Прямые, Lineage перепрограммирование взрослых мыши фибробластов в эритроидные предшественники

Резюме

Здесь мы представляем наши протокол для производства индуцированной эритроидные предшественники (ПРП) от взрослых фибробласты мыши с помощью транскрипции управляемый фактор прямой линии перепрограммирования (DLR).

Аннотация

Эритроидных клеток приверженность и дифференциации перейти через активацию линии ограничена транскрипционный анализ сети, организованные группы клеток судьбы, определение и созревания факторов. Ранее мы намерены определить минимальный набор факторов, необходимых для инструктажа развития красных кровяных клеток, используя прямой линии перепрограммирования фибробластов в индуцированной эритроидные предшественники/прекурсоров (ПРП). Мы показали что Сверхэкспрессия Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc (GTLM) можно быстро преобразовать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП, которые напоминают bona fide эритроидные клетки с точки зрения морфологии, фенотип, и экспрессии генов. Мы планируем, что ПРП будет предоставлять бесценным инструментом для изучения эритропоэза и клетка судьба регулирования. Здесь мы описываем процесс поэтапного преобразования мышиных хвостовой оконечности фибробластов в ПРП через транскрипционным фактором driven прямой линии перепрограммирования (DLR). В этом примере мы выполняем перепрограммирования в фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные, которые выражают желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) под контролем промотора гена (EpoR) рецепторов эритропоэтина, позволяя визуализации эритроидные клетки Судьба индукции после перепрограммирования. После этого протокола фибробласты могут быть перепрограммированы в ПРП в течение пяти до восьми дней.

В то время как еще можно улучшить процесс, мы показывают, что GTLM-опосредованной перепрограммирования быстрый и прямой процесс, уступая клетки с свойствами bona fide эритроидные клетки предшественники и прекурсоров.

Введение

Красные кровяные клетки (эритроциты) важны для всех позвоночных и составляют 84% от всех клеток тела человека¹. Из эмбриональных к взрослой жизни наше здоровье сильно зависит от точной регуляции гомеостаза РБК. Текущего производства зрелых эритроцитов на протяжении развития в зрелом возрасте известен как эритропоэза. Серьезной проблемой в эритропоэза исследования заключается в определении главных регуляторов, которые оркестровать РБК развития и переключение между примитивными и окончательного эритропоэза. Прямой линии перепрограммирование эритроидные предшественники представляет возможность для более глубокого понимания эритроидные развития в естественных условиях.

Прямой линии перепрограммирования (DLR), также известный как transdifferentiation, является процесс перепрограммирования один тип ячейки непосредственно в другой, минуя плюрипотентных и Multipotent с прародителем этапов. DLR до настоящего времени был использован для создания многочисленных типов клеток, включая нейронные², гемопоэтических^3,4,5, печеночная⁶ и нефротическим⁷, клетки-предшественники. Для развития биологов DLR стал важным инструментом для допрос аспекты приверженность линии и терминала дифференциация процессы^8,9. DLR может дополнять и частично заменить в vivo исследований для понимания механизмов судьбы клетки, определяющих факторов во время разработки. DLR протокол для перепрограммирования эритроидные предшественники, описанных в данном документе предоставляет поле бесплатный метод для развития исследований эритропоэза.

Ранее мы показали, что гиперэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к индуцированных эритроидные предшественники (ПРП) ¹⁰. GTLM-перепрограммирование эритроидных клеток сильно напоминают bona fide примитивных эритроидные предшественники плане морфологии, фенотип и ген выражение¹⁰. Таким образом ПРП имеют ограниченный потенциал распространения и зрелые ядерных эритроцитов аналогичны временно производится в начале эмбриона до начала окончательного эритропоэза. Внеся изменения в перепрограммирования условиях (например, точечные мутации в перепрограммировании факторов или добавление других факторов), можно понять как это приводит к изменениям в развитии эритроидные и дифференциации. Мы например показали, что добавление Klf1 или Myb на GTLM коктейль изменяет Глобин выражения от преимущественно эмбриональных (примитив) в основном взрослых (окончательный). Этот вывод подтверждают обоснованность использования DLR в качестве инструмента для определения развития факторов в эритропоэза.

Здесь мы приводим процесс генерации ПРП от мыши хвостовой оконечности фибробластов (TTF). В результаты нашего представителя, мы провели перепрограммирования на фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные (Epor- Cre R26- eYFP) который Экспресс желтый флуоресцентный белок (eYFP) от Rosa26 Локус во всех клетках, выразили рецепторов эритропоэтина, позволяя легко визуализации приверженность линии эритроидные. С помощью этого метода, рекламы ЯФП позитивные (EpoR +) клетки присутствуют пять дней после передачи в кратчайшие сроки. Этот протокол, таким образом, предлагает быстрый и надежный метод для генерации эритроидные предшественники в пробирке.

протокол

1. Создание и поддержание хвост мыши Совет культуры фибробластов

1. Готовить блюда желатин покрытием (рекомендуем 10 см блюдо для одного хвоста), покрывая поверхность с 0,1% желатина и инкубации блюда для примерно 20 минут при 37 ° C. Аспирационная раствор желатина из блюдо и дайте ему высохнуть в течение не менее 2 ч.
2. Усыпить мышей от шейки матки дислокации. Удалите хвост с ножницами, резка у основания хвоста. Положите хвост в Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) с 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) до готовой к использованию.
   Примечание: Для достижения наилучших результатов, хвосты следует от мышей возрасте около 6-8 недель. Хвосты могут быть взяты из мышей, старше 8-недельного возраста, однако, как возраст мышей, возможность распространения фибробластов и эффективности перепрограммирования уменьшение¹¹.
3. Выполните все последующие действия настоящего Протокола в культуре ткани капюшоном в стерильных условиях. Приготовляют раствор трипсина разреженных 0,02% трипсина-ЭДТА в DPBS и добавьте 5 мл в блюдо без покрытия 10 см.
4. Вымойте хвост, сначала в 70% этанола, а затем в DPBS. В блюдо хвост плоский и использовать пинцет, чтобы удерживать его на месте. Сделайте надрез на хвост вдоль его продольной оси от основания до кончика.
5. Возьмите хвост с одной парой щипцов и держать его вертикально. Используя вторую пару щипцов, сцепление кожи рядом с разрез у основания хвоста и чистить его обратно. Сделать это в обе стороны разреза до тех пор, пока кожа может быть снимают, потянув вниз к кончик хвоста.
6. Держите очищенные хвост пинцетом над блюдо, содержащих раствор трипсина и отрезать хвост кусочками примерно 1 см длиной. С хвоста штук в раствор трипсина используйте ножницы, чтобы фрагмент частей на более мелкие куски. Инкубируйте хвост кусочки в раствор трипсина при 37 ° C за 10 мин.
   Примечание: Чем меньше штук предпочтительны обеспечить каждый кусок высокое отношение площади поверхности к тома.
7. Утолить трипсина, используя 2 тома фибробластов расширения (ФЕКС) среды (высокий глюкозы Дульбекко изменения Eagle среднего (среде DMEM) с 15% FBS, 2 мм L-глютамином, Non-essential аминокислоты (NEAA) и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина).
8. Собрать все содержимое блюдо в 50 мл трубки и центрифуги на 350 × g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте хвост фрагментов в 10 мл свежего ФЕКС среды.
9. Передать желатин покрытием блюдо хвост фрагментов в средних и инкубировать при 37 ° C в 5% CO₂ и 4% O₂, добавляя свежий ФЕКС среднего каждые 2 дня.
   Примечание: После пяти до семи дней, хвост фрагменты придают в нижней части блюда и может рассматриваться фибробластов, удаляясь от них.
10. После того, как заметили кластеры фибробластов, осторожно встряхните блюдо, чтобы выбить хвост кусочки и аспирационная средне- и все фрагменты костей, оставляя фибробластов, прикреплены к плите. Добавить новое средство ФЕКС и культуре фибробластов до притока.
11. Чтобы не загрязнение фибробластов, кроветворные прародителями, отделить клетки от пластины с помощью 1 x трипсина ЭДТА на 5 минут и собирать клетки. Разрушающим клетки, выражая гемопоэтических маркеры (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, анти-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 и тер-119) с помощью системы магнитной сепарации¹⁰.

2. ретровируса производство

1. Семя ретровирусной упаковка клетки на приблизительно 2,5 × 10⁴ клетки/см² (2.0 × 10⁶ клеток для 10 см блюдо) на культуре ткани лечили (вакуум газовой плазмы) блюдо и культуры на ночь в среде DMEM высокой глюкозы с 10% FBS, 10 мм натрия Пируват и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина при 37 ° C и 5% CO₂.
2. На следующее утро измените среде DMEM без добавок, используя половину объема используется для культуры на ночь (5 мл на 10 см блюдо). В послеобеденное время проверьте, что клетки 70-80% притока и начинают transfection.
3. Для каждого перепрограммирования фактор Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc, приготовить смесь 2:1 выражение вектор (pMX) и вспомогательные вектора (содержащие гены кляп и ГСМ). Для 10 см блюдо фибробластов используйте 6 мкг вектора выражения и 3 мкг, вспомогательные вектора в окончательном объеме 100 мкл в среде DMEM.
4. Для каждого перепрограммирования фактора подготовить 300 мкл комнатной температуры (RT) DMEM в стерильную пробирку полистирола и тщательно 27 мкл Реагента коммерческих transfection.
   Примечание: Трансфекции реагент должны быть доведены до RT перед использованием и должны быть добавлены непосредственно в среду, как электростатические свойства соединения можно сделать его придерживаться стенку пластиковой трубки.
5. Добавить смесь плазмида в трансфекции реагент содержащих трубу, вихревой кратко и инкубировать трансфекции реагент ДНК смесь 15 мин на RT. кратко вихревой смесь и добавить его каплям ретровирусной упаковка клетки так, что Трансфекция Реагент ДНК смесь равномерно распределяется по культуре и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
6. 24 ч после трансфекции, изменить среде DMEM с 20% FBS и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. 48 ч после трансфекции, собирать супернатант и процеживают через фильтр шприц размер пор 0,22 мкм.
   Примечание: Вирусный supernatants могут быть заморожены до-80 ° C и держали до тех пор, пока требуется, хотя трансдукции является более эффективным, если используется свежих вирусных супернатант.

3. GTLM трансдукция и iEP урожай

1. Семян, хвост отзыв фибробластов в 1 × 10⁴ клетки/см² на 0.1% желатина предварительно покрытием Посуда в среде ФЕКС и инкубировать при 37 ° C в течение 24 ч.
2. Следующий день трансдукции смесь готовят следующим образом.
   1. Добавьте 1 объем вирусных супернатант для каждого перепрограммирования фактора, дополнена 4 мкг/мл реагента ретровирусной инфекции (40%) 6 томов ФЕКС среды (60%).
   2. Для 10 см блюдо фибробластов, добавляют 1 мл каждого вирусный супернатант (4 × вирусов = 4 мл) дополнены 4 мкг/мл реагента ретровирусной инфекции до 6 мл среды ФЕКС, давая в общей сложности 10 мл смеси трансдукции.
3. Аспирационная ФЕКС среднего от культуры фибробластов и заменить его смесью трансдукции. Инкубируйте трансдукции за 4 ч при 37 ° C в гипоксических условиях (5% CO₂ и 4% O₂).
4. Аспирационная трансдукции смесь и заменить его на свежий перепрограммирования среднего (Serum-free расширение среднего (SFEM), 100 U/mLPenicillin/стрептомицина, 100 нг/мл мышиных стволовых клеток фактора (mSCF), 10 нг/мл мышиных интерлейкина-3 (уровня IL3), 2 человеческого рекомбинантного ед/мл Эритропоэтин (hrEPO) и 100 Нм дексаметазон).
5. Инкубируйте 8 daysat 37 ° C в гипоксических условиях, добавляя свежий перепрограммирования среднего каждые 2 дня. После пяти до восьми дней успешного перепрограммирования даст кластеры клеток, которые отсоединены от пластины.
6. Чтобы собрать перепрограммировать клетки для анализа, мягко вверх и вниз Пипетка собирать их непосредственно из блюдо. Урожай untransduced фибробласты для сравнения, отделить клетки от пластины с помощью 1 x трипсина ЭДТА и собирать.

Результаты

Здесь мы представляем воспроизводимый протокол для производства ПРП от взрослых фибробластов, с помощью транскрипции фактор driven DLR. Мы оцениваем перепрограммирования клетки, с помощью проточной цитометрии, образуя колонии анализов и гена анализ выражения. Чтобы помо...

Обсуждение

Сверхэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП¹⁰. Перепрограммировать эритроидных клеток сильно напомина?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01	Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30243.01	Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)	Stem Cell Technologies	9650	Reprogramming media
Fetal Bovine Serum HyClone	GE Life Sciences	SH30071.03HI	Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)	Ge Life Sciences	SV30010	Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)	Thermo Fisher	11140050	SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)	GE Life Sciences	SH30042.01	Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)	Peprotech	250-03	Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3	Peprotech	213-13	Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)	Peprotech	100-64	Added to reprogramming media
Dexamethasone	Sigma	50-02-2	Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin	Sigma	9000-70-8	Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride	Sigma	3/9/3513	Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Ge Life Sciences	SH30850.03	Used for washing steps
Polybrene	Merck	TR-1003-G	Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm	Merck	SLGP033RS	Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe	Becton Dickinson	SKU: 307736	Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish	Corning	430167	Cell culture
6-well plate	Falcon	10799541	Cell culture
Jeweler Forceps #5	Sklar	66-7642	Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors	Sklar	23-1149	Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-224	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells	ATCC	CRL-3215	retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)	Novus Biologicals	NBP2-29540	retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1	Cloned in-lab
pMX-Tal1	Cloned in-lab
pMX-Lmo2	Cloned in-lab
pMX-cMyc	Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software			Cytospin analysis software