个重编程因子中添加1体积的病毒上清液, 辅以4μgl 的抗逆转录病毒感染试剂 (40%) 至 fex 培养基 (60%) 的6卷。
   2. 对于10厘米的成纤维细胞, 加入1毫升的每个病毒上清液 (4x 病毒 = 4 毫升) 补充4μgl 的抗逆转录病毒感染试剂到 fex 培养基的6毫升, 共提供10毫升的转导混合物。
3. 从成纤维细胞培养中吸收 fex 培养基, 并将其替换为转导混合物。在缺氧条件下 (5% co2 和 4% o2), 在37°c 时培养转导 4小时 .
4. 吸吸转转转转, 并将其替换为新鲜的重新编程介质 (无血清膨胀介质 (sfem), 100 u/umlpenicilin/streptomycin, 100 ngml 小鼠干细胞因子 (mscf), 10 ngml 小鼠白细胞介素-3 (il3), 2 u/ml 人重组剂促红细胞生成素 (hrepo) 和 100 nm 地塞米松)。
5. 在缺氧条件下培养 8天, 37°c, 每2天添加新鲜的重新编程介质。5到8天后, 成功的重新编程将产生脱离板块的细胞集群。
6. 为了收集重新编程的细胞进行分析, 轻轻地上下移液器直接从盘子里收获。为了采集未转化的成纤维细胞进行比较, 使用1x 色氨酸 edta 将细胞从板中分离并收集。

结果

在这里, 我们提出了一个可重现的协议, 生产 eip 从成人成纤维细胞使用转录因子驱动的 dlr。我们使用流式细胞仪、菌落形成检测和基因表达分析来评估细胞的重新编程。为了帮助可视化向红血球细胞的归宿, 我们对表达黄色荧光蛋白 (eyfp) 的红血球谱系追踪小鼠 (epro-cre r26-eyfp) 的成纤维细胞进行了重新编程. 从rosa26位点在所有细胞表达促红细胞生成素受...

讨论

四因素鸡尾酒gta1、 tal1、 lmo2和c-myc (gtlm)的过度表达足以将小鼠和人成纤维细胞直接重新编程到 iep¹⁰。重新编程的红血球细胞在形态、表型、基因表达和菌落形成能力方面与真正的红血球祖细胞非常相似。这一发现证实了使用直接重新编程作为定义造血发育因素的工具的理由。为了支持这种方?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01	Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30243.01	Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)	Stem Cell Technologies	9650	Reprogramming media
Fetal Bovine Serum HyClone	GE Life Sciences	SH30071.03HI	Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)	Ge Life Sciences	SV30010	Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)	Thermo Fisher	11140050	SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)	GE Life Sciences	SH30042.01	Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)	Peprotech	250-03	Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3	Peprotech	213-13	Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)	Peprotech	100-64	Added to reprogramming media
Dexamethasone	Sigma	50-02-2	Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin	Sigma	9000-70-8	Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride	Sigma	3/9/3513	Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Ge Life Sciences	SH30850.03	Used for washing steps
Polybrene	Merck	TR-1003-G	Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm	Merck	SLGP033RS	Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe	Becton Dickinson	SKU: 307736	Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish	Corning	430167	Cell culture
6-well plate	Falcon	10799541	Cell culture
Jeweler Forceps #5	Sklar	66-7642	Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors	Sklar	23-1149	Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-224	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells	ATCC	CRL-3215	retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)	Novus Biologicals	NBP2-29540	retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1	Cloned in-lab
pMX-Tal1	Cloned in-lab
pMX-Lmo2	Cloned in-lab
pMX-cMyc	Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software			Cytospin analysis software