Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Zusammenfassung

Erythroiden Zelle Engagement und Differenzierung fahren Sie durch Aktivierung eines Linie beschränkt transkriptionelle Netzwerks orchestriert von einer Gruppe von Zellen Schicksal bestimmen und Reifung Faktoren. Wir wollten früher minimalen Voraussetzungen für die Instruktion der roten Blutkörperchen Entwicklung mit direkten Abstammung Reprogrammierung von Fibroblasten in induzierte erythroiden Vorläuferzellen/Vorstufen (iEPs) definieren. Wir haben gezeigt, dass Überexpression des Gata1, Tal1, Lmo2und c-Myc (GTLM) können schnell konvertieren murinen und menschlichen Fibroblasten direkt zu iEPs, die Bona Fide erythroiden Zellen im Hinblick auf Morphologie, ähneln Phänotyp, und Genexpression. Wir beabsichtigen, dass iEPs ein wertvolles Instrument zur Regulierung der Erythropoese und Zelle Schicksal zu studieren liefern. Hier beschreiben wir den schrittweisen Prozess der Umwandlung murinen Schweif Tipp Fibroblasten in iEPs über Transkription Faktor-driven direkten Abstammung Neuprogrammierung (DLR). In diesem Beispiel führen wir die Umprogrammierung in Fibroblasten von erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse, die das gelbe fluoreszierende Protein (YFP) unter der Kontrolle der Erythropoietin-Rezeptor gen (EpoR) Promotor, ermöglicht die Visualisierung der erythroiden Zelle ausdrücken Schicksal Induktion bei der Umprogrammierung. Nach diesem Protokoll können innerhalb von fünf bis acht Tagen Fibroblasten in iEPs umprogrammiert werden.

Während noch der Prozess verbessert werden kann, zeigen wir, dass Umprogrammierung GTLM vermittelt einen schnellen und direkten Prozess nachgeben Zellen mit Eigenschaften der Bona Fide erythroiden Vorläuferzellen und Vorläufer Zellen.

Einleitung

Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) sind unverzichtbar bei allen Wirbeltieren und 84 % aller Zellen des menschlichen Körpers¹ausmachen. Aus embryonalen ins Erwachsenenleben hängt unsere Gesundheit stark genaue Regelung der RBC Homöostase. Die laufende Produktion der Reifen Erythrozyten während der gesamten Entwicklung bis ins Erwachsenenalter wird als Erythropoese bezeichnet. Eine große Herausforderung in der Erythropoese Forschung ist die master Regler definieren, die RBC-Entwicklung und der Wechsel zwischen primitiven und endgültige Erythropoese zu orchestrieren. Direkte Linie Umprogrammierung der erythroiden Vorläuferzellen bietet die Möglichkeit, weitere erythroiden Entwicklung in Vivozu verstehen.

Direkte Linie Neuprogrammierung (DLR), auch bekannt als Transdifferenzierung, ist der Prozess der Umprogrammierung ein Zelltyp direkt ineinander pluripotenten und multipotenten Vorläuferzellen Phasen umgehen. DLR wurde bisher zur zahlreichen Zelltypen, einschließlich neural², hämatopoetischen^3,4,5, hepatische⁶ und nephrotisches⁷, Vorläuferzellen zu produzieren. Für Entwicklungs Biologen geworden DLR ein wichtiges Instrument zur abfragenden Aspekte der Linie Engagement und terminal Differenzierung Prozesse^8,9. DLR ergänzen und teilweise ersetzen in Vivo Studien für Verständnis Mechanismen der Zelle Schicksal bestimmenden Faktoren bei der Entwicklung. Das DLR-Protokoll für die Umprogrammierung zu erythroiden Vorläuferzellen, die in diesem Dokument beschriebenen bietet Bereich eine kostenlose Methode für Studien der Erythropoese.

Wir haben bereits gezeigt, dass Überexpression eines vier-Faktoren-Cocktails, GATA1, TAL1, LMO2, und c-MYC (GTLM), ausreichend reprogram murine und menschlichen Fibroblasten direkt an induzierte erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) ¹⁰. the GTLM umprogrammiert erythroiden Zellen ähneln stark Bona Fide primitive erythroiden Vorläuferzellen im Hinblick auf Morphologie, Phänotyp und gen Ausdruck¹⁰. So iEPs haben eine begrenzte Verbreitung Kapazität und Reifen zu kernhaltigen Erythrozyten ähnlich vorübergehend im frühen Embryo vor Beginn der endgültigen Erythropoese. Durch Änderungen in der Neuprogrammierung Bedingungen (z. B. Punktmutationen in Umprogrammierung Faktoren oder Zugabe von anderen Faktoren), kann man verstehen, wie dies zu Veränderungen in der erythroiden Entwicklung und Differenzierung führt. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass die Zugabe von Klf1 oder Myb GTLM Cocktail das Globin Expressionsmuster von überwiegend embryonalen (primitiv) verändert, vor allem Erwachsene (definitive). Dieser Befund bestätigt die Gültigkeit der mit DLR als Werkzeug zur Definition Entwicklungsfaktoren im Erythropoese.

Hier beschreiben wir den Prozess iEPs aus Maus Schweif Tipp Fibroblasten (TTF) zu erzeugen. In unseren repräsentativen Ergebnissen führten wir die Umprogrammierung auf Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse (Epor- Cre R26- eYFP) Zellen, die das gelbe fluoreszierende Protein (eYFP) aus den Rosa26 Locus in allen Ausdrücken den Erythropoietin-Rezeptor, ermöglicht einfache Visualisierung des Engagements für die erythroiden Linie ausgedrückt haben. Mit dieser Methode sind bereits fünf Tage nach Transduktion YFP positivere (EpoR +) Zellen vorhanden. Dieses Protokoll bietet daher eine schnelle und robuste Technik für die Generation der erythroiden Vorläuferzellen in Vitro.

Protokoll

1. Aufbau und die Pflege der primäre Maustaste Tail Tip Fibroblast Kulturen

1. Bereiten Sie Gelatine beschichtet Gerichte (empfehlen einen 10 cm Teller für ein Tail) durch Abdecken der Oberfläche mit 0,1 % Gelatine und Inkubation der Gerichte für ca. 20 min bei 37 ° C. Aspirieren Sie die Gelatine-Lösung aus der Schale und mindestens 2 Stunden trocknen lassen.
2. Die Mäuse durch zervikale Dislokation einschläfern. Entfernen Sie die Rute mit einer Schere, Schnitt an der Unterseite der Rute. Setzen Sie die Rute in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS) erst unmittelbar vor Gebrauch.
   Hinweis: Für die besten Ergebnisse sollten Schwänzen Mäuse ca. 6 bis 8 Wochen Alter entnommen werden. Endstücke können Mäuse älter als 8 Wochen alt, aber als die Mäuse-Alter, die Verbreitung der Fibroblasten und die Effizienz der Neuprogrammierung Abnahme¹¹entnommen werden.
3. Führen Sie alle Schritte dieses Protokolls in einer Gewebekultur Kapuze unter sterilen Bedingungen. Bereiten Sie eine verdünnte Trypsin-Lösung von 0,02 % Trypsin-EDTA in DPBS und 5 mL in einer unbeschichteten 10 cm Schüssel.
4. Waschen Sie den Schweif, zuerst in 70 % igem Ethanol, dann in DPBS. Legen Sie in eine Schüssel die Rute flach und verwenden Sie Zange, um ihn zu fixieren. Machen Sie einen Schnitt an der Rute entlang seiner Längsachse von der Basis bis zur Spitze.
5. Fassen Sie die Rute mit ein paar Zangen und senkrecht halten. Mit einer zweiten Zange, greifen Sie die Haut neben der Schnitt an der Unterseite der Rute und ziehen Sie es zurück. Tun Sie dies auf beiden Seiten des Schnittes, bis die Haut durch ziehen nach unten in Richtung der Spitze der Rute abgezogen werden kann.
6. Halten Sie die geschälte Rute mit einer Pinzette über das Gericht mit der Trypsin-Lösung und schneiden Sie die Rute in etwa 1 cm lange Stücke. Mit der Rute in der Trypsin-Lösung mit einer Schere um die Stücke in kleinere Stücke zu fragmentieren. Inkubieren Sie die Heck-Stücke in die Trypsin-Lösung bei 37 ° C für 10 min.
   Hinweis: Je kleiner die Stücke sind bevorzugt, um jedes Stück eine große Oberfläche, Volumen-Verhältnis bieten.
7. Die Trypsin mit 2 Bände von Fibroblasten Erweiterung (FEX) Medium zu stillen (High-Glukose Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) mit 15 % FBS, 2 mM L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin).
8. Gesamten Inhalt der Schale in ein 50 mL-Tube und Zentrifuge bei 350 × g für 5 min bei 4 ° c zu sammeln Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Tail-Fragmente in 10 mL frisches FEX Medium.
9. Tail Fragmente im Medium zu einem Gelatine-beschichtete Gericht übertragen und Inkubation bei 37 ° C in 5 % CO₂ und 4 % O₂, Hinzufügen frischen FEX Medium alle 2 Tage.
   Hinweis: Nach fünf bis sieben Tage, habe Tail Fragmente an der Unterseite der Schale befestigt und Fibroblasten Abkehr von ihnen gesehen werden können.
10. Wenn Cluster von Fibroblasten gesichtet werden, schütteln Sie vorsichtig das Gericht um Heck Stücke zu verdrängen und aspirieren Sie das Medium und die Knochenfragmente verlassen die Fibroblasten, die an der Platte befestigt. Fügen Sie neues FEX Medium und Kultur die Fibroblasten bis zum Zusammenfluss.
11. Um keine Verunreinigung von Fibroblasten von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu gewährleisten, die Zellen von der Platte mit 1 X Trypsin-EDTA für 5 Minuten distanzieren und Zellen zu sammeln. Für Zellen, die mit dem Ausdruck hämatopoetischen Marker zu einem Abbau (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4, und Ter-119) eine magnetische Trennung System¹⁰verwenden.

(2) Retrovirus Produktion

1. Seed retrovirale Verpackungszellen bei etwa 2,5 × 10⁴ Zellen/cm² (2,0 × 10⁶ Zellen für eine 10 cm Teller) auf einer Gewebekultur behandelt (durch Vakuum-Gas Plasma) Gericht und Kultur über Nacht in hoch-Glukose DMEM mit 10 % FBS, 10 mM Natrium Pyruvat und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin bei 37 ° C und 5 % CO₂.
2. Am nächsten Morgen ändern Sie das Medium in DMEM ohne Zusatzstoffe mit halber Lautstärke verwendet, um über Nacht Kultur (5 mL für eine 10 cm Teller). Am Nachmittag zu überprüfen, dass die Zellen 70-80 % Zusammenfluss sind und die Transfektion beginnen.
3. Für jede Neuprogrammierung Faktor bereiten Gata1, Tal1, Lmo2, und c-Myc, eine 2:1-Mischung der Expressionsvektor (pMX) und Helfer Vektor (mit Gene Gag und Pol). Verwenden Sie für eine 10 cm Teller von Fibroblasten 6 µg des Expressionsvektors und 3 µg Helfer Vektor in einem Endvolumen von 100 µL in DMEM Medium.
4. Bereiten Sie für jede Neuprogrammierung Faktor 300 µL der Raumtemperatur (RT) DMEM in ein steriles Röhrchen aus Polystyrol zu und sorgfältig 27 µL kommerzielle Transfection Reagens.
   Hinweis: Die Transfektion Reagenz sollte RT vor Gebrauch gebracht und muss direkt in das Medium hinzugefügt werden, da die elektrostatischen Eigenschaften der Verbindung an den Kunststoff Wand des Rohres zu halten machen können.
5. Das Plasmid durchmischen in die Transfektion Reagenz-haltigen Röhre, Wirbel kurz und brüten Transfection Reagens-DNA-Mischung für 15 min bei RT kurz Wirbel die Mischung und die retroviral Verpackungszellen tropfenweise hinzufügen, um die Transfektion Reagenz-DNA-Mischung gleichmäßig über die Kultur und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
6. 24 h nach Transfektion, ändern Sie das Medium in DMEM mit 20 % FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin. 48 h nach Transfektion, den Überstand zu sammeln und durch einen 0,22 µm Porengröße Spritze Filter filtern.
   Hinweis: Virale Überstände können bis-80 ° C eingefroren und gehalten bis erforderlich, obwohl Transduktion ist effizienter, wenn frische virale überstand verwendet wird.

3. GTLM Transduktion und iEP Ernte

1. Samen der Schweif Tipp Fibroblasten bei 1 × 10⁴ Zellen/cm² auf 0,1 % Gelatine vorbeschichtet Gerichte in FEX Medium und Inkubation bei 37 ° C für 24 h.
2. Am nächsten Tag eine Transduktion Mischung wie folgt zubereiten.
   1. 6 Bände der FEX Medium (60 %) fügen Sie 1 Volumen von viralen überstand für jeden Neuprogrammierung Faktor ergänzt mit 4 µg/mL retroviralen Infektion Reagenz (40 % hinzu).
   2. Für eine 10 cm Teller von Fibroblasten, fügen Sie 1 mL jede virale überstand (4 × Viren = 4 mL) mit 4 µg/mL retroviralen Infektion Reagenz zu 6 mL FEX Medium, was eine Gesamtzahl von 10 mL Transduktion Mischung ergänzt.
3. Aspirieren Sie FEX Medium aus der Fibroblasten-Kultur und ersetzen Sie ihn durch die Transduktion Mischung. Inkubieren Sie die Signalweiterleitung für 4 h bei 37 ° C in hypoxischen Bedingungen (5 % CO₂ und 4 % O₂).
4. Die Transduktion Mischung Aspirieren und ersetzen es durch frisches Neuprogrammierung Medium (Expansion serumfreien Medium (SFEM), 100 U/mLPenicillin/Streptomycin, 100 ng/mL murinen Stem Cell Factor (mSCF), 10 ng/mL murinen Interleukin-3 (IL3), 2 U/mL human rekombinanten Erythropoetin (HrEPO) und 100 nM Dexamethason).
5. 8 Daysat in hypoxischen Bedingungen hinzufügen frischen Neuprogrammierung Medium alle 2 Tage 37 ° C inkubieren. Nach fünf bis acht Tagen erbringt erfolgreiche Reprogrammierung Cluster von Zellen, die getrennt haben aus der Platte.
6. Zum Sammeln von reprogrammierter Zellen für die Analyse sanft pipette rauf und runter um sie direkt aus der Schale zu ernten. Um untransduced Fibroblasten zum Vergleich zu ernten, die Zellen von der Platte mit 1 X Trypsin-EDTA distanzieren und zu sammeln.

Ergebnisse

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Protokoll zur Herstellung von iEPs von Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven DLR. Wir bewerten die Zelle Neuprogrammierung mittels Durchflusszytometrie, koloniebildenden Assays und gen Expressionsanalyse. Um die Visualisierung der Konvertierung erythroiden Zelle Schicksal zu unterstützen, führten wir die Umprogrammierung auf Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse (Epor- Cre R26-...

Diskussion

Überexpression eines vier-Faktoren-Cocktails, GATA1, TAL1, LMO2, und c-MYC (GTLM), ist ausreichend, um murinen und menschlichen Fibroblasten direkt an iEPs¹⁰neu zu programmieren. Die umprogrammierten erythroiden Zellen ähnelte stark Bona Fide erythroiden Vorläuferzellen hinsichtlich Morphologie, Phänotyp, Genexpression und koloniebildenden Fähigkeit. Dieser Befund bestätigt die B...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01	Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30243.01	Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)	Stem Cell Technologies	9650	Reprogramming media
Fetal Bovine Serum HyClone	GE Life Sciences	SH30071.03HI	Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)	Ge Life Sciences	SV30010	Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)	Thermo Fisher	11140050	SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)	GE Life Sciences	SH30042.01	Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)	Peprotech	250-03	Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3	Peprotech	213-13	Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)	Peprotech	100-64	Added to reprogramming media
Dexamethasone	Sigma	50-02-2	Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin	Sigma	9000-70-8	Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride	Sigma	3/9/3513	Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Ge Life Sciences	SH30850.03	Used for washing steps
Polybrene	Merck	TR-1003-G	Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm	Merck	SLGP033RS	Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe	Becton Dickinson	SKU: 307736	Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish	Corning	430167	Cell culture
6-well plate	Falcon	10799541	Cell culture
Jeweler Forceps #5	Sklar	66-7642	Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors	Sklar	23-1149	Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-224	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells	ATCC	CRL-3215	retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)	Novus Biologicals	NBP2-29540	retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1	Cloned in-lab
pMX-Tal1	Cloned in-lab
pMX-Lmo2	Cloned in-lab
pMX-cMyc	Cloned in-lab
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